宋萍 李維杰 周新麗 劉寶林

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海 200093）

人肝癌細(xì)胞Hep?G2的冷凍干燥保存初探

宋萍 李維杰 周新麗 劉寶林

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海 200093）

冷凍干燥是長(zhǎng)期有效保存細(xì)胞的手段之一。本文以肝癌細(xì)胞Hep?G2為研究對(duì)象，選取了不同體積分?jǐn)?shù)的Me2SO、丙三醇及不同質(zhì)量濃度的PVP、復(fù)方保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥保存，篩選出最佳保護(hù)劑配方。此外，將細(xì)胞在不同摩爾濃度的海藻糖溶液中孵育，通過檢測(cè)細(xì)胞回收率、存活率和24 h貼壁率，探究胞內(nèi)海藻糖對(duì)細(xì)胞冷凍干燥的影響。結(jié)果表明：添加40%PVP（w/v）＋10%甘油（v/v） ＋15%FBS（v/v） ＋20%海藻糖（w/v）保護(hù)劑的細(xì)胞，在復(fù)水后回收率、存活率和 24 h貼壁率分別為29.58%、42．18%和18．71%，與對(duì)照組相比三項(xiàng)指標(biāo)均得到有效提高，該種保護(hù)劑的效果最佳；當(dāng)胞外海藻糖摩爾濃度為800 mmol/L時(shí)，凍干效果最好，肝癌細(xì)胞Hep?G2在復(fù)水后回收率、存活率和24 h貼壁率分別為27．81%，66．65%和33．68%，存活率和貼壁率顯著高于其他組。

冷凍干燥；凍干保護(hù)劑；細(xì)胞；存活率

長(zhǎng)期有效的保存細(xì)胞在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域具有重要意義，并一直受到廣泛關(guān)注。目前常用的方法是低溫保存，但該種手段液氮耗費(fèi)多，對(duì)設(shè)備要求高，運(yùn)輸過程還可能因?yàn)檎鹗幎斐杉?xì)胞破損，維護(hù)及保存條件也較為苛刻。且在低溫保存期間，細(xì)胞活力、免疫力等均有不同程度的下降，對(duì)研究樣本有一定的損傷。而細(xì)胞的真空冷凍干燥是先將細(xì)胞進(jìn)行低溫凍結(jié)，再通過降壓直接將冰晶除去，從而達(dá)到干燥細(xì)胞的目的。相比于細(xì)胞的低溫保存，真空冷凍干燥有顯著優(yōu)勢(shì)：去除樣品中90%以上的水分，使樣品可以長(zhǎng)期保存；避免微生物的滋長(zhǎng)；質(zhì)量輕便，大大降低了運(yùn)輸保存的難度；凍干后的樣品形態(tài)外觀基本沒有改變，極大的保存了細(xì)胞原有的活性和特性等。所以，利用凍干的方法保存細(xì)胞也受到了研究者的極大關(guān)注。肝癌細(xì)胞Hep?G2不但可以連續(xù)傳代不斷增殖，而且具有肝細(xì)胞的各種特異性功能以及體細(xì)胞的基本特征，實(shí)現(xiàn)冷凍干燥，對(duì)凍干保護(hù)劑配方選擇以及機(jī)理上的認(rèn)知提供了一定的參考，更有利于今后拓展其他體細(xì)胞的凍干保存。

對(duì)于人體細(xì)胞凍干，目前報(bào)道較多的為人血液細(xì)胞、組織細(xì)胞的凍干。 I．Bakaltcheva等［1］嘗試對(duì)紅細(xì)胞凍干后，血紅蛋白恢復(fù)率高達(dá)95%?？茖W(xué)家在保護(hù)劑的選擇上發(fā)現(xiàn)，海藻糖對(duì)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)有著很好的抗逆保護(hù)作用［2－3］。 G．R．Satpathy 等［4］成功將海藻糖載入到紅細(xì)胞內(nèi)，且凍干后紅細(xì)胞的恢復(fù)率達(dá)到40%。對(duì)于人血小板的研究，早在1956年就開始進(jìn)行嘗試，但效果并不理想［5］。W．F．Wolkers等［6］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，海藻糖可以通過內(nèi)吞作用進(jìn)入到血小板內(nèi)。Zhang Shaozhi等［7］提出超聲波可以強(qiáng)化海藻糖進(jìn)入血小板中，范菊莉等［8］使用超聲波對(duì)凍干血小板做預(yù)處理，達(dá)到了強(qiáng)化海藻糖負(fù)載入血小板中的效果，進(jìn)一步為凍干血小板提供了參考。由于臍帶血中含有大量的造血干細(xì)胞，肖洪海等［9］首次實(shí)現(xiàn)了人臍帶全血和單核細(xì)胞凍干的研究。1953年，Stocker發(fā)現(xiàn)，角膜內(nèi)皮細(xì)胞是維持角膜透明的基礎(chǔ)，成功保存角膜內(nèi)皮細(xì)胞成為了研究熱點(diǎn)。楊宏偉等［10］通過光鏡、電鏡酶組織化學(xué)方法探討了凍干角膜內(nèi)皮細(xì)胞的有效性，推測(cè)該方法有望成為角膜長(zhǎng)期保存的新手段。

在生物樣品凍干的過程中，常常需要添加凍干保護(hù)劑。糖類，尤其是海藻糖，因其自身特殊的結(jié)構(gòu)，可以在凍干過程中有效保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)不受破壞，保持生物膜的完整性而成為生物制品凍干中常用的保護(hù)劑之一［11］。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是一種非滲透凍干保護(hù)劑，因可以提高溶液的黏度，顯著提高溶液的玻璃化程度而被廣泛應(yīng)用［12］；胎牛血清（FBS）中含有大量細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［13］，可以在復(fù)水過程中大大提高細(xì)胞存活率，因此受到研究者們的青睞；甘油作為滲透性保護(hù)劑，可以進(jìn)入胞內(nèi)而提供良好的保護(hù)效果［14－15］，也是近年來凍干保護(hù)劑選擇的熱點(diǎn)；而低體積分?jǐn)?shù)的二甲基亞砜（Me2SO）更是在凍結(jié)過程中對(duì)細(xì)胞起到巨大的保護(hù)作用［16］。

因此，本文以肝癌細(xì)胞Hep?G2為對(duì)象，初步探索肝癌細(xì)胞Hep?G2的真空冷凍干燥，選取了海藻糖、PVP、FBS、甘油及Me2SO作為保護(hù)劑，探討不同種類和不同質(zhì)量濃度或體積濃度的保護(hù)劑效果，尋找合適的凍干保護(hù)劑配比，同時(shí)，將細(xì)胞置于不同摩爾濃度的海藻糖溶液中，以肝癌細(xì)胞復(fù)水后的回收率、存活率及24 h貼壁率為指標(biāo)，探討胞內(nèi)海藻糖對(duì)凍干肝癌細(xì)胞的影響，為今后凍干其他細(xì)胞提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：人肝癌細(xì)胞Hep?G2（購(gòu)于中科院）。

主要試劑：胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）；Dulbecco’s Modified Eagle Medium （DMEM）培養(yǎng)基（GIBCO公司）；二甲基亞砜（Me2SO）（德國(guó)APPLICHEM公司）；臺(tái)盼藍(lán)染色液（2X）（碧云天生物技術(shù)公司）；等滲磷酸鹽緩沖液（PBS，PH 7.4）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、海藻糖、甘油（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、青霉素和鏈霉素（華北制藥）。

1.2 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī)，Advantage 2.0 Benchtop Freeze Dryer（美國(guó)SP Industries公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Countess II FL細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；低溫臺(tái)（BCS196 Biological Cyro?stage）；BX51TRF 顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肝癌細(xì)胞的獲取

從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，吸掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基（10%胎牛血清 ＋1%雙抗 ＋89%DMEM 培養(yǎng)基），每個(gè)皿都加入 2 mL D?Hank′s，清洗2遍，接著用0.5 mL胰酶進(jìn)行消化1～2 min后，當(dāng)在顯微鏡下觀察細(xì)胞呈圓粒狀并較均勻的分布在培養(yǎng)皿中時(shí)，每個(gè)皿加入2 mL DMEM培養(yǎng)基終止消化，并將所有細(xì)胞吸入到同一離心管中，轉(zhuǎn)速為1 00 0 r/min，離心 5 min，倒去上清液。

將肝癌細(xì)胞 Hep?G2用等滲 PBS溶液離心（1 000 r/min，離心 5 min）、洗滌 3 遍，收集肝癌細(xì)胞備用。

1.3.2 凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)分組：保護(hù)劑基礎(chǔ)液均為DMEM，將保護(hù)劑分為12組，根據(jù)保護(hù)劑不同種類又分為5組，第一組序號(hào)為0，是對(duì)照組，保護(hù)劑組成為15%FBS＋20%海藻糖；第二組序號(hào)為1～3，是Me2SO組；第三組序號(hào)為4～8，是PVP組；第四組序號(hào)為9～10，是甘油組；第五組序號(hào)為11，是根據(jù)第1～4大組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選出的配方，為復(fù)方保護(hù)劑組。將備用的肝癌細(xì)胞分裝1 mL到12個(gè)1.5 mL的離心管中，保證每個(gè)樣品中有足夠量的細(xì)胞，離心（1 600 r/min，離心 4 min），去掉上清液，分別加入以下凍干保護(hù)劑，低溫顯微鏡觀察，均以10℃/min從室溫降到－80℃，平衡10 min，再以20℃/min升溫到30℃。

將每組保護(hù)劑按4∶1的比例加入到細(xì)胞中進(jìn)行凍干，最終凍干測(cè)定復(fù)水后肝癌細(xì)胞的回收率、存活率和24 h貼壁率，進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)。

表1 保護(hù)劑分組Tab．1 The group of freeze?drying protectants

1.3.3 肝癌細(xì)胞 Hep?G2 的凍干與復(fù)水

凍干：將細(xì)胞與保護(hù)劑以1∶4的體積比配制成凍干細(xì)胞混合液。取1 mL配好的凍干細(xì)胞混合液加入到容積為5 mL的西林瓶中并計(jì)數(shù)，放入凍干機(jī)中進(jìn)行凍干，每次實(shí)驗(yàn)共設(shè)三組平行。預(yù)凍速率大概為10 K/min，預(yù)凍溫度為－65℃，時(shí)間2 h，保證樣品全部?jī)鼋Y(jié)；接著進(jìn)行一次干燥，樣品溫度保持－45℃，持續(xù)24 h，壓力為5 Pa；二次干燥樣品溫度為20℃，時(shí)間10 h，壓力為5 Pa。凍干完成后，樣品密封保存。

復(fù)水：復(fù)水液的配制將PVP溶于PBS緩沖液中，PVP終質(zhì)量濃度（w/v）為10%。在37℃水浴下，將2 mL復(fù)水液加入到凍干樣品中，輕輕振動(dòng)，直到樣品完全溶解，取樣再對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)［17］。

1.3.4 胞內(nèi)海藻糖的載入、提取與測(cè)定

胞內(nèi)海藻糖的載入：用雙蒸水配制400、600、800、1 000 mmol/L四種不同摩爾濃度的海藻糖溶液。將肝癌細(xì)胞置于四種不同摩爾濃度的海藻糖溶液中，并在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育7 h［4］。經(jīng)孵育之后的肝癌細(xì)胞，于1 200 r/min離心5 min，去除上清液，用等滲的PBS緩沖液洗滌，反復(fù)3次，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，并計(jì)算平均體積。

胞內(nèi)海藻糖的提取：為防止提取液中其他組分的影響，加三倍體積的10%三氯乙酸于細(xì)胞懸浮液中，常溫下抽提細(xì)胞內(nèi)海藻糖3次［18］，收集三次的抽提液，可以獲得較為單一的含海藻糖組分。

胞內(nèi)海藻糖的測(cè)定：采用硫酸?蒽酮法測(cè)定各萃取液中海藻糖質(zhì)量濃度［19］。

1.3.5 負(fù)載海藻糖的細(xì)胞凍干及回收率、存活率和24 h貼壁率檢測(cè)

凍干保護(hù)劑為前期實(shí)驗(yàn)篩選出來的最佳保護(hù)劑：基礎(chǔ)液為 DMEM，組分為 40%PVP（w/v） ＋15%FBS（v/v） ＋20%海藻糖（w/v） ＋10%丙三醇（v/v）。 隨后進(jìn)行凍干。凍干結(jié)束后，在3 7℃水浴下進(jìn)行復(fù)水，再取樣進(jìn)行回收率、存活率及24 h貼壁率的檢測(cè)。

凍干細(xì)胞回收率［20］檢測(cè)：

存活率檢測(cè)［21］：采用臺(tái)酚藍(lán)染色法，取 20 μL 0.4%臺(tái)酚藍(lán)溶液和20 μL復(fù)水后細(xì)胞懸浮液，混勻，

滴加在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在3 min內(nèi)，插入細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)。按以下公式計(jì)算存活率：24 h貼壁率檢測(cè)：復(fù)水后的細(xì)胞，加入2 mL DMEM，于 1 200 r/min，離心 10 min，棄上清液，加 4 mL DMEM接種到培養(yǎng)皿中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h換液后，將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液吸入到離心管中，計(jì)數(shù)未貼壁細(xì)胞。接著用胰酶消化后加2 mL DMEM，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。計(jì)算公式如下：

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

用SPSS Statistics軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護(hù)劑配方的優(yōu)化

2.1.1 Me2SO組細(xì)胞回收率、存活率和24 h貼壁率

對(duì)照組、添加 Me2SO體積分?jǐn)?shù)（v/v）為 5%、10%、15%的保護(hù)劑組細(xì)胞復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率結(jié)果見表2。文中采用Duncan法進(jìn)行多重比較，表格中同列標(biāo)有相同字母的表示相互沒有顯著區(qū)別（P＞0.05），沒有相同字母表示互相有顯著區(qū)別（P＜0.05）。

表2 添加不同體積分?jǐn)?shù)Me2SO保護(hù)劑細(xì)胞凍干復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率Tab．2 Recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate after the recovery of freeze?dried cell with Me2SO

由表2可知，添加Me2SO保護(hù)劑組細(xì)胞凍干的回收率、存活率和24 h貼壁率均與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05），這表明添加體積分?jǐn)?shù)為5% ～15%Me2SO保護(hù)劑對(duì)凍干肝癌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。添加了5% ～15%Me2SO后，回收率并沒有顯著差異，但10%Me2SO和15%Me2SO組的存活率及24 h貼壁率要顯著高于5%Me2SO組。而10%Me2SO和15%Me2SO組的回收率、存活率和24 h貼壁率均無顯著差異（P＞0.05）。 這表明 10%Me2SO和 15%Me2SO組的保護(hù)效果優(yōu)于5%Me2SO組，且兩者保護(hù)效果相近。

2.1.2 PVP組的細(xì)胞回收率、存活率和24 h貼壁率

對(duì)照組、添加 PVP質(zhì)量濃度（w/v）為 20%、30%、40%、50%、60%的保護(hù)劑組細(xì)胞復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率結(jié)果見圖1。

添加不同質(zhì)量濃度PVP保護(hù)劑的肝癌細(xì)胞Hep?G2凍干復(fù)水后，測(cè)定其回收率、存活率和24 h貼壁率（圖1）。由圖1可知，PVP對(duì)肝癌細(xì)胞的凍干過程有明顯的保護(hù)作用，其作用效果隨著質(zhì)量濃度的增大而先增高后降低。當(dāng)PVP質(zhì)量濃度為20%時(shí)，肝癌細(xì)胞回收率、存活率和24 h貼壁率明顯高于對(duì)照組，當(dāng)PVP質(zhì)量濃度增大為40%時(shí)，肝癌細(xì)胞回收率、存活率和24 h貼壁率都達(dá)到了峰值，此后，隨著PVP質(zhì)量濃度增大，回收率、存活率和24 h貼壁率都有著不同程度的下降，表明40%PVP質(zhì)量濃度的保護(hù)劑凍干效果最佳，能產(chǎn)生較好的保護(hù)作用。

圖1 添加不同質(zhì)量濃度PVP保護(hù)劑細(xì)胞凍干復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率Fig．1 Recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate after the recovery of freeze?dried cell with PVP

2.1.3 甘油組的細(xì)胞回收率、存活率和24 h貼壁率

對(duì)照組、添加丙三醇體積分?jǐn)?shù)（v/v）為 10%、20%的保護(hù)劑組細(xì)胞復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率結(jié)果見表3。

表3 添加不同體積分?jǐn)?shù)甘油保護(hù)劑細(xì)胞凍干復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率Tab．3 Recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate after the recovery of freeze?dried cell with glycerol

由表3可知，添加了體積分?jǐn)?shù)為（v/v）10% ～20%甘油的保護(hù)劑與對(duì)照組在回收率、存活率和24 h貼壁率上差異均有顯著性（P＜0.05），表明添加10%～20%甘油的保護(hù)劑對(duì)肝癌細(xì)胞凍干存在積極作用。10%甘油組的細(xì)胞存活率與20%甘油組沒有顯著差異（P＞0.05），但兩者的24 h貼壁率卻有顯著差異（P＜0.05），說明10%甘油組的凍干效果要優(yōu)于20%甘油組。

2.1.4 復(fù)方保護(hù)劑組的細(xì)胞回收率、存活率和24 h貼壁率

由于Me2SO的凍干效果不佳，因此以下結(jié)果均不再進(jìn)行比較。挑選前三組最優(yōu)保護(hù)劑，進(jìn)行復(fù)方保護(hù)劑組實(shí)驗(yàn)，并比較它們的回收率、存活率和24 h貼 壁率。

表4 添加不同保護(hù)劑細(xì)胞凍干復(fù)水后的回收率、存活率和24 h貼壁率Tab．4 Recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate after the recovery of freeze?dried cell with different protectant

由表4可知，添加了保護(hù)劑的細(xì)胞凍干復(fù)水后與對(duì)照組在回收率、存活率和24 h貼壁率上差異均有顯著性（P＜0.05），說明凍干保護(hù)劑的添加對(duì)肝癌細(xì)胞凍干有明顯的保護(hù)作用。10%甘油組在回收率、存活率和24 h貼壁率上都要低于其他兩組（序號(hào)6和序號(hào)11），說明甘油在凍干過程中的保護(hù)效果最差。40%PVP組與復(fù)方保護(hù)劑組的存活率高于復(fù)方保護(hù)劑組，但復(fù)方保護(hù)劑組的貼壁率明顯高于40%PVP組，這表明雖然40%PVP的保護(hù)劑可以大大提高凍干復(fù)水后細(xì)胞的存活率，但多數(shù)細(xì)胞已失去其貼壁能力，而復(fù)方保護(hù)劑能較好維持肝癌細(xì)胞的基本功能。綜上所述，復(fù)方保護(hù)劑在凍干肝癌細(xì)胞過程中保護(hù)效果最好。

2.2 孵育載入肝癌細(xì)胞海藻糖的摩爾濃度

采用硫酸蒽酮法測(cè)定海藻糖摩爾濃度，其中萃取液的質(zhì)量濃度與胞內(nèi)摩爾濃度成正比關(guān)系［22］，因此，萃取液的質(zhì)量濃度也可以反映胞內(nèi)海藻糖摩爾濃度的大小。當(dāng)細(xì)胞放在等滲的海藻糖溶液中時(shí)，胞內(nèi)幾乎沒有負(fù)載海藻糖。所以，該實(shí)驗(yàn)選擇了一系列高滲溶液：400、600、800、1 000 mmol/L 海藻糖溶液作為負(fù)載液。圖2所示為不同摩爾濃度胞外海藻糖對(duì)肝癌細(xì)胞的影響。在37℃條件下，通過孵育的方式，萃取液海藻糖摩爾濃度呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)胞外摩爾濃度在400～600 mmol/L區(qū)間時(shí)，以相對(duì)較快的速率增加對(duì)海藻糖的攝取量，海藻糖摩爾濃度明顯加大；當(dāng)胞外摩爾濃度在600～800 mmol/L范圍時(shí)，萃取液海藻糖摩爾濃度增加趨勢(shì)減緩，此時(shí)可能細(xì)胞吸取的海藻糖摩爾濃度達(dá)到飽和；當(dāng)胞外摩爾濃度為1 000 mmol/L時(shí)，細(xì)胞對(duì)海藻糖的攝取量減小，可能是過高摩爾濃度的胞外環(huán)境提供了水從胞內(nèi)向胞外流動(dòng)的推動(dòng)力，從而形成了細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透梯度，對(duì)細(xì)胞造成了一定的滲透損傷［23］。

圖2 不同摩爾濃度胞外海藻糖對(duì)肝癌細(xì)胞的影響Fig．2 The effect of extracellular trehalose at various molar concentrations on Hepatoma Hep?G2 cells

表5 胞外不同摩爾濃度海藻糖載入肝癌細(xì)胞后凍干的回收率、存活率和24 h貼壁率Tab．5 Recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate after the recovery of freeze?dried cell in extracellular trehalose at various molar concentrations

2.3 凍干肝癌細(xì)胞的回收率、存活率和24 h存活率

將肝癌細(xì)胞放置在不同摩爾濃度海藻糖溶液中，通過熱孵育載入細(xì)胞內(nèi)后進(jìn)行凍干，測(cè)得的回收率、存活率和24 h貼壁率如表5所示。

由表5可知，當(dāng)胞外摩爾濃度為400 mmol/L時(shí)，回收率、存活率和24 h貼壁率均與對(duì)照組無明顯差異，可能由于進(jìn)入細(xì)胞的海藻糖摩爾濃度不足以對(duì)細(xì)胞提供保護(hù)作用［24］。當(dāng)胞外摩爾濃度為600 mmol/L時(shí)，回收率要明顯高于對(duì)照組，但存活率和24 h貼壁率并沒有顯著差異（P＞0.05）。當(dāng)胞外摩爾濃度為800 mmol/L時(shí)，存活率和24 h貼壁率均大大高于其他組（P＜0.05），說明該組具有活性的細(xì)胞明顯多于對(duì)照組。當(dāng)胞外海藻糖摩爾濃度為1 000 mmol/L時(shí)，肝癌細(xì)胞凍干的回收率、存活率和24 h貼壁率差異均有顯著性（P＜0.05），明顯低于其他組。

綜上所述，當(dāng)胞外海藻糖摩爾濃度為400 mmol/L或 600 mmol/L 時(shí)，肝癌細(xì)胞凍干效果與不添加海藻糖組基本無變化；當(dāng)胞外海藻糖摩爾濃度為800 mmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比，凍干效果有顯著差異（P＜0.05），凍干效果最好；當(dāng)胞外摩爾濃度為1 000 mmol/L時(shí)，凍干效果低于對(duì)照組。

3 討論

肝臟是人體代謝的重要器官，但由于人肝臟細(xì)胞在生理?xiàng)l件下獲取困難、個(gè)體差別大、傳代培養(yǎng)不易，而肝癌細(xì)胞Hep?G2培養(yǎng)傳代較為容易，且有正常肝細(xì)胞的很多功能以及體細(xì)胞的基本特征［25］，因此，本研究以肝癌細(xì)胞Hep?G2為模型，探索肝癌細(xì)胞的真空冷凍干燥以及海藻糖對(duì)肝癌細(xì)胞凍干的影響。

保護(hù)劑在生物制品凍干過程中是不可或缺的，二甲基亞砜（Me2SO）為常見的低溫保護(hù)劑，添加Me2SO后凍存，可以降低溶液的冰點(diǎn)，減少胞內(nèi)冰的形成，從而有效地減少了由冰晶帶來的機(jī)械損傷［26］。真空冷凍干燥細(xì)胞前的預(yù)凍過程，為了減小細(xì)胞的冷凍損傷，因此選擇加入一定體積分?jǐn)?shù)的Me2SO作為保護(hù)劑。楊波等［27］在凍存人肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，添加體積分?jǐn)?shù)（v/v）為 10%Me2SO作為保護(hù)劑，貼壁率高達(dá)81.05%。 Han Ying等［28］在研究紅細(xì)胞凍干保存實(shí)驗(yàn)中，將Me2SO、PVP等加入保護(hù)劑配方中，發(fā)現(xiàn)有積極的凍干效果，細(xì)胞和血紅蛋白復(fù)水后的恢復(fù)率達(dá)到80%以上。本研究發(fā)現(xiàn)，加入Me2SO的保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞凍干雖然產(chǎn)生了積極保護(hù)作用，但保護(hù)效果并不理想，這可能是由于Me2SO體積分?jǐn)?shù)過高不利于干燥過程的進(jìn)行。

權(quán)國(guó)波等［29］發(fā)現(xiàn)隨著PVP質(zhì)量濃度的增高，體系的結(jié)晶起始點(diǎn)隨之降低，玻璃化程度增高，有利于整個(gè)體系度過危險(xiǎn)溫區(qū)，從而減少細(xì)胞在凍干過程中受到的機(jī)械損傷。但隨著PVP質(zhì)量濃度的進(jìn)一步升高，游離血紅蛋白質(zhì)量濃度只有0.5 g/L左右，表明過高質(zhì)量濃度的PVP并不利于凍干。本研究中，當(dāng)PVP質(zhì)量濃度達(dá)到40%時(shí)，細(xì)胞的回收率、存活率和24 h貼壁率顯著提高，但當(dāng)PVP質(zhì)量濃度增大為50%時(shí)，細(xì)胞的回收率、存活率和24 h貼壁率均有不同程度的下降，和權(quán)國(guó)波等［29］的結(jié)論一致。這可能是由于對(duì)細(xì)胞造成了較高的滲透壓以及PVP的親水性質(zhì)的影響［30］。

甘油由于可以滲透到細(xì)胞內(nèi)部提供良好的保護(hù)作用，因而一直被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的凍存中，體積分?jǐn)?shù)20%（v/v）的甘油可以在凍存肝癌細(xì)胞中取得較理想的效果［31］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，加入了體積分?jǐn)?shù)（v/v）為10%、20%甘油的保護(hù)劑與可以使細(xì)胞回收率、存活率和24 h貼壁率均顯著提高。其中，體積分?jǐn)?shù)（v/v）為10%甘油的保護(hù)效果較好。

在細(xì)胞凍干過程中，糖類往往與大分子聚合物一起作為保護(hù)劑，為細(xì)胞膜提供優(yōu)良的保護(hù)作用，尤其是海藻糖［32］。 B．Stokich 等［33］在分子層面研究了海藻糖對(duì)肝癌細(xì)胞分子層的影響，當(dāng)海藻糖加入到低溫保護(hù)劑中時(shí)，會(huì)改變冰晶形成特征。Han Ying等［28］配比了質(zhì)量濃度（w/v）為0% ～15%的海藻糖保護(hù)劑，凍干紅細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，血紅蛋白和紅細(xì)胞的恢復(fù)率與對(duì)照組并沒有顯著差異，因此，得出結(jié)論：胞外海藻糖在凍干過程中并沒有起到保護(hù)作用。但是否海藻糖必須進(jìn)入胞內(nèi)才能提供膜的保護(hù)作用，很多學(xué)者對(duì)于胞內(nèi)海藻糖的保護(hù)效果進(jìn)行了研究。T．Chen等［34］利用基因重組成的通道將海藻糖引入胞內(nèi)，使細(xì)胞在復(fù)水后質(zhì)膜的恢復(fù)率高達(dá)90%。何暉等［35］通過孵育的方法將海藻糖載入胞內(nèi)，細(xì)胞回收率最高達(dá)到51.8%。本研究中，將肝癌細(xì)胞置于不同摩爾濃度的海藻糖溶液中孵育7 h后凍干，當(dāng)胞外海藻糖摩爾濃度為800 mmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率和24 h貼壁率差異顯著（P＜0.05），凍干效果最佳。

4 結(jié)論

采用真空冷凍干燥的方法保存肝癌細(xì)胞Hep?G2，選擇不同體積分?jǐn)?shù)的Me2SO、甘油及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PVP、復(fù)方保護(hù)劑篩選出最優(yōu)保護(hù)劑配方，并通過測(cè)定細(xì)胞回收率、存活率和24 h貼壁率來探究海藻糖對(duì)肝癌細(xì)胞凍干的影響。結(jié)果表明：添加40%PVP（w/v） ＋10%甘油（v/v） ＋15%FBS（v/v） ＋20%海藻糖（w/v）的保護(hù)劑的細(xì)胞，在復(fù)水后回收率、存活率和 24 h 貼壁率分別為 29.58%，42.18% 和18.71%，與對(duì)照組差異顯著，對(duì)細(xì)胞保護(hù)效果最佳；當(dāng)胞外海藻糖摩爾濃度為800 mmol/L時(shí)，凍干效果最好，肝癌細(xì)胞Hep?G2在復(fù)水后回收率、存活率和24 h 貼壁率分別為 27.81%，66.65% 和 33.68%，存活率和貼壁率顯著高于其他組。該結(jié)論對(duì)凍干肝癌細(xì)胞Hep?G2的可能性提供了初步證明，對(duì)其他體細(xì)胞的凍干工藝也具有一定的借鑒價(jià)值。

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Preliminary Research on Freeze?drying Preservation of Human Hepatoma Hep?G2 Cells

Song Ping Li Weijie Zhou Xinli Liu Baolin
（School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai，200093，China）

Freeze?drying is a long?term and effective method for cell preservation．The lyoprotectant can have a significant effect on cell freeze?drying．In this study，different volume concentrations of Me2SO，glycerol，and different mass concentrations polyvinylpyrrolidone（PVP），compound lyoprotectant for lyophilizing human Hepatoma Hep?G2 cells were considered．The effect of intracellular trehalose on the lyophilized cells was investigated by determining the cell?recovery rate，survival rate，and 24 h attachment rate．The results show that，compared with the control group，the cells added in a 40%PVP （w/v） ＋ 10% （v/v） glycerol ＋ 15%fetal bovine serum （FBS） （v/v） ＋ 20% trehalose （w/v） solution

better protection．The cell recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate are 29.58%，42．18%，and 18．71%，respectively．When the extracellular trehalose molar concentration is 800 mmol/L，the Hepatoma Hep?G2 cell?recovery rate，survival rate，and 24 h adherent rate are 27．81% ，66．65% ，and 33．68% ，respectively．It is significantly better than the control group and has the best protection for cell freeze?drying．

freeze?drying；lyoprotectant；cell；survival rate

Li Weijie，male，lecturer，College of Medical Equipment and Food，University of Shanghai for Science and Technology，＋86 13651731551，E?mail：liweijie10 ＠ 139．com．Research fields：cryopreservation or freeze?drying of food，cells and tissues．

TB61＋1；R318．52；R735．7

A

0253－4339（2017）06－0111－08

10.3969 /j.issn.0253 － 4339.2017.06.111

國(guó)家自然科學(xué)基金（51376132）資助項(xiàng)目。（The project was supported by the National Natural Science Foundation of China （No．51376132）．）

2017年1月23日

李維杰，男，講師，上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，13651731551，E?mail：liweijie10＠ 139．com。 研究方向：食品及生物細(xì)胞、組織冷凍冷藏以及凍干工藝。