馬鵬飛，韓生華

（山西大同大學化學與環(huán)境工程學院，山西省大同市 037009）

RAFT沉淀法制備殺蟲脒分子印跡聚合物及其應用

馬鵬飛，韓生華

（山西大同大學化學與環(huán)境工程學院，山西省大同市 037009）

采用可逆加成-斷裂鏈轉移技術結合分子印跡沉淀聚合法，以殺蟲脒（CD）為模板分子，二芐基三硫代碳酸酯（DBTTC）為試劑，制備CD印跡聚合物（R-MIP）?？疾炝巳軇┘皢误w與偶氮二異丁腈和DBTTC的比例對聚合物形貌的影響，并對其吸附性能進行了研究。結果表明：條件優(yōu)化后制備的R-MIP微球粒徑均一，分散性好，對目標分子有良好的特異識別性，且吸附量高于傳統(tǒng)法；將其作為固相萃取填料，結合高效液相色譜法對蜂蜜中CD進行分離，富集，檢測，加標回收率為88.3%～99.2%，相對標準偏差小于 4.7%，測定下限為0.37 μg/kg。

分子印跡聚合物 可逆加成-斷裂鏈轉移 殺蟲脒 分子印跡技術 固相萃取

殺蟲脒（CD）具有高效廣譜殺蟲和殺螨作用，廣泛應用于棉花、水稻、茶樹和果蔬等蟲害防治［1-2］。CD及其主要代謝產(chǎn)物4-氯鄰甲苯胺對脫氧核糖核酸有損傷和誘變作用，對人體具有潛在的致癌性，世界上部分國家將其列為禁用農(nóng)藥。國家質檢總局規(guī)定蜂蜜中CD及其代謝產(chǎn)物的最大殘留限量不超過0.50 mg/kg［3-4］；美國規(guī)定動物組織中CD的最大殘留限量為0.05～0.25 mg/kg；日本規(guī)定動物源食品中CD的最大殘留限量為0.01 mg/kg；秘魯規(guī)定牛脂肪、肉及肉制品中CD的最大殘留限量為0.50 mg/kg［4］。目前，CD檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法、氣相色譜-質譜聯(lián)用法等［5-11］，試樣前處理存在需要衍生化、操作繁瑣、耗時長、穩(wěn)定性差等問題。

分子印跡技術具有特異識別性，被廣泛應用于分子識別、色譜分離、生物免疫等領域［12-13］，但存在聚合不可控性，識別性能受限?？赡婕映?斷裂鏈轉移（RAFT）自由基聚合法是一種可控自由基聚合法，通過增長自由基向RAFT試劑的可逆鏈轉移而達到調節(jié)自由基聚合，從而提高對目標物的特異性吸附。本工作以CD為模板，二芐基三硫代碳酸酯（DBTTC）為試劑，采用RAFT沉淀法制備CD分子印跡聚合物（R-MIP），并將其作為固相萃取柱填料，利用液相色譜法對試樣中CD進行分離測定，研究分離效果和回收率。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TECNAI G2 F20型透射電子顯微鏡，美國FEI公司生產(chǎn)；Nicolet-6700型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo公司生產(chǎn)；L2型可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司生產(chǎn)；LC-10ATvp型高效液相色譜儀，日本島津公司生產(chǎn)；ZHWY-200D型多軌道恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器有限公司生產(chǎn)。

CD，純度為95%；α-甲基丙烯酸（MAA），純度為98%；二甲基丙烯酸乙二酯（EDMA），分析純，純度為98%；引發(fā)劑偶氮二異丁腈（AIBN），分析純，純度為98%；乙腈，色譜純：均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。甲醇，CS2，四正丁基溴化銨（TBAB）：均為分析純，購自天津科密歐公司。

1.2 RAFT試劑的合成

取20 mL質量分數(shù)為33%的NaOH溶液和20 mL CS2置于圓底燒瓶中，攪拌混勻，20 min后加入TBAB 0.2 g，攪拌10 min，緩慢加入2 mL氯化芐，于25 ℃反應24 h，將反應產(chǎn)物全部轉移到100 mL分液漏斗中，靜置分層后，取上層溶液置于比色管中。下層溶液用20 mL CS2反復萃取3次，合并上層溶液，調節(jié)pH值為中性后，用無水硫酸鈉干燥24 h，減壓蒸餾CS2，得到結晶產(chǎn)物即DBTTC［15］。

1.3 印跡聚合物和非印跡聚合物的制備

在50 mL體積比1∶1的甲醇與乙腈混合溶液中加入模板分子CD 0.234 6 g，加入功能單體MAA 100 μL，于室溫靜置12 h，依次加入交聯(lián)劑EDMA 10 mL，引發(fā)劑AIBN 100 mg，RAFT試劑DBTTC 100 mg，超聲使其充分溶解后通入氮氣30 min后封口。置于搖床中以300 r/min的速率，于60 ℃振蕩24 h，以800 r/min離心分離獲得聚合物，用無水乙醇及去離子水分別超聲洗滌3次，以體積比為1∶9的乙酸與甲醇混合溶液采用索氏提取法抽提至洗脫液無色，真空干燥，所得產(chǎn)物即為R-MIP，化學反應式見圖1。

除不添加模板分子CD外，按上述方法同時制備非印跡聚合物（記作R-NIP）；除不添加DBTTC外，按上述方法同時制備傳統(tǒng)印跡聚合物（記作T-MIP）與傳統(tǒng)非印跡聚合物（記作T-NIP）。

圖1 R-MIP合成原理Fig.1 Principle of R-MIP synthesis

1.4 吸附性能研究

聚合物靜態(tài)等溫吸附：取20 mg R-MIP和R-NIP，向其加入10 mL質量濃度為5～50 μg/mL的CD溶液，靜置12 h。測定上層清液中CD的質量濃度，按式（1）計算聚合物的吸附量。

式中：Q為聚合物的吸附量，μg/g；C0為CD的初始質量濃度，μg/mL；Ce為CD的平衡質量濃度，μg/mL；V為吸附溶液的體積，mL；m為聚合物的質量，g。

吸附動力學實驗：取20 mg R-MIP和T-MIP，分別加入50 μg/mL的CD溶液10 mL，0.25～2.00 h后檢測吸光度，計算R-MIP和T-MIP的吸附量。以吸附量對時間作圖，得到R-MIP和T-MIP的吸附動力學曲線。

選擇性吸附實驗：稱取50 mg R-MIP與50 mg R-NIP各6 phr，分別與100 μg/mL的CD溶液混合后靜置12 h，研究其選擇性吸附性能。

1.5 固相萃取性能評價

固相萃取柱制備：稱取100 mg R-MIP，均勻裝填入固相萃取空柱管中，通過篩板固定填料，制備印跡聚合物固相萃取柱。萃取條件：以3 mL體積比為9∶1的甲醇與乙酸混合溶液活化或洗脫印跡聚合物固相萃取柱，用5 mL乙腈淋洗。

高效液相色譜（HPLC）檢測：稱取5 g（精度0.1 mg）市售蜂蜜（如荔枝蜜、雜花蜜及野蜂蜜）置于50 mL離心管中，再加入10 mL乙腈和5 g酸性氧化鋁，振蕩混勻，超聲提取30 min后，以10 000 r/min離心分離10 min，將上層清液移入50 mL容量瓶中。再用5 mL乙腈超聲萃取殘渣2次，合并上層清液于容量瓶中，用去離子水定容后，取5 mL試樣，經(jīng)印跡聚合物固相萃取柱固相柱處理。檢測波長為618 nm，流動相為體積比為55∶45的甲醇與水混合溶液，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。

2 結果與討論

2.1 合成產(chǎn)物的紅外表征

從圖2可以看出：CD標準品3 400 cm-1處為羥基的伸縮振動吸收峰，1 550 cm-1處為C C的骨架振動吸收峰，1 000 cm-1處為磷酸酯P O和C—O的伸縮振動吸收峰。與CD標準品相比，其他3個試樣在1 000 cm-1處的波峰明顯減弱，這與反應過程中磷酸酯P O鍵的變化有關，說明CD成功植入分子印跡體系。與洗脫前R-MIP以及空白對照R-NIP對比，洗脫后R-MIP在3 400，1 550 cm-1處的吸收峰變尖銳，且在1 200 cm-1處出現(xiàn)明顯的羥基面內彎曲振動吸收峰。這是因為在R-NIP中，羥基主要和C O之間形成氫鍵，在R-MIP中羥基不僅與C O形成氫鍵，還與PO形成氫鍵，R-MIP洗脫之后這部分氫鍵從締合態(tài)恢復游離態(tài)，使羥基吸收峰變得尖銳，表明CD已經(jīng)被很好的洗脫。

圖2 試樣的傅里葉變換紅外光譜Fig.2 FTIR spectra of chlordimeform，R-NIP（PA）after elution，R-MIP before elution， R-MIP after elution

2.2 聚合物制備條件選擇

2.2.1 溶劑對R-MIP形貌的影響

從圖3看出：以甲醇或乙腈為溶劑時，制備的R-MIP形態(tài)特征呈團聚和絮狀；而以體積比為1∶1的甲醇與乙腈混合溶液為溶劑時，制備的R-MIP形態(tài)特征為分散狀微球，且粒徑均勻。這也許是乙腈的較強極性使CD可以較好地在乙腈中溶解，同時極性較強也易影響印跡分子、功能單體與模板分子之間的相互作用力，但以體積比為1∶1的甲醇與乙腈混合溶液為溶劑時，既可促進CD的溶解，又不影響CD與單體之間的相互作用力。

圖3 不同溶劑時制備的印跡聚合物的掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM images of R-MIP prepared by different solvents

2.2.2 V（MAA+EDMA）∶V（AIBN）∶V（DBTTC）對R-MIP形貌的影響

從表1看出：當V（MAA+EDMA）∶V（AIBN）∶V（DBTTC）比為100.0∶1.0∶1.0時，R-MIP呈分散狀微球，且粒徑均勻；當V（MAA+EDMA）∶V（AIBN）∶V（DBTTC）比為100.0∶0.5∶1.0時，R-MIP呈微球狀，粒徑小且黏連，當引發(fā)劑過少時，無法引發(fā)催化反應可導致R-MIP呈黏連狀微球；當V（MAA+EDMA）∶V（AIBN）∶V（DBTTC）比為100.0∶1.0∶0.5時，R-MIP呈微球狀，粒徑小且黏連，可能是因為DBTTC量較少，不能有效調節(jié)微球相分離，使R-MIP呈黏連狀。因此，V（MAA+EDMA）∶V（AIBN）∶V（DBTTC）選擇100.0∶1.0∶1.0。

表1 不同溶劑時制備R-MIP的合成條件及其形貌特征Tab.1 Synthetic conditions and morphology of polymers prepared in dif f erent solvents

傳統(tǒng)方法制備的聚合物粒徑小，且粒徑分布寬；RAFT法制備的聚合物微球分散，粒徑均一，因為DBTTC調節(jié)RAFT反應，控制自由基聚合速率，使鏈轉移后，反應體系中自由基數(shù)目保持平衡，鏈增長呈勻速緩慢增長，從而得到均勻微球。

2.3 靜態(tài)吸附性能

從圖4看出：聚合物的吸附量隨著CD質量濃度增加而增大，且在考察濃度范圍內，印跡聚合物的吸附量始終大于非印跡聚合物。由于印跡聚合物中存在與模板分子相匹配的立體空穴，能夠有效吸附模板分子，而R-MIP的吸附量高于T-MIP是由于RAFT法制備的可控性，使印跡聚合物微球分散性好，粒徑均勻，因此有較高吸附量。

圖4 聚合物的等溫吸附曲線Fig.4 Isothermal adsorption curves of polymers

2.4 吸附動力學研究

從圖5看出：在開始的200 min內，吸附速率較快；隨反應時間的延長，吸附量增加緩慢，并趨于穩(wěn)定。吸附量在開始快速增加的原因是R-MIP表面存在大量印跡空穴吸附位點，吸附交換的速率較快。隨時間的延長，R-MIP表面印跡空穴吸附位點逐漸被CD占用，使吸附速率下降，最終達到飽和。

2.5 選擇性吸附研究

圖5 R-MIP的吸附動力學曲線Fig.5 Adsorption kinetics curve of R-MIP

為考察印跡聚合物對CD的特異識別性，選擇與CD結構相類似的1-（4-氯苯基）哌嗪和2-（3-氯苯基）哌嗪作為競爭吸附底物，用吸附量和印跡因子（α，α=QMIP/QNIP，其中，QMIP與QNIP分別代表MIP和NIP的吸附量）來評價聚合物的特異識別性能，從表2可以看出：MIP對CD的吸附量遠大于對1-（4-氯苯基）哌嗪和2-（3-氯苯基）哌嗪的吸附量。這主要是因為MIP中具有與CD相匹配的“記憶空穴”，由此導致MIP對CD具有良好的特異識別性（α=2.91）。NIP對三者的吸附量接近。

表2 選擇性吸附數(shù)據(jù)Tab.2 Selective adsorption data

2.6 分析方法的建立及實際應用

以R-MIP為固相萃取柱填料，利用HPLC對實際試樣（荔枝蜜、雜花蜜、野蜂蜜）中CD進行分離測定。從圖6可以看出：實際試樣中的CD經(jīng)R-MIP固相萃取萃取凈化后，雜質被有效去除，CD出峰時間6.57 min處未見雜質峰干擾，對目標分子CD具有較好的富集凈化作用。經(jīng)HPLC測定，雜花蜜中檢測出的CD含量最高，為1.27 μg/kg，其他試樣均未檢測出CD，這可能是雜花蜜中含有噴灑了 CD農(nóng)藥的花粉，從而導致雜花蜜中有CD殘留。

圖6 3種蜂蜜試樣的分析色譜Fig.6 Chromatogram of three honey samples

為驗證所建立方法的精密度和準確度，對荔枝蜜、雜花蜜、野蜂蜜試樣進行加標回收率（指在沒有被測物質的空白試樣中加入定量標準物質，按試樣的處理步驟分析，得到的結果與理論值的比值）實驗，從表3看出：標準物質質量濃度為0.5～2.0 μg/L時，加標回收率為88.3%～99.2%，相對標準偏差（RSD）小于4.7%（平行實驗次數(shù)為3次），具有較高的準確度和精密度。以3倍的信噪比計算，CD的測定下限為0.37 μg/kg。說明以R-MIP為固相萃取填料時，可有效分離CD，而且具有回收率高、RSD小，符合方法學指標。

表3 蜂蜜試樣中加標回收率Tab.3 Recoveries of samples with standard addition in honey

3 結論

a）采用RAFT技術結合分子印跡沉淀聚合法，以CD為模板分子，DBTTC為試劑，制備了R-MIP，確定了最優(yōu)制備條件：溶劑為體積比為1∶1的甲醇與乙腈混合溶液，V（MAA+EDMA）∶V（AIBN）∶V（DBTTC）為100.0∶1.0∶1.0。

b）與傳統(tǒng)方法制備的印跡聚合物相比，本方法制備的印跡聚合物粒徑均一、分散性好、對目標分子有良好的特異識別性，且吸附量高。將其作為固相萃取填料，結合HPLC對蜂蜜中的CD進行分離，富集，檢測。加標回收率為88.3%～99.2%，RSD＜4.7%，具有較高的準確度和精密度。

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Preparation and application of chlordimeform molecularly imprinted polymer via RAFT precipitation polymerization

Ma Pengfei， Han Shenghua
（School of Chemistry and Chemical Engineering， Shanxi Datong University， Datong 037009， China）

The chlordimeform（CD）molecularly imprinted polymers（R-MIP）were synthesized via reversible addition-fragmentation chain transfer（RAFT）and molecularly imprinting precipitation polymerization， with CD as template molecule and dibenzyltrithiocarbonate（DBTTC）as solvent. The influences of the solvent and the ratio of monomer/azobisisobutyronitrile/DBTTC on the morphology of the polymer were observed. The adsorption properties of the polymer were studied as well. The results indicate that R-MIP microspheres synthesized under the optimized conditions have uniform particle size， good dispersibility and specific recognition selectivity to target molecules， whose adsorption is higher than that of traditional method.The polymer is used as solid phase extraction material for separation， enrichment， and detection of CD in honey coupled with high performance liquid chromatography. The recoveries of the method ranges from 88.3% to 99.2%， with relative standard deviation less than 4.7%. The lower limit of detection is 0.37 μg/kg.

molecularly imprinted polymer； reversible addition-fragmentation chain transfer；chlordimeform； molecularly imprinting； solid-phase extraction

O 652.6

B

1002-1396（2017）06-0025-05

2017-07-28；

2017-09-15。

馬鵬飛，男，1978年生，本科， 2003年畢業(yè)于北京化工大學高分子材料和化學工程專業(yè)，研究方向為高分子化學。E-mail：dtdxgxl@126.com。

國家自然科學基金（21506120），山西大同大學科學基金項目（2016K5）。