李雅婧，諸葛福艷，梁 娟，何金洋，譚 寧，曾常春△

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬龍華中心醫(yī)院，深圳 518110；2.桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，桂林 541004；3.中山大學(xué)生命科學(xué)院，廣州 510275；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510405；5.桂林醫(yī)學(xué)院廣西肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，桂林 541004)

·論著·

表達(dá)hCD4和hCCR5基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞模型的建立

李雅婧1,2，諸葛福艷3，梁 娟2，何金洋4，譚 寧5，曾常春1,2△

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬龍華中心醫(yī)院，深圳 518110；2.桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，桂林 541004；3.中山大學(xué)生命科學(xué)院，廣州 510275；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510405；5.桂林醫(yī)學(xué)院廣西肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，桂林 541004)

目的研制一種能夠表達(dá)hCD4 和 hCCR5基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)模型，以應(yīng)用于Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)研究。方法構(gòu)建PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR慢病毒載體，按最佳感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染MSCs，熒光定量PCR檢測hCD4和hCCR5的 mRNA的表達(dá)，免疫印跡法檢測MSCs中hCD4和hCCR5蛋白的表達(dá)，免疫熒光法檢測hCD4和hCCR5熒光的表達(dá)；將建立的MSCs細(xì)胞進(jìn)行HIV-1感染后，PCR檢測HIV RNA的表達(dá)。結(jié)果MSCs經(jīng)轉(zhuǎn)染慢病毒載體后，hCD4和CCR5 mRNA凝膠電泳可見193 bp和75 bp的陽性條帶，mRNA的qRT-PCR檢測可見其表達(dá)升高(Plt;0.01)；Western blot檢測可見55.0×103(hCD4)和40.6×103(hCCR5)的陽性條帶；免疫熒光成像可見存在CD4和CCR5的熒光表達(dá)，而空載慢病毒載體呈陰性。轉(zhuǎn)染后MSCs細(xì)胞感染HIV-1后在培養(yǎng)細(xì)胞與上清液中HIV-1 RNA均顯著升高(Plt;0.05)。結(jié)論成功建立了高效表達(dá)hCD4/CCR5蛋白的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞模型，具備對HIV-1易感的特性，可應(yīng)用于HIV的發(fā)病機制、抗病毒、疫苗開發(fā)等研究。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；HIV-1；細(xì)胞模型；hCD4/CCR5；基因表達(dá)

Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV-1)選擇性地侵襲人體CD4+細(xì)胞，少數(shù)HIV-1分離株可以感染CD4+T細(xì)胞白血病細(xì)胞系，如CEM、Jurkat、Hut78細(xì)胞等[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞[2]；易于分離、培養(yǎng)、擴增及外源基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)，且在體外培養(yǎng)的過程中始終保持多向分化的潛能，遺傳性能相當(dāng)穩(wěn)定[3]。此外，轉(zhuǎn)基因MSCs可以持續(xù)產(chǎn)生多種治療作用的蛋白質(zhì)，對免疫缺陷疾病有潛在治療作用[4]。本研究通過慢病毒載體在MSCs細(xì)胞膜上加載hCD4和hCCR5分子，建立一種新的HIV-1易感的細(xì)胞模型，有利于促進(jìn)HIV的發(fā)病機制、抗病毒及基因治療研究。

1 材料與方法

1.1實驗材料 Gateway?BP ClonaseTMⅡ Enzyme Mix、Gateway?LR ClonaseTMⅡ Plus Enzyme Mix購自Invitrogen公司，QIAquick Gel Extraction Kit購自QIAGEN公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自TIANGEN公司，包裝質(zhì)?；旌衔?ViraPowerTMPackaging Mix)購自美國Invitrogen公司，標(biāo)記有PE的抗體(CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD166)均購自BD Biosciences公司；RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購自于Takara公司。Maker為Thermo公司產(chǎn)品，CD4一抗為Abcam公司產(chǎn)品，CCR5一抗為Novus公司產(chǎn)品，二抗為中杉金橋公司產(chǎn)品，發(fā)光液為Thermo公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建與慢病毒包裝 應(yīng)用Gateway技術(shù)，將外源基因片段CMV-CD4-IRES-CCR5-Pgk-Puro導(dǎo)入慢病毒表達(dá)載體PLV.ExBi.P中，形成重組慢病毒質(zhì)粒。制備慢病毒包裝載體，將構(gòu)建的重組慢病毒質(zhì)粒、pHelper 1和pHelper 2的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，產(chǎn)生假性病毒并進(jìn)行測定，空載慢病毒作為轉(zhuǎn)染對照。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 MSCs購自Cyagen Bioscience Inc.。分離、純化 MSCs，置于含10%胎牛血清(FBS)、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的 DMEM/F12的培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染慢病毒后MSCs鑒定：檢測MSCs誘導(dǎo)成骨、成脂能力。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到50%左右時，根據(jù)最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)加入慢病毒表達(dá)載體的培養(yǎng)基2 mL，聚凝胺濃度為8 μg/mL，以空載慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行對照。

1.2.3MSCs中hCD4和hCCR5 mRNA的qRT-PCR檢測 收集第7、10、14天的細(xì)胞，Trizol 法提取總RNA。參照試劑說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。實驗過程設(shè)計空白細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞為陰性對照、以GAPDH作為內(nèi)參對照。引物序列為：CD4(上游引物：5′-TGC CTC AGT ATG CTG GCT CT-3′；下游引物：5′-GAG ACC TTT GCC TCC TTG TTC-3′)；CCR5(上游引物：5′-GCT GGT CAT CCT CAT CCT GAT AA-3′，下游引物：5′-ATG GCC AGG TTG AGC AGG TA-3′)和GAPDH(上游引物：5′-TTC ACC ACC ATG GAG AAG GC-3′，下游引物：5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GA-3′)。ABI7500實時熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，反應(yīng)程序為：95 ℃ 1 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

1.2.4MSCs中hCD4和hCCR5蛋白的Western blot檢測 提取MSCs的細(xì)胞總蛋白，配制10%的聚丙烯酰胺凝膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、染膜、裁膜、脫脂牛奶封膜1 h、一抗孵育4℃過夜、TBST洗滌一抗5次(每次20 min)、脫脂牛奶封閉30 min、二抗孵育1 h、TBST洗滌二抗5次(每次5 min)、發(fā)光成像。

1.2.5MSCs中hCD4和hCCR5的免疫熒光法檢測 細(xì)胞生長融合再次達(dá)到70%左右時，用預(yù)溫的1×PBS洗3次，每次5 min；4%的甲醛室溫固定20～30 min；1×PBS洗3次，每次5 min；4% BSA室溫封閉30 min；加1%BSA稀釋的一抗放在濕盒里，4 ℃孵育過夜；1×PBS洗3次，每次5 min；加1%BSA稀釋的二抗閉光孵育30 min；1×PBS洗3次，每次5 min；激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6MSCs的HIV-1感染及qRT-PCR檢測 當(dāng)MSCs細(xì)胞融合率達(dá)到50%左右時，進(jìn)行HIV-1感染。于感染后2、4、6、8、10 d分別留取培養(yǎng)細(xì)胞及其上清液備檢。采用探針法和核苷酸膠體染料法qRT-PCR法分別檢測上清液中及細(xì)胞內(nèi)HIV-1 RNA水平。引物序列為：HIV-1(上游引物：STT TTA RYC CAG AAG TAA TAC CCA TGT T；下游引物：GCA GCY TCY TCA TTG ATG GT)；探針序列為：FAM- ACT ATG TCC ACC TGC CAT TAA GCC CGA GA-TAMRA。

2 結(jié) 果

2.1慢病毒載體的構(gòu)建結(jié)果 通過Gateway技術(shù)，將外源基因片段CMV-CD4-IRES-CCR5導(dǎo)入慢病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建的示意圖及其鑒定見圖1。CMV為啟動hCD4基因表達(dá)的啟動子；IRES序列連接hCD4和hCCR5基因，并為hCCR5的啟動子；Puro為抗性基因，Pgk為其啟動子(圖1A)。在100及200 bp的下側(cè)各見一條陽性條帶，與引物設(shè)計的目的片段hCD4和hCCR5的理論大小193 bp和75 bp相對應(yīng)，表明為hCD4和hCCR5的陽性克隆(圖1B)。

A：hCD4/CCR5慢病毒包裝載體結(jié)構(gòu)示意圖；B：瓊脂凝膠電泳結(jié)果，Maker為500 bp

圖1 hCD4/CCR5慢病毒載體結(jié)構(gòu)及鑒定結(jié)果

A：凝膠電泳結(jié)果；B：qRT-PCR結(jié)果；a：Plt;0.01

圖2 MSCs中hCD4/CCR5 mRNA水平的qRT-PCR檢測結(jié)果

2.2hCD4/CCR5的mRNA表達(dá)結(jié)果 轉(zhuǎn)染后MSCs的hCD4和hCCR5 mRNA瓊脂糖凝膠電泳檢測與qRT-PCR結(jié)果見圖2。于100及200 bp標(biāo)準(zhǔn)帶下側(cè)各有1條陽性條帶，與hCD4和CCR5理論大小193 bp和75 bp相對應(yīng)，而空載組(M-V)和未感染組(N-T)未見該陽性條帶(圖2A)；MSCs慢病毒轉(zhuǎn)染后第7、10、14天的qRT-PCR結(jié)果顯示，與N-T組相比，hCD4和hCCR5的mRNA表達(dá)均升高(Plt;0.01)，見圖2B。

圖3 MSCs中hCD4/CCR5蛋白的Western blot檢測結(jié)果

A、B：空白對照組MSCs細(xì)胞形態(tài)的顯微成像結(jié)果；C、D：MSCs感染空載病毒后的熒光結(jié)果；E、F：MSCs轉(zhuǎn)染慢病毒后hCD4分子的熒光顯微成像結(jié)果；G、H：轉(zhuǎn)染后hCCR5分子的熒光成像結(jié)果

圖4 MSCs中hCD4/CCR5的免疫熒光法檢測結(jié)果(×400)

2.3hCD4/CCR5蛋白的表達(dá)結(jié)果 提取MSCs的總蛋白，以β-actin為內(nèi)參，hCD4和hCCR5蛋白的Western blot檢測結(jié)果見圖3。轉(zhuǎn)染后MSCs組(T)可見與CD4和CCR5蛋白已知大小(分別為55.0×103和40.6×103)相符合的陽性條帶，表明MSCs中存在CD4和CCR5蛋白的表達(dá)；而在空載組(M-V)和未感染組(N-T)中，未見該條帶的表達(dá)。

2.4hCD4/CCR5的熒光表達(dá)結(jié)果 hCD4/CCR5的免疫熒光顯微成像結(jié)果見圖4。MSCs轉(zhuǎn)染慢病毒后，在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上可見CD4分子的熒光表達(dá)；在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上可見CCR5分子的熒光表達(dá)。

2.5MSCs細(xì)胞感染HIV-1后HIV-1 RNA的表達(dá)結(jié)果 轉(zhuǎn)染后MSCs細(xì)胞進(jìn)行HIV-1感染，培養(yǎng)細(xì)胞及上清液的HIV-1 RNA檢測結(jié)果見圖5。培上清液的HIV-1 RNA在第2、4、6、8天升高(Plt;0.05)，見圖5A。MSCs細(xì)胞內(nèi)的HIV-1 RNA在第2、6、8天升高(Plt;0.05)，見圖5B。

A：上清液的HIV-1RNA表達(dá)水平；B：細(xì)胞內(nèi)的HIV-1 RNA表達(dá)水平；a:Plt;0.05

圖5 MSCs感染HIV-1后上清液與細(xì)胞內(nèi)

HIV-1 RNA結(jié)果

2.6MSCs誘導(dǎo)成脂、成骨能力的檢測結(jié)果 成脂誘導(dǎo)后，隨著誘導(dǎo)時間的延長，含脂滴細(xì)胞逐漸增多細(xì)胞體積逐漸增大，由原來的長梭形變?yōu)閳A形或多角形(圖6B)。誘導(dǎo)14 d后，脂肪細(xì)胞中含大小不等的脂滴，脂滴被染成橙紅色(圖6C)。成骨誘導(dǎo)后1周，大約80%以上的MSCs形態(tài)不規(guī)則，成為多角形，細(xì)胞基質(zhì)中出現(xiàn)鈣化斑(圖6E)；2～3周時，成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞基質(zhì)形成多層小結(jié)結(jié)構(gòu)，鈣化物形成明顯，并形成鈣化結(jié)節(jié)(圖6F)。圖6A、D則作為空白對照。

A、D：空白對照；B：圓形或多角形含脂滴細(xì)胞；C：脂滴被染成橙紅色；E：細(xì)胞基質(zhì)中出現(xiàn)鈣化斑；F：形成鈣化結(jié)節(jié)

圖6 MSCs誘導(dǎo)成脂、成骨能力的檢測結(jié)果(×400)

3 討 論

MSCs作為基因治療的潛在工具得到很大的關(guān)注[5-6]。對動物移植的大量研究發(fā)現(xiàn)，MSCs具有多項分化潛能，能夠分化為成骨細(xì)胞[7]、軟骨細(xì)胞[8]、心肌細(xì)胞[9]、神經(jīng)細(xì)胞[10]、上皮細(xì)胞[11]、以及造血細(xì)胞[12]。更重要的是，MSCs可以導(dǎo)入外源基因，并保持轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)有效且持續(xù)的長期表達(dá)[13]。近年來在抗HIV感染的各類研究中，基因治療有著快速的發(fā)展[14]。慢病毒載體介導(dǎo)的MSCs不僅是一個新的HIV-1易感的細(xì)胞模型，而且在傳染病的基因治療方面，MSCs基因療法也是一個新的亮點。

慢病毒載體作為一種有效且多用途的基因轉(zhuǎn)移工具，與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，不但能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，而且能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞且能保持持久的轉(zhuǎn)基因表達(dá)?；贖IV-1的慢病毒載體，在轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)導(dǎo)方式上都優(yōu)于其他逆轉(zhuǎn)錄病毒，是目前應(yīng)用研究最廣泛的載體。hCD4分子是一種膜分子，主要表達(dá)于輔助T(Th)細(xì)胞，也是HIV-1入侵細(xì)胞的主要受體[15]；hCCR5，作為G蛋白偶聯(lián)因子超家族(GPCR)成員的細(xì)胞膜蛋白，是細(xì)胞內(nèi)β趨化因子(RANTES、MIP-1α和MIP-1β)的受體，亦是HIV-1入侵機體細(xì)胞的主要輔助受體之一[16]。部分HIV人類細(xì)胞模型是通過加載hCD4和hCCR5建立的，例如TZM-bl細(xì)胞系[17]，是一種基于穩(wěn)定表達(dá)CD4和CCR5基因的人宮頸癌HeLa細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于HIV-1感染的研究。本實驗設(shè)計的慢病毒載體是在CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下含有hCD4和hCCR5基因的慢病毒。

培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞，根據(jù)空載慢病毒載體獲得的最佳MOI結(jié)果進(jìn)行慢病毒載體感染。經(jīng)轉(zhuǎn)染后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，hCD4和hCCR5的條帶與理論大小一致，而qRT-PCR結(jié)果更進(jìn)一步說明可以陽性表達(dá)hCD4和hCCR5 mRNA，并且隨天數(shù)具有增加的趨勢。提取MSCs的蛋白質(zhì)進(jìn)行了Western blot檢測，實驗結(jié)果顯示MSCs中有hCD4和hCCR5蛋白的表達(dá)。免疫熒光的結(jié)果進(jìn)一步顯示hCD4和hCCR5可以在MSCs的細(xì)胞膜上表達(dá)。經(jīng)鑒定成功轉(zhuǎn)染慢病毒后的MSCs仍具有干細(xì)胞的特性，此細(xì)胞模型是可穩(wěn)定表達(dá)外源基因且正常傳代的細(xì)胞株。簡而言之，本實驗中應(yīng)用慢病毒載體，成功地將hCD4和hCCR5導(dǎo)入于MSCs細(xì)胞并實現(xiàn)了高效表達(dá)。

本研究中所制備的高效表達(dá)hCD4/hCCR5的MSCs細(xì)胞，主要是應(yīng)用于HIV-1易感細(xì)胞模型研究。HIV-1主要侵犯人體的CD4+T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，其感染過程包括病毒的吸附、侵入、逆轉(zhuǎn)錄、基因組的整合、表達(dá)及釋放等過程[18]。轉(zhuǎn)染慢病毒后的MSCs細(xì)胞，可以高效地表達(dá)hCD4和hCCR5蛋白，也就是說具備了HIV-1感染的受體與輔助受體，為HIV-1的入侵感染準(zhǔn)備了基本條件。通過HIV-1對研制的MSCs細(xì)胞的感染驗證，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示其培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中均可以檢測到HIV-1 RNA，這證實HIV-1可感染本研制的MSCs細(xì)胞，并且HIV-1在細(xì)胞內(nèi)能整合和實現(xiàn)病毒完整的復(fù)制。

綜上所述，本研究通過慢病毒載體成功且高效地將CD4和CCR5基因轉(zhuǎn)入MSCs中，并證實這種轉(zhuǎn)基因的MSCs可以支持HIV-1的有效入胞、整合和復(fù)制。一種新的可以穩(wěn)定表達(dá)hCD4/CCR5的細(xì)胞模型成功建立，作為HIV-1的宿主細(xì)胞，這種細(xì)胞模型對HIV/AIDS的發(fā)病機制及治療的進(jìn)一步研究有很大的幫助。

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EstablishmentofamesenchymalstemcellsmodelstablyexpressinghCD4andhCCR5*

LiYajing1,2，ZhuGeFuyan3，LiangJuan2，HeJinyang4，TanNing5，ZengChangchun1,2△

(1.AffiliatedLonghuaCentralhospital,GuangdongMedicalUniversity,Shenzhen,Guangdong518110,China;2.SchoolofBiomedicalTechnology,GuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541004,China;3.SchoolofLifeSciences,SunYat-SenUniversity,Guangzhou,Guangdong510275,China;4.TropicalMedicineInstitute,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510405,China;5.GuangxiKeyLaboratoryofMolecularMedicineinLiverInjuryandRepair,GuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541004,China)

ObjectiveTo establish a kind of mesenchymal stem cells(MSCs) model that could express hCD4 and hCCR5 to study the field of human immunodeficiency virus type 1(HIV-1).MethodsLentiviral vectors containing the genes of hCD4 and hCCR5 under the transcriptional control of cytomegalovirus promoter were designed.MSCs were transfected by the lentiviral vectors at optimum multiplicity of infection.Transduction efficiencies of hCD4 and hCCR5 in MSCs were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction(RT-PCR),Western blot,and immunofluorescence staining.Subsequently,the transfected human MSCs were infected with HIV-1,and the expression of HIVRNA in the MSCs was detected by RT-PCR.ResultsThe MSCs model containing hCD4 and hCCR5 and supporting normal HIV-1 infection was constructed.qRT-PCR showed that MSCs upon infection with lentiviral vectors were highly expressed in hCD4 and CCR5 mRNA sequences(Plt;0.01).Western blot detection showed the positive bands of 55.0×103(hCD4) and 40.6×103(hCCR5).The results of immunofluorescence staining revealed that hCD4 and CCR5 were expressed on the surface of MSCs.Such results were not found in cells infected with empty lentiviral vectors.And the susceptibility of the hCD4/CCR5 transgenic MSCs to the HIV-1 was further indicated by the detection of HIV-1 RNA in the culture supernatants and cell lysates(Plt;0.05).ConclusionThe MSCs model that could highly express hCD4 and hCCR5 was established to support normal HIV-1 infection,which can be used to investigate the development of new therapies and vaccines against HIV.

mesenchymal stem cells;HIV-1;cell model;human CD4 and CCR5;gene expression

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.001

國家自然科學(xué)基金資助項目(81660755；81573861)；深圳市科技計劃項目(JCYJ20170307160524377)。

李雅婧(1993-)，碩士，主要從事HIV跨物種感染研究?！?/p>

，E-mail:373821547@qq.com。

R-331;R373.9

A

1671-8348(2017)32-4465-04

2017-04-18

2017-06-16)