樊曉靜，史志濤，孫 昕，曾斌芳

(1.新疆醫(yī)科大學附屬自治區(qū)中醫(yī)院腫瘤外科，烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，烏魯木齊 834000)

·論著·臨床研究

Notch1、Notch3及Hes1在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達及臨床意義

樊曉靜1，史志濤1，孫 昕1，曾斌芳2

(1.新疆醫(yī)科大學附屬自治區(qū)中醫(yī)院腫瘤外科，烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，烏魯木齊 834000)

目的探討胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)患者腫瘤組織中Notch 信號通路相關(guān)蛋白Notch1、Notch3及Hes1表達水平及臨床意義。方法采用實時定量PCR(Q-PCR)和Western blot方法檢測135例新鮮GIST標本及臨近非腫瘤組織中Notch1、Notch3及Hes1 mRNA和蛋白表達情況。同時采用免疫組織化學方法檢測Notch1、Notch3及Hes1蛋白表達情況，并分析各蛋白表達與GIST 患者臨床病理因素的關(guān)系。另將野生型小鼠(WT)和Notch1基因敲除小鼠(KO) 40只，分為WT組、KO組、WT+GIST組和KO+GIST組，檢測各組Notch1、Notch3及Hes1蛋白表達情況。結(jié)果與臨近非腫瘤組織相比，GIST組織中Notch1、Notch3及Hes1 mRNA和蛋白表達均上調(diào)(Plt;0.05)。GIST標本的Notch1、Notch3、Hes1陽性率(59.26%、65.19%、62.22%)均高于臨近非腫瘤組織(17.78%、22.22%、17.78%)，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。統(tǒng)計分析證實Notch1 蛋白表達與GIST的NIH分級密切相關(guān)(χ2=8.532，P=0.002)；Notch3 蛋白表達與GIST 的腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(χ2=7.532，P=0.003)；Hes1 蛋白表達與GIST 的腫瘤大小密切相關(guān)(χ2=6.781，P=0.012)。各組小鼠Notch1、Notch3及Hes1蛋白表達情況顯示，與WT組相比，WT+GIST組小鼠體內(nèi)3種蛋白表達升高(Plt;0.05)；與KO組相比，KO+GIST組小鼠體內(nèi)3種蛋白表達無明顯變化(Pgt;0.05)；與WT+GIST組相比，KO+GIST組小鼠體內(nèi)3種蛋白表達降低(Plt;0.05)。結(jié)論Notch 信號通路相關(guān)蛋白Notch1、Notch3及Hes1在GIST患者組織中表達升高，Notch 信號通路的激活可能在GIST發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。

胃腸道間質(zhì)腫瘤；Notch1；Notch3；Hes1

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors，GIST)是臨床上較常見的胃腸道腫瘤疾病，其具有發(fā)病率高和危害性大的特點，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和身體健康[1]。早期腫瘤可采用手術(shù)切除進行治療，但有部分腫瘤較為復(fù)雜且不可切除。對于藥物治療，鹽酸伊馬替尼曾是臨床上治療GIST的主要藥物，但伊馬替尼存在嚴重的耐藥性問題而成為臨床上一個難題[2-4]。目前臨床上尚無GIST的有效治療藥物，因此，探索新的GIST治療靶點迫在眉睫。Notch信號通路中的多個信號分子參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程已被證實[5-7]，但是關(guān)于Notch信號通路中各個信號分子，包括受體Notch 1、Notch 3等及下游靶基因Hes家族在GIST組織中的表達研究很少。本研究選取2012-2016年新疆醫(yī)科大學附屬自治區(qū)中醫(yī)院收治的GIST患者作為研究對象，探討Notch信號通路中Notch 1、Notch 3及下游靶基因Hes-1在GIST中的表達及臨床意義，為GIST治療探索新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 135例GIST標本及相應(yīng)的臨近非腫瘤組織標本(距離腫瘤組織2 cm以上)均采集自2012-2016年該院收治的GIST患者。本研究納入的患者均通過病理學方法確診為GIST。納入標準[8]：接受R0切除的原發(fā)性GIST患者。排除標準：(1)合并其他腫瘤或者其他重大疾病患者；(2)合并心理疾病、精神疾病患者。135例GIST患者中，男67例，女68例；年齡為26～84歲，平均(59.92±8.91)歲；腫瘤直徑1.8～16.0 cm，平均(6.65±1.91)cm；腫瘤部位：胃部位56例，十二指腸部位29例，小腸部位26例，結(jié)直腸部位13例，其他部位11例；按美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)公布的GIST術(shù)后危險度分級系統(tǒng)(2008版)進行分類，分為極低危12例，低危24例，中危42例和高危57例。臨床標本采集及后續(xù)研究均獲得患者同意和醫(yī)院醫(yī)學倫理審查。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑 ABI 7300熒光定量PCR儀(型號：ABI 7300，上海普迪生物技術(shù)有限公司)；EL204梅特勒電子天平(型號：EL204，廠家：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；Notch-1、Notch-3、Hes-1及GAPDH一抗均購自Cell Signaling Technology公司；二抗購自碧云天公司；免疫組織化學檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2.2熒光定量PCR[9]采用Trizol方法提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度和濃度后，取2 μg進行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。采用SYBR green染料法進行定量檢測，Notch1、Notch3、Hes1及GAPDH(內(nèi)參)引物信息見表1。

1.2.3Western blot[10]常規(guī)方法提取組織總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)方法測定蛋白質(zhì)含量后，進行凝膠電泳，每孔上樣20 μg，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯薄膜(PVDF)上后，3%的脫脂奶封閉2 h，分布孵育抗人Notch1、Notch3及Hes1和GAPDH一抗，4 ℃孵育一抗過夜，接著進行TBST洗膜，最后孵育二抗并進行顯影。采用Quantity-One軟件對條帶亮度進行分析。

1.2.4免疫組織化學[11]采用常規(guī)方法制備5 μm厚的石蠟切片，進行免疫組織化學染色，采用抗Notch1、Notch3及Hes1單克隆抗體孵育，4 ℃過夜。洗滌后孵育二抗，加顯色液后進行曝光。陽性細胞所占百分率(PP)得分：光學顯微鏡下(×400)觀察，拍照，隨機選取10個視野用于計算平均值，PP=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。根據(jù)染色強度(0～3分，0分為無染色，1分為弱染色，2分為中度染色，3分為強染色)進行判分。

1.2.5動物實驗部分 購買野生型小鼠(WT)和Notch1基因敲除小鼠(KO) 40只，購自北京大學動物實驗中心。隨機分為WT組、KO組、WT+GIST組和KO+GIST組。每組10只。其中，WT+GIST組：野生型小鼠(WT)接種1×106個GIST細胞。KO+GIST組：Notch1基因敲除小鼠(KO)接種1×106個GIST細胞。Western blot法檢測各組Notch1、Notch3及Hes1蛋白表達情況。

2 結(jié) 果

2.1Notch1、Notch3、Hes1 mRNA和蛋白檢測結(jié)果 采用Q-PCR方法檢測135例GIST標本和臨近非腫瘤組織標本，GIST標本組Notch1、Notch 3、Hes1 mRNA表達量為7.22±1.85、6.22±1.85、8.22±1.85，與非腫瘤組織(2.81±1.42、1.81±1.42、3.81±1.42)比較差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。Western blot檢測結(jié)果表明，GIST標本組Notch1、Notch 3、Hes1蛋白表達量為1.32±0.61、2.32±0.61、1.92±0.61，高于與非腫瘤組織(0.83±0.50、0.93±0.50、0.93±0.50)，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)，見圖1～3。

表1 Notch1、Notch3、Hes1及GAPDH引物信息

圖1 GIST腫瘤組織與臨近非腫瘤組織Notch1、Notch3、Hes1 mRNA相對表達量比較

圖2 GIST腫瘤組織與臨近非腫瘤組織Notch1、Notch3、Hes1 蛋白相對表達量比較

圖3 GIST腫瘤組織與臨近非腫瘤組織中Notch1、Notch3、Hes1 蛋白表達Western blot檢測

2.2Notch1、Notch3 和Hes1 蛋白在GIST組織與瘤旁組織中的表達陽性率 免疫組織化學結(jié)果表明，59.26%(84/135)GIST標本為Notch1陽性，高于臨近非腫瘤組織17.78%(24/135)；65.19%(88/135)GIST標本為Notch3陽性，高于臨近非腫瘤組織22.22%(24/135)；62.22%(84/135)GIST標本為Hes1陽性，高于臨近非腫瘤組織17.78%(24/135)，差異均有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)，見圖4。

2.3Notch1、Notch3、Hes1表達與GIST患者臨床病理學特征關(guān)系分析 Notch1 蛋白表達與GIST 的NIH分級存在相關(guān)性(χ2=8.532，P=0.002)；Notch3 蛋白表達與GIST 的腫瘤轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性(χ2=7.532，P=0.003)；Hes1 蛋白表達與GIST 的腫瘤大小存在相關(guān)性(χ2=6.781，P=0.012)，見表2。

2.4動物實驗結(jié)果 Western blot法檢測各組Notch1、Notch3及Hes1蛋白表達情況，與WT組相比，WT+GIST組小鼠體內(nèi)Notch1、Notch3及Hes1蛋白表達升高(Plt;0.05)。與KO組相比，KO+GIST組小鼠體內(nèi)Notch1、Notch3及Hes1蛋白表達無明顯變化(Pgt;0.05)。與WT+GIST組相比，KO+GIST組小鼠體內(nèi)Notch1、Notch3及Hes1蛋白表達降低(Plt;0.05)，見表3、圖5。

表2 135例GIST標本Notch1、Notch3、Hes1表達與患者臨床病理學特征關(guān)系分析[n(%)]

項目WT組WT+GIST組KO組KO+GIST組Notch10.92±0.121.62±0.34a0.93±0.120.92±0.12bNotch30.95±0.121.62±0.37a0.93±0.120.94±0.17bHes10.94±0.121.62±0.34a0.96±0.120.92±0.12b

a：Plt;0.05，與WT組比較；b：Plt;0.05，與WT+GIST組比較

1:WT組；2：WT+GIST組；3：KO組；4：KO+GIST組

圖5動物實驗結(jié)果Western blot檢測結(jié)果

3 討 論

Notch信號通路參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其調(diào)控細胞多種進程，包括細胞的分化、增殖、凋亡及遷移等[12-14]。Notch 1、Notch 2、Notch-3和Notch 4是Notch受體，當Notch配體與Notch受體特異性結(jié)合后，Notch信號通路隨后被激活，進而激活下游靶基因Hes家族的轉(zhuǎn)錄[15]。Hes1作為Notch信號通路下游靶基因Hes家族的主要成員，也隨之被激活[16]。Notch信號通路在不同的腫瘤中表現(xiàn)出不同的作用，具有促癌和抗癌的雙重作用[17]。眾多研究結(jié)果表明，在卵巢癌、膽管癌、肺癌及乳腺癌中，Notch信號通路表現(xiàn)促癌作用[18]。而在皮膚癌、前列腺癌及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，Notch信號通路表現(xiàn)抗瘤作用[19-20]。目前，關(guān)于Notch信號通路中各個信號分子，包括受體Notch 1、Notch 3等及下游靶基因Hes家族在GIST組織中的表達研究很少，對此，本文將進行進一步探討。

本研究首次探討Notch信號通路中Notch1、Notch3及Hes1蛋白在GIST組織中的表達，135例新鮮GIST標本Q-PCR及Western blot結(jié)果表明，與臨近非腫瘤組織相比，GIST組織中Notch1、Notch3及Hes1 mRNA和蛋白表達均上調(diào)(Plt;0.05)。免疫組織化學結(jié)果表明，GIST標本的Notch1、Notch3、Hes1陽性率(59.26%、65.19%、62.22%)均高于臨近非腫瘤組織(17.78%、22.22%、17.78%)。可見GIST組織中Notch1、Notch3及Hes1 mRNA和蛋白表達均上調(diào)(Plt;0.05)。同時本研究進一步探討了Notch1、Notch3及Hes1在135例GIST腫瘤組織中的表達情況與臨床因素之間的關(guān)系，研究表明，Notch1 蛋白表達與GIST 的NIH 分級有相關(guān)性(P=0.002)；Notch3 蛋白的表達與GIST 的腫瘤轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(0.003)；Hes1 蛋白表達與GIST 的腫瘤大小有相關(guān)性(P=0.012)。Western blot法檢測各組Notch1、Notch3及Hes1蛋白表達情況顯示，與WT組相比，WT+GIST組小鼠體內(nèi)3種蛋白表達升高(Plt;0.05)；與KO組相比，KO+GIST組小鼠體內(nèi)3種蛋白表達無明顯變化(Pgt;0.05)；與WT+GIST組相比，KO+GIST組小鼠體內(nèi)3種蛋白表達降低(Plt;0.05)。提示Notch 信號通路的激活可能促進GIST的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，Notch 信號通路相關(guān)蛋白Notch1、Notch3及Hes1在GIST患者組織中表達升高，Notch 信號通路的激活可能在GIST發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，有望進一步揭示Notch信號通路對GIST細胞抗凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面的具體機制，同時有望為GIST分子靶向治療尋找新的有效靶點。

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ExpressionofNotch1,Notch3andHes1ingastrointestinalstromaltumorsandtheirclinicalsignificance*

FanXiaojing1,ShiZhitao1,SunXin1,ZengBinfang2

(1.DepartmentofOncologySurgery,theAffiliatedAutonomousRegionalChineseMedicineofHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang830000,China;2.DepartmentofOncology,theAffiliatedChineseMedicineHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang834000,China)

ObjectiveTo investigate the expression of Notch1,Notch3 and Hes1 in gastrointestinal stromal tumors(GIST) and their clinical significance.MethodsQuantitative real-time polymerase chain-reaction(Q-PCR) and Western blot were applied to detect the mRNA and the expression of Notch1,Notch3 and Hes1 in 135 matched GIST specimens and adjacent tissues.Meanwhile,the expression of Notch1,Notch3 and Hes1 was detected by immunohistochemistry,and the relationship between their expression and clinicopathological factors in GIST patients was analyzed.In addition,a total of 40 wild type mice(WT) and Notch1 knockout mice(KO) was divided into WT group,KO group,WT+GIST group and KO+GIST group,and the expression of Notch1,Notch3 and Hes1 in each group was detected.ResultsCompared with adjacent tissues,the mRNA and the expression of Notch1,Notch3 and Hes1 were up-regulated in GIST tissues(Plt;0.05).The positive rates of Notch1,Notch3 and Hes1 in the GIST specimens(59.26%,65.19% and 62.22%) were higher than those in the adjacent tissues(17.78%,22.22% and 17.78%),and the difference was statistically significant(Plt;0.05).Statistical analysis showed that the expression of Notch1 was significantly correlated with the NIH grade of GIST(χ2=8.532,P=0.002);the expression of Notch3 was significantly related with tumor metastasis of GIST(χ2=7.532,P=0.003);the expression of Hes1 was significantly associated with the tumor size of GIST(χ2=6.781,P=0.012).The expression of Notch1,Notch3 and Hes1 was higher in WT+GIST group compared to the expression found in WT group(allPlt;0.05).There were no significant differences in the expression of Notch1,Notch3 and Hes1 between WT+GIST group and KO+GIST group.The expression of Notch1,Notch3 and Hes1 was lower in KO+GIST group compared to the expression found in WT+GIST group(allPlt;0.05).ConclusionThe expression of Notch1,Notch3 and Hes1 related to Notch signaling pathway is elevated in GIST tissues,and the activation of Notch signaling pathway may play an important role in the occurrence and progression of GIST.

gastrointestinal stromal tumors;Notch1;Notch3;Hes1

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.010

國家自然科學基金資助項目(81160431)。

樊曉靜(1974-)，主治醫(yī)生，碩士，主要從事腫瘤外科方面的研究。

R735

A

1671-8348(2017)32-4500-05

2017-04-08

2017-07-02)