南蘋瑤，王小鶯

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江西南昌330045）

14種中藥乙醇提取物對大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)

南蘋瑤，王小鶯*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江西南昌330045）

目的：丁香等14味中藥對大腸埃希菌ATCC25922的體外抑菌試驗(yàn)。方法：選用14種中藥（白芍、烏梅、苦參、蒲公英、丁香、黃連、山楂、黃柏、大黃、連翹、柴胡、穿心蓮、郁金、白芷），分別采用乙醇回流法制備出生藥濃度為1g/L。前4種中藥提取出膏狀物全部用無水乙醇溶解，后10種中藥精密稱取兩份分別用無水乙醇、70%乙醇溶解，通過瓊脂打洞法測定不同中藥對大腸桿菌的抑制作用。結(jié)果：連翹、柴胡、穿心蓮、郁金、白芷的中藥提取物對大腸桿菌幾乎沒有抑菌作用，白芍、烏梅、苦參、蒲公英的中藥提取物用無水乙醇溶解在瓊脂打洞法中平均抑菌圈分別為17.7mm、26.0mm、16.7mm、12.0mm，丁香、黃連、山楂、黃柏、大黃的中藥提取物用無水乙醇溶解對大腸桿菌的平均抑菌圈為17.0mm、10.5mm、21.5mm、15.5mm、17.5mm；用70%乙醇溶解所測平均抑菌圈分別為21.5mm、23.5mm、23.0mm、21.5mm、21.5mm。結(jié)論：9種中藥的乙醇提取物對大腸桿菌的體外抑菌強(qiáng)度大小為烏梅＞山楂＞白芍＞大黃＞丁香＞苦參＞黃柏＞蒲公英＞黃連；中藥膏狀物提取物用70%乙醇溶解可以獲得更大的抑菌圈，說明溶解于水中的中藥提取物也含有抑菌成分不容忽視。

中藥；大腸桿菌；乙醇提??；瓊脂打洞法

在人和家畜的生活環(huán)境中存在著各種細(xì)菌，而長期使用化學(xué)藥物會導(dǎo)致藥物毒副作用、細(xì)菌耐藥性、藥物殘留所致的畜產(chǎn)品安全等問題，且抗生素漸漸不能滿足畜產(chǎn)品無公害化生產(chǎn)的要求。而中草藥是我國特有的中醫(yī)藥理論和實(shí)踐的產(chǎn)物，價格低廉，藥源廣泛，具有廣泛的發(fā)展?jié)摿?，它主要是通過調(diào)整機(jī)體功能狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)抗菌作用[1]。大部分中草藥具有毒副作用小、無殘留、無耐藥性的特點(diǎn)[2]，中藥作為替代化學(xué)藥物解決藥殘和抗藥性的重要途徑，越來越受到重視。為了尋求抗菌作用強(qiáng)的藥物，我們對十四種中藥進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藥材：選用白芍、烏梅、苦參、蒲公英、丁香、黃連、山楂、黃柏、大黃、連翹、柴胡、穿心蓮、郁金、白芷14種中藥，均購于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院。

菌種：大腸埃希菌ATCC25922購于廣東省微生物菌種保藏中心。

儀器與設(shè)備：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE5298A,上海亞榮生化儀器廠）；粉碎機(jī)(DFT-100，溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；雙人單面凈化工作臺（SW-CJ-2D,蘇州凈化設(shè)備有限公司）；生化培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS,上海申安醫(yī)療器械廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，國華電器有限公司）；移液槍。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：取麥康凱瓊脂粉末12.5g，加入裝有250mL蒸餾水的錐形瓶中，加熱煮沸溶解并攪拌，121℃高溫滅菌20min后備用。未冷卻凝固時分別倒入12個滅菌干燥的培養(yǎng)皿中，等待瓊脂冷卻凝固。冷卻后4℃冷藏備用。

MH肉湯培養(yǎng)液：MH肉湯粉末7.5g，加入裝有250mL蒸餾水的錐形瓶中加熱煮沸溶解并攪拌，121℃高溫滅菌20min后備用。冷卻后4℃冷藏備用。

1.2.2 菌液的制備

取冷凍保存的塑料凍存管，立即放置在38～40℃水浴中快速復(fù)蘇并適當(dāng)搖動。直到內(nèi)部結(jié)冰完全溶解為止，一般約50～100s，開啟塑料凍存管，吸取菌液移植于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h。挑取該麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的單個菌落接種至另一麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種復(fù)蘇。采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，勾取平板上菌落1～2個，置于MH肉湯中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。菌液4℃冰箱保存?zhèn)溆?，臨用前稀釋為106CFU·mL-1。

1.2.3 中藥提取物的制備

1.2.3.1 白芍、烏梅、苦參、蒲公英藥材各稱取10g，粉粹成粉末，70%乙醇加熱回流提取，合并提取液。取濾渣后，50～60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀物[3]，用無水乙醇以生藥濃度為1g/L在超聲波下溶解配成藥液。過濾除菌，置冰箱4℃冷藏保存。

1.2.3.2 丁香、黃連、山楂、黃柏、大黃、連翹、柴胡、穿心蓮、郁金、白芷藥材各稱取10g，分別粉粹成粉末，70%乙醇加熱回流提取，合并濾液，精密量取2份分別用無水乙醇、70%乙醇溶解，生藥濃度為1g/L。過濾除菌，置冰箱4℃冷藏保存。

1.3 體外抑菌試驗(yàn)

根據(jù)李敏珍等人的研究[4]，選用瓊脂打洞法做體外抑菌，拿滅菌棉簽將菌液均勻涂抹在平板上，室溫干燥5min后，用無菌打孔器打孔，以無菌針頭挑出孔內(nèi)瓊脂。滴少量的未凝固的瓊脂于孔內(nèi)封底，防止藥液從孔底流走。以無水乙醇為溶劑對照，每個孔滴藥液100μL，重復(fù)2或3次，放置30min后，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h后觀察抑菌圈大小，求平均值。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

打孔法：抑菌圈直徑≥20mm為極敏，抑菌圈直徑在15～19mm為高敏，抑菌圈直徑在10～14為中敏，抑菌圈直徑＜10mm為低敏，無抑菌圈為耐藥[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 無水乙醇溶解中藥提取物體外抑菌試驗(yàn)

白芍、烏梅、苦參、蒲公英乙醇提取物對大腸桿菌均有抑制作用，所測的平均抑菌圈大小分別為 17.7mm、26.0mm、16.7mm、12.0mm，其中烏梅的抑菌作用最強(qiáng)，為極度敏感，蒲公英的抑菌作用最差，為中度敏感。結(jié)果見表1。

表1 無水乙醇溶解中藥提取物體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

圖1

2.2 不同濃度乙醇溶解中藥提取物體外抑菌試驗(yàn)

連翹、柴胡、穿心蓮、郁金、白芷的中藥提取物對大腸桿菌幾乎沒有抑制作用，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，表現(xiàn)為耐藥。

由表2得知，對于丁香、黃連、山楂、黃柏、大黃的中藥提取的膏狀物分別用無水乙醇和70%乙醇溶解，用70%乙醇溶解的所測的平均抑菌圈均更大。其中黃連相差最大，山楂差距最相近，均為極度敏感。說明溶解于水中的中藥提取物也有抑菌成分，且那部分抑菌成分對于不同中藥，其抑菌效果又是不同的。結(jié)合前四種中藥，同樣的生藥濃度1g/L，相同的用量每個孔100μL，9種中藥對大腸桿菌的抑制強(qiáng)度大小為烏梅＞山楂＞白芍＞大黃＞丁香＞苦參＞黃柏＞蒲公英＞黃連，用70%乙醇溶解中藥提取物抑菌強(qiáng)度大小為山楂＞大黃＞丁香＞黃柏＞黃連。

表2 不同濃度乙醇溶解中藥提取物體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

圖2

3 討論

不同中藥對大腸桿菌的抑制作用不同，而將中藥有效抑菌成分更多地提取出來并發(fā)揮它的藥效至關(guān)重要。對于不同的中藥，提取有效成分、濃縮、溶解膏狀物的條件不同，抑菌效果可能有很大不同。黃連與山楂提取出的膏狀物精密稱取兩份分別用無水乙醇和70%乙醇溶解，配成的藥液做瓊脂擴(kuò)散法測抑菌直徑，70%乙醇溶解下兩種藥物抑菌圈大小相近，但無水乙醇溶解下兩種藥物抑菌圈相差較大。

中藥不同于西藥，中草藥提取物可以消除大腸桿菌耐藥性及耐藥質(zhì)粒，從而達(dá)到抑殺目的。耐藥質(zhì)粒是造成大腸桿菌耐藥性的主要原因[6]。臨床上使用中藥進(jìn)行治療，可對抗菌藥物耐藥和敏感的大腸桿菌產(chǎn)生相同的治療效果，這對于臨床用藥具有積極的指導(dǎo)意義[7]。

圖1、2可以看出加乙醇的孔不規(guī)則，可能是無水乙醇出現(xiàn)滲透的原因?qū)е拢捎跓o菌操作臺不平導(dǎo)致平板倒置不均勻，同樣是加100μL溶液，部分孔溶液會滲出，或是無菌針頭挑瓊脂不均勻?qū)е?但從圖中可以明顯看出，溶解中藥膏狀物用70%乙醇更為合適。

[1]劉榮欣,魯改儒,郭吉勇.中藥及其組方對大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,04∶2265-2267.

[2]周琰冰,趙鑫薈,艾啟俊.三種中草藥對大腸桿菌的抑制作用及機(jī)理初探[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2014,21∶294-300.

[3]錢晶晶.鳳尾草抑菌活性成分提取及其抑菌作用的初步研究[D].江西農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[4]李敏珍,曹治金,劉碧鳳，等.幾種常用中藥抑菌試驗(yàn)方法比較(摘要)[J].廣西中醫(yī)藥,1985,06∶33.

[5]唐亮,劉翠艷,韓春楊,等.中藥研究常用三種體外抑菌方法的比較[J].中國中醫(yī)藥科技,2011,05∶419-420.

[6]褚秀玲,蘇建青,韋旭斌.中藥抗大腸桿菌病研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,21∶9093-9094+9114.

[7]胥洪燦,宋友文.12味中藥及其復(fù)方對大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].四川畜牧獸醫(yī),2004,03∶24-25+28.

S853.74

B

1003-8655（2017）05-0006-03

江西省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（20161BBF60088）

南蘋瑤（1995-），女，山西省，碩士研究生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)及毒理學(xué)，E-mail:2280425155@qq.com.

王小鶯（1969-），女，江西省，碩士，副教授，E-mail:wangxiaoying6969@126.com.