趙 敏，王曉娟，陳 波，李 潔，于建云，郭澤云△，楊 力▲

(昆明醫(yī)科大學(xué)：1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系；2.科研中心；3.高等教育研究所，昆明 650500)

·論著·基礎(chǔ)研究

P-糖蛋白在大鼠腦缺血再灌注后的表達(dá)變化

趙 敏1，王曉娟1，陳 波2，李 潔1，于建云3，郭澤云1△，楊 力1▲

(昆明醫(yī)科大學(xué)：1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系；2.科研中心；3.高等教育研究所，昆明 650500)

目的觀察大鼠局灶性腦缺血90 min再灌注后P-糖蛋白(P-gp)在腦組織中的表達(dá)及其變化規(guī)律。方法采用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注模型，選取26只成年健康SD雄性大鼠，其中1只用于2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色，其余25只隨機(jī)分為對照組(n=5)、假手術(shù)組(n=5)、腦缺血再灌注1、3、7 d組(n=5)。用免疫組織化學(xué)DAB單標(biāo)，觀察P-gp在正常腦組織和缺血腦組織中的分布變化；用Mdr-1抗體分別和神經(jīng)元標(biāo)記物(Neun)、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(GFAP)、微血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物(CD31)進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)，觀察P-gp在缺血再灌注后腦組織的表達(dá)；用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測腦缺血再灌注后大腦皮質(zhì)及紋狀體微血管P-gp mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果對照組僅在腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)P-gp，缺血再灌注組除微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)P-gp外，在部分神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起也有表達(dá)。腦缺血再灌注后1 d皮質(zhì)P-gp mRNA表達(dá)降低，但3 d表達(dá)明顯增高，7 d又下降,其升高和降低水平與對照組及假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。腦缺血再灌注后1、3、7 d紋狀體P-gp mRNA表達(dá)均增多，其中以1、3 d增多明顯，與對照組和假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)論腦缺血再灌注后P-gp在大腦皮層及紋狀體微血管P-gp的表達(dá)呈現(xiàn)不同的趨勢，這可能是腦組織的自我保護(hù)機(jī)制之一。

P-糖蛋白；腦缺血；再灌注；ABC結(jié)合盒蛋白

腦缺血-再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)對腦組織的損傷會進(jìn)一步加重，最終導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或壞死，腦血管結(jié)構(gòu)改變，血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)功能破壞[1]。BBB微血管內(nèi)皮的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)能將進(jìn)入腦組織的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)回微血管中，使進(jìn)入腦組織的藥物不能達(dá)到有效治療濃度，這可能是導(dǎo)致治療效果不盡如人意的重要原因之一。越來越多的證據(jù)表明P-gp在癲癇[2]、阿爾茨海默病、帕金森和肌萎縮性側(cè)索硬化癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病及治療中擔(dān)任重要角色[3]。然而，國內(nèi)外有關(guān)腦缺血時(shí)P-gp的表達(dá)變化與作用的報(bào)道尚不多見。本研究復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型，對腦缺血再灌注后P-gp的表達(dá)變化進(jìn)行系統(tǒng)的觀察，以期了解腦缺血再灌注后P-gp的表達(dá)規(guī)律，為腦缺血后給予有效的P-gp逆轉(zhuǎn)劑，抑制P-gp的表達(dá)，有效治療缺血性腦損傷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 成年健康SD雄性大鼠26只(昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，體質(zhì)量250～280 g，1只用于MCAO再灌注后腦切片TTC染色，其余25只采用隨機(jī)數(shù)字編號法分為3組：對照組(n=5)、假手術(shù)組(n=5)和腦缺血再灌注組，后者按大鼠大腦中動脈阻斷90 min再灌后1、3、7 d分為3個(gè)亞組(n=5)。動物均于實(shí)驗(yàn)前置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1周,自由進(jìn)食、飲水；室溫控制在(23±2)℃,自然光照,術(shù)前禁食12 h。

1.2方法

1.2.1大鼠腦缺血再灌注模型的復(fù)制 參照Longa等[4]的方法建立大鼠MCAO再灌注模型。動物以3%戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g)腹腔注射麻醉，頸正中切口剪開淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌間的肌間隙，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)和迷走神經(jīng)。鈍性撕開頸動脈鞘，分離CCA。分離右側(cè)頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，并結(jié)扎ECA遠(yuǎn)心端，微動脈夾夾住CCA近心端和ICA，在ECA距動脈分叉3～5 mm處剪一小口，插入預(yù)先處理好的線栓，插入長度(18.5±0.5)mm(從CCA分叉處計(jì)算)，90 min后緩慢拔出線栓，扎緊ECA開口近心端，逐層縫合，術(shù)后于溫床保暖，給予其充足的鼠糧和水。假手術(shù)組大鼠除不栓塞大腦中動脈外，其余處理同缺血組。術(shù)后大鼠參照Longa等[4]的評分法，0分：無神經(jīng)缺損癥狀；1分：不能完全伸展左側(cè)前爪；2分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向左側(cè)傾斜；4分：不能行走或昏迷。1～4分為有效模型，納入實(shí)驗(yàn)分組，出血較多，梗死灶不明顯或提前死亡的大鼠均剔除。

1.2.22,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色 大鼠MCAO再灌注術(shù)后1 d斷頭取腦，將腦組織經(jīng)-20 ℃冰箱凍存20 min，去除嗅球、小腦和低位腦干后沿冠狀面5等分連續(xù)切片，置于37 ℃的水浴箱中避光染色30 min，期間每隔10 min翻動1次腦片，使其染色均勻，取出腦組織浸入2%的多聚甲醛充分固定,數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.2.3組織樣品制備與染色

1.2.3.1組織樣品制備 各組大鼠按MCAO再灌注術(shù)后的時(shí)間點(diǎn)用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，隨后斷頭取腦，用4%多聚甲醛緩沖液于4 ℃冰箱后固定24 h。腦組織經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、烤箱內(nèi)浸蠟，石蠟包埋。AO切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度10 μm，間隔5片取1片。腦組織切片過30%乙醇后放入水浴箱中展平，粘貼于用鉻礬明膠處理過的載玻片上，烤干后備用。

1.2.3.2免疫組織化學(xué)DAB單標(biāo)染色 腦組織切片常規(guī)脫蠟水化，浸于預(yù)熱的檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中，微波爐高溫修復(fù)15 min后，采用即用型超敏試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)進(jìn)行S-P(streptavidin-peroxidase)法免疫組化染色。一抗為小鼠抗兔單克隆Mdr-1抗體(1∶100，Santa公司)，4 ℃冰箱，過夜；二抗為生物素標(biāo)記的抗體(羊抗兔)；后再滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液；室溫下避光DAB顯色10 min；乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。免疫組化陰性對照實(shí)驗(yàn)分別用PBS液和羊血清代替一抗，其余步驟相同。

1.2.3.3免疫熒光雙標(biāo)染色 用抗Mdr-1抗體分別與神經(jīng)元的標(biāo)記物(Neun)及星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物(GFAP)和血管內(nèi)皮標(biāo)記物(CD31)進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色。將腦組織切片脫蠟后，用檸檬酸鹽抗原修復(fù)液微波爐高溫修復(fù)15 min，滴加一抗(Mdr-1抗體，1∶100；Neun抗體，1∶100)；(Mdr-1抗體1∶100；GFAP抗體，1∶1 000)；(Mdr-1抗體，1∶100；CD31抗體，1∶100)，室溫過夜；滴加紅色熒光(Cy3)標(biāo)記IgG(1∶100)和綠色熒光(FITC)標(biāo)記的IgG(1∶100)的二抗，室溫避光孵育1h；熒光封片劑封片；激光共聚焦顯微鏡(FV1000，Olympus company Pte Ltd，日本)觀察結(jié)果。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 參考GenBank和以往文獻(xiàn)設(shè)計(jì)P-gp引物(Abcb1a)，序列為：5′-TTG AAG AAA GCG CAC GTC TTT GGG-3′(上游引物)，5′-TTC GCG TAG TCA GGA GCG AAT GAA-3′(下游引物)；β-actin作為內(nèi)參，引物序列為：5′-TTG CTG ACA GGA TGC AGA AGG AGA-3′(上游引物)，5′- ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT -3′(下游引物)。迅速分離各組大鼠右側(cè)皮質(zhì)及紋狀體,速凍后于-80 ℃保存。采用Trizol法提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明(Takara.Cat.#RR047Q)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到互補(bǔ)DNA(cDNA)，再進(jìn)行二Realtime PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：SYBR綠色染料10 μL，cDNA 5 μL，上下游引物各1 μL,dNTP 1 μL,Taq酶2 μL,ddH2O 30 μL,總體積50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，60 ℃、15 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法分析P-gp在腦缺血再灌注后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同部位的相對量。

2 結(jié) 果

2.1大鼠MCAO再灌注模型復(fù)制 各組大鼠MCAO再灌注后，觀察到得分介于1～4分，均為有效模型。取MCAO再灌注1 d后大鼠腦組織進(jìn)行TTC染色，結(jié)果顯示紅色區(qū)域?yàn)榉枪Ｋ啦课?，白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ涝?圖1)，梗死灶與大腦中動脈供血區(qū)域相吻合，通過神經(jīng)功能檢查及冠狀切片染色證明模型復(fù)制成功。

2.2P-gp在正常腦組織和缺血腦組織的分布變化 免疫組化DAB單標(biāo)染色顯示，正常腦組織可見P-gp表達(dá)在微血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕色或棕褐色的逗點(diǎn)狀、條索狀或小管狀結(jié)構(gòu)(圖2A)，但未見其他細(xì)胞有P-gp的陽性表達(dá)。然而MCAO再灌注后卻可見P-gp既表達(dá)在微血管內(nèi)皮細(xì)胞上，又表達(dá)在其他細(xì)胞上(圖2B)。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，MCAO再灌注后腦組織缺血側(cè)可見P-gp(圖3A)與微血管內(nèi)皮(圖3B)有共表達(dá)(圖3C)，P-gp(圖3D)與神經(jīng)元(圖3E)有共表達(dá)(圖3F)，P-gp(圖3G)與星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起(圖3H)有共表達(dá)(圖3I)。

2.3MCAO再灌注后不同位置P-gp mRNA的表達(dá)變化 實(shí)時(shí)熒光PCR定量結(jié)果顯示，MCAO再灌注后1 d皮質(zhì)P-gp mRNA表達(dá)降低，但3 d表達(dá)明顯增高，7 d又下降(圖4),其升高和降低水平與對照組及假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。MCAO再灌注后1、3、7 d紋狀體P-gp mRNA表達(dá)均增多，其中以1、3 d增多明顯(圖5)，與對照組和假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。

紅色區(qū)域:非梗死部位;★:梗死灶

圖1 MCAO再灌注模型大鼠腦組織TTC染色

A：實(shí)心箭頭為正常腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞的P-gp陽性表達(dá)；B：實(shí)心箭頭為MCAO再灌注后的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的P-gp陽性表達(dá)，空心箭頭為MCAO再灌注后的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的P-gp陽性表達(dá)

圖2正常大鼠及MCAO再灌注后大鼠腦組織P-gp免疫組化染色(×400)

A、D、G：紅色熒光為P-gp的陽性表達(dá)；B：綠色熒光為CD31標(biāo)記的微血管內(nèi)皮細(xì)胞；E：綠色熒光為Neun標(biāo)記的神經(jīng)元；H：綠色熒光為GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞；C：箭頭所示為P-gp與CD31共表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞；F：箭頭所示為P-gp與Neun共表達(dá)于神經(jīng)元；I：箭頭所示為P-gp與GFAP共表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞

圖3免疫熒光雙標(biāo)檢測大鼠MCAO再灌注后腦組織P-gp的表達(dá)(×400)

a：Plt;0.05，與對照組及假手術(shù)組比較

圖4各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)P-gp mRNA的表達(dá)

a：Plt;0.05，與對照組及假手術(shù)組比較

圖5各組大鼠缺血側(cè)紋狀體P-gp mRNA的表達(dá)

3 討 論

P-gp屬于ABC結(jié)合盒蛋白家族成員之一。關(guān)于P-gp在大腦中的表達(dá)，大多數(shù)研究顯示其表達(dá)于腦內(nèi)微血管內(nèi)皮上[5-6]；但有學(xué)者在體外的研究發(fā)現(xiàn)，P-gp在小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞上也存在表達(dá)[7]；也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)癲癇狀態(tài)下，P-gp在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞中均出現(xiàn)過表達(dá)的現(xiàn)象[8]；但也有學(xué)者未觀察到神經(jīng)元表達(dá)P-gp[9]。本研究結(jié)果提示正常腦組織P-gp僅表達(dá)在微血管內(nèi)皮上，但腦缺血后，除微血管內(nèi)皮外，部分神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起也能表達(dá)P-gp，與Aronica等[8]的研究結(jié)果相似。

本研究發(fā)現(xiàn)缺血后微血管內(nèi)皮的P-gp表達(dá)升高，缺血3 d時(shí)P-gp表達(dá)達(dá)到高峰，且缺血側(cè)P-gp的表達(dá)高于對側(cè)，推測其增高的原因可能和腦缺血后缺血對側(cè)血流下降有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)急性腦缺血時(shí)缺血對側(cè)鏡像區(qū)有細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象[10]；而應(yīng)用SPECT、PET、Xe-CT 等對腦缺血的臨床研究和動物實(shí)驗(yàn)中觀察到缺血對側(cè)腦血流下降的現(xiàn)象，并且多數(shù)認(rèn)為與“神經(jīng)功能聯(lián)系不能”有關(guān)[11]。本研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠MCAO再灌注后部分神經(jīng)元可表達(dá)P-gp，這可能是腦缺血/再灌注時(shí)，神經(jīng)元在局部被激活,可釋放或表達(dá)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[12]、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)[13]、一氧化碳(NO)[14]、環(huán)氧合酶-2(Cox-2)[15]、促紅細(xì)胞生成素(EPO)[16]等多種物質(zhì)，而這些物質(zhì)與上調(diào)P-gp的表達(dá)密切相關(guān)[17-18]。本研究還觀察到MCAO再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞突起可表達(dá)P-gp，這可能與其返祖表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記物波形蛋白和巢蛋白有關(guān)，而缺血缺氧作為一種信號，激活NF-κB與核內(nèi)靶基因結(jié)合，從而誘導(dǎo)Mdr1基因表達(dá)[13]，而腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌EPO[16]；且EPO參與第二信使NF-кB途徑，激活 NF-кB，從而誘導(dǎo)P-gp的表達(dá)。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，對神經(jīng)元起支持和絕緣作用，同時(shí)其伸出的突起是BBB的重要組成部分，腦缺血后BBB的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生相應(yīng)的變化。BBB通透性的變化反過來又影響腦缺血的病理生理過程；星形膠質(zhì)細(xì)胞突起P-gp的外排作用將有利于BBB的中樞神經(jīng)保護(hù)功能和毒性物質(zhì)的主動清除。

此外，本文進(jìn)一步研究了MCAO再灌注后不同部位P-gp mRNA的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)MCAO再灌注后缺血側(cè)的皮質(zhì)及紋狀體P-gp mRNA的表達(dá)有不同趨勢，MCAO再灌注后1 d皮質(zhì)P-gp mRNA表達(dá)降低，但3 d表達(dá)明顯增高，7 d又下降，而MCAO再灌注后1、3、7 d紋狀體P-gp mRNA表達(dá)均增多，其中以1、3 d增多明顯。MCAO再灌注后缺血側(cè)皮質(zhì)及紋狀體P-gp mRNA均在3 d時(shí)出現(xiàn)表達(dá)高峰，可能和腦缺血后炎癥反應(yīng)有關(guān)。有學(xué)者對缺血90 min再灌注模型的研究中發(fā)現(xiàn)在缺血3 d時(shí)缺血面積趨于穩(wěn)定，此時(shí)各項(xiàng)炎癥反應(yīng)也最嚴(yán)重，諸多炎性因子可通過不同途徑誘導(dǎo)P-gp的表達(dá)，使P-gp在腦內(nèi)的表達(dá)到達(dá)高峰。

MCAO再灌注后部分神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起和微血管內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)P-gp，借助P-gp的外排泵作用將腦內(nèi)的炎性介質(zhì)及毒性物質(zhì)排出腦外，其意義可能是腦組織的自我保護(hù)機(jī)制之一。然而，P-gp mRNA在MCAO再灌注后1 d及7 d在缺血側(cè)皮質(zhì)及紋狀體的表達(dá)變化規(guī)律不同，可能與兩者血管的分布數(shù)量、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞對腦缺血后的炎癥反應(yīng)的敏感性不同有關(guān)，其原因有待進(jìn)一步探索。

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ChangesofexpressionofP-glycoproteinaftercerebralischemiareperfusioninrats*

ZhaoMin1,WangXiaojuan1,ChengBo2,Lijie1,YuJianyun3,GuoZeyun1△,YangLi1▲

(1.DepartmentofAnatomyandHistology/Embryology,BasicMedicalCollege;2.ScientificResearchCenter;3.HigherEducationResearchInstitute,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650500,China)

ObjectiveTo observe the changes of the expression of P-glycoprotein(P-gp) after 90 min focal cerebral ischemia reperfusion in rats.MethodsThe model of focal cerebral ischemia induced by blocking middle cerebral artery was made by using an intraluminal filament technique.A total of 26 adult SD male rats was used for experiment.One of them was applied for the 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride(TTC) staining to detect whether the focal cerebral ischemia model was successfully made,and the remaining rats were randomly divided into control group(n=5),sham operation group(n=5),and cerebral ischemia reperfusion for 1,3,7 d group(n=5).The immunohistochemistry single staining was used to observe the changes of P-gp in the normal and repefued ischemial brain tissue.The immunofluorescence double staining was used to observe the expression of P-gp in the normal and repefued ischemial brain tissue with Mdr-1 antibody,Neun antibody(marker of the neuron),GFAP antibody(marker of the astrocytes),and CD31 antibody(marker of capillary endothelium).Meanwhile the changes of P-gp in ischemic cerebral cortex and striatum capillary were analyzed by using real-time quantitative PCR technique.ResultsIn control group,P-gp was only located in cerebral microvascular endothelial cells,while in cerebral ischemia reperfusion group,it also could be detected in some neurons and astrocytes.After cerebral ischemia reperfusion,the mRNA expression of P-gp in cerebral cortex was decreased on day 1,significantly increased on day 3,and then decreased on day 7.There was significantly statistical difference of the mRNA expression of P-gp cortex in cerebral ischemia reperfusion for 1,3,7 d group compared with control group and sham group(Plt;0.05).After cerebral ischemia reperfusion,the mRNA expression of P-gp in cerebral striatum was increased on day 1,day 3 and day 7,especially on day 1 and day 7,and the difference in cerebral ischemia reperfusion group was statistically significant compared with the other two groups(Plt;0.05).ConclusionP-gp can only be expressed in cerebral microvascular endothelial cells in normal rats,while it can also be expressed in neurons and astrocytes in rats after the brain′s subjection to ischemia reperfusion,and it showed different tendencies between cortex and striatum,which may be regarded as one of the self-protection mechanisms in brain tissue.

P-glycoprotein;brain ischemia;reperfusion;ABC binding cassette protein

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.003

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81060101)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013FZ056)；昆明醫(yī)科大學(xué)青年教師培養(yǎng)特殊支持計(jì)劃項(xiàng)目(J1301306612)。

趙敏(1982-)，講師，碩士，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)和神經(jīng)病理損傷研究工作?！?/p>

，E-mail:guozeyun1@163.com?！餐ㄐ抛髡?，E-mail:yanglikm@163.com。

R743.31

A

1671-8348(2017)32-4473-04

2017-04-13

2017-07-18)