烏云，劉紅霞，李洪亮，母智深

（內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，內蒙古呼和浩特011500）

雙歧桿菌的分離鑒定及保藏性能研究

烏云，劉紅霞，李洪亮，母智深*

（內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，內蒙古呼和浩特011500）

為豐富發(fā)酵劑及益生菌菌種資源，從內蒙古阿拉善盟采集7份新生嬰兒糞便樣品，在傳統(tǒng)細菌分離方法的基礎上，通過添加莫匹羅星鋰鹽和X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）改良基礎培養(yǎng)基，快速有效地分離獲得雙歧桿菌。結合全自動微生物分析系統(tǒng)和API20A試劑條鑒定菌種。結果共分離獲得6株雙歧桿菌，其中3株動物雙歧桿菌，2株青春雙歧桿菌，1株短雙歧桿菌。試驗驗證甘油濃度為70%時冷凍保藏效果最佳。

雙歧桿菌；全自動微生物分析系統(tǒng)；API20A試劑條；冷凍保藏

雙歧桿菌是存在于人體腸道中的益生菌，在長期進化過程中與宿主形成了互惠共存的關系，具有改善腸道健康、增強免疫功能、防治便秘腹瀉、緩解乳糖不耐、促進營養(yǎng)物質吸收、降三高和抗腫瘤等多種保健功能[1-4]。在食品領域，衛(wèi)生部文件將其列入《可用于食品的菌種名單》、《可用于保健食品的菌種名單》及《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》，現今市場上已有益生菌發(fā)酵飲料、益生菌酸奶、益生菌奶粉奶片等多種品類。在臨床上，雙歧桿菌活菌制劑已經廣泛應用于腹瀉和便秘等腸胃疾病的治療[5]。雙歧桿菌類益生菌產品日益得到消費者的追捧，分離篩選一些優(yōu)秀的雙歧桿菌是該類產品開發(fā)應用的基礎。

不同細菌具有各自特有的酶系統(tǒng)，對各種營養(yǎng)物質的代謝能力也不盡相同，通過生理生化反應測試區(qū)分鑒別細菌的種屬是細菌鑒定的最原始手段。全自動微生物分析系統(tǒng)，即是由傳統(tǒng)檢測鑒定技術與現代計算機技術相結合，運用概率最大近似值模型法計算，儀器自動鑒定的技術[6-7]。目前，梅里埃Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)，西門子MicroScan Walk Away 96 plus全自動微生物鑒定系統(tǒng)，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）開始普遍應用于輔助醫(yī)療、衛(wèi)生防疫、疾病控制等諸多方面，在食品工業(yè)中的應用也正在興起[8-11]。代敏等采用常規(guī)生化鑒定法、全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定法和16S rDNA序列分析法對120株奶牛乳腺炎病原菌進行鑒定，比較分析了3種鑒定方法的優(yōu)缺點[12]。研究結果顯示，全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定法自動化程度高，比常規(guī)生化鑒定法簡便快捷，鑒定效率高，但部分陽性菌株的鑒定率較低。而16S rDNA序列分析技術可以對難以鑒定的種屬進行鑒定，但易受PCR擴增和測序等操作技術的影響，對測試人員專業(yè)性要求較高。劉瀟憶等討論了原料乳中幾項微生物指標的鑒定方法，提出快速檢測和鑒定原料乳中微生物是保證產品品質的首要保障，全自動微生物分析系統(tǒng)是食品安全檢測體系中快速有效的工具[13]。

雙歧桿菌是嚴格厭氧菌，從多菌共存樣品中分離較為困難。本研究以7名新生嬰兒糞便樣品為菌種來源，通過添加莫匹羅星鋰鹽抑制一些腸道細菌，添加X-Gal區(qū)分菌落色澤快速有效地分離獲得雙歧桿菌[14]，應用Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)和API20A試劑條鑒定菌種，以期為日后的研究和應用提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品來源

從內蒙古阿拉善盟共采集7份新生兒糞便樣品作為試驗樣本。詳細樣本信息見表1。

表1 樣品來源嬰兒信息表Table 1 Sample source information sheet

1.1.2 培養(yǎng)基及緩沖溶液

分離純化培養(yǎng)基：改良TPY/BS瓊脂培養(yǎng)基（莫匹羅星鋰鹽添加量為50 mg/L，X-Gal添加量為60 mg/L）；

活菌計數培養(yǎng)基：TPY瓊脂培養(yǎng)基；

增菌培養(yǎng)基：TPY液體培養(yǎng)基；

鑒定培養(yǎng)基：哥倫比亞血平板；

緩沖蛋白水溶液（每升）：10 g蛋白胨，5 g NaCl，2 g Na2HPO4，2 g KH2PO4[15]。

1.1.3 儀器設備

SVE-6A1超凈工作臺：新加坡ESCO公司；DM 2500顯微鏡：德國LEICA公司；HV-110高壓滅菌器：日本HIRAYAMA公司；U410-86超低溫冰箱：英國NEW BRUNSWICK公司；Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)、API 20A試劑條、厭氧盒及厭氧袋：法國梅里埃公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理

樣品采集：使用無菌旋蓋離心管采集7份新生兒糞便樣品，取樣時應避免樣品暴露于空氣中，離心管旋蓋擰松正置于試管架上放入厭氧盒中，盡量短的時間內帶回實驗室進行分離。

樣品稀釋：稱量1 g糞便樣品溶解于99 mL緩沖蛋白水溶液中，用十倍稀釋法制備10-3～10-6樣品稀釋液。

1.2.2 雙歧桿菌的分離純化

取10-3～10-6樣品稀釋液0.1 mL涂布于添加莫匹羅星鋰鹽和X-Gal的改良TPY/BS瓊脂平板，倒置于厭氧盒37℃培養(yǎng)48 h～72 h。挑取藍色菌落進行耐氧試驗，選擇只在厭氧條件下生長的菌落劃線純化2代～3代，挑單菌落接種于TPY液體培養(yǎng)基中（上層用液體石蠟隔離空氣），37℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.2.3 菌種鑒定

形態(tài)學鑒定：菌株進行革蘭氏染色，油鏡觀察菌體顏色、形態(tài)、排列情況等特征，初步鑒定為雙歧桿菌。

Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定：上機前先確保菌株純培養(yǎng)，從TPY平板上挑取一個單菌落劃線于哥倫比亞血平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。無菌棉簽蘸取菌落研磨在0.45%NaCl溶液中配成2.7 McF～3.0 McF菌懸液，選擇厭氧菌鑒定卡（ANC卡）上機測試。

API20A試劑條鑒定：挑單菌落劃線于TPY平板上，挑菌落制成3.0 McF菌懸液，按要求加入試驗條管并用石蠟油覆蓋封口，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，分別在24 h和48 h后判讀結果，借助鑒定軟件進行分析。

1.2.4 菌種保藏性能評價

雙歧桿菌接種到TPY液體培養(yǎng)基中增菌，37℃培養(yǎng)48 h→離心沉淀法收集菌體（4 000 r/min，10 min）→棄去上層清液，下層菌液與純甘油按不同比例進行混合，反復吹吸使充分包裹→分裝于無菌凍存管，每管1 mL→置于-80℃冰箱中保藏→定期取管測活菌數。

存活率/%=凍存數天后的活菌數/凍存前的活菌數×100

1.2.5 活菌計數方法

用緩沖蛋白水溶液進行10倍梯度稀釋，TPY平板傾注，37℃厭氧培養(yǎng)48 h～72 h。每個稀釋梯度做3個平行，計算菌落的平均數?；罹鷶?菌落平均數×稀釋倍數。

2 結果與討論

2.1 菌落及細胞形態(tài)觀察

2.1.1 菌落形態(tài)及顯色情況

分離前先對比了雙歧桿菌在TPY、BS和MRS瓊脂平板上的生長情況，雙歧桿菌菌懸液涂布培養(yǎng)時菌落直徑 dBS＞dMRS＞dTPY，但活菌數 QTPY＞QBS＞QMRS，因此選擇改良TPY瓊脂培養(yǎng)基進行分離。分離平板上菌落呈現深藍色、淺藍色、白色3種顏色。培養(yǎng)基中添加了莫匹羅星鋰鹽，可以抑制樣品中大腸桿菌、腸球菌和其它腸道細菌的生長，但不影響雙歧桿菌的生長。在嚴格厭氧的條件下培養(yǎng)，雙歧桿菌生長良好，有效的利用X-Gal釋放吲哚使菌落變藍色[16-17]。7份樣品共挑選36個藍色菌落進行耐氧試驗，共獲得9株只在厭氧條件下生長的菌株。TPY平板劃線純化后觀察，菌落微小（直徑0.37 mm～0.54 mm）、圓形、凸起、表面光滑且邊緣整齊，呈乳白色或半透明。分離純化顯色情況及菌落形態(tài)見圖1。

圖1 分離顯色情況及菌落形態(tài)Fig.1 Separation of color and colony morphology

2.1.2 雙歧桿菌鏡檢細胞形態(tài)

挑單菌落涂片進行革蘭氏染色，油鏡下觀察呈現為多形態(tài)桿菌，有長桿、短桿、Y型菌、X型菌、V型菌同時存在，有的一端大呈棒狀，9株疑似菌株鏡檢形態(tài)見圖2。

圖2 分離菌株鏡檢形態(tài)Fig.2 Specimens of the isolate strain

2.2 全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定結果

采用Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定菌種，較傳統(tǒng)生化鑒定方法具有操作簡單、報告詳細、降低人為誤差、準確度高等優(yōu)點，且試驗用時較短，可在3 h～6 h之內出具鑒定分析報告。9株疑似菌株的Vitek 2 Compact鑒定結果見表2。

表2 分離菌株Vitek 2 Compact鑒定結果Table 2 Vitek 2 Compact identification results of the isolate strains

全自動微生物分析系統(tǒng)的生化鑒定是根據不同微生物的理化性質不同，采用光電比色法，測定微生物分解底物導致pH值變而產生的不同顏色，來判斷反應的結果，一旦鑒定卡內的終點指示孔到達臨界值，則指示此卡已完成鑒定[18]。在鑒定過程中，每10分鐘進行一次比色偵測，讀取顏色改變并繪制建立反應曲線，系統(tǒng)最后一次讀數后，將所得的生物數碼與菌種數據庫標準菌的生物模型相比較，得到相應系統(tǒng)鑒定值（ID值），按此值的大小對檢測可信度作出評價。在每個菌群中，按ID值大小順序排列，若概率百分比為85%～99%，鑒定結果是可以接受的，而概率百分比小于85%時為不可接受的鑒定。其中96%～99%為“極好的鑒定”，93%～95%為“非常好的鑒定”，89%～92%為“好的鑒定”，85%～88%為“可接受的鑒定”。數值越接近99%，表示越接近特定菌的典型模式[19]。9株疑似菌鑒定，除E3未鑒定出結果外，其余8株菌的鑒定可信度均大于85%，是可接受的鑒定結果。

Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)完成菌種鑒定的同時，可提供36種生理生化反應結果，為菌株特性研究提供參考。鑒定分析報告顯示，6株雙歧桿菌的生化反應不盡相同，詳見表3。

表3 6株雙歧桿菌的生化反應結果Table 3 Biochemical reactions of 6 bifidobacterum

2.3 API20A試劑條鑒定結果

然而，Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)數據庫中菌種數量有限，只能鑒定到雙歧桿菌屬，需要借助API20A試劑條進一步區(qū)分，確定其“種”分類學地位。

API20A試劑條是針對厭氧菌的鑒定系統(tǒng)，可以將雙歧桿菌鑒定到種。分離菌株API20A鑒定結果見表4。

表4 分離菌株API20A鑒定結果Table 4 Identification results of API20A

API20A試劑條是厭氧菌鑒定的工具，原理是通過還原糖顯色反應判斷菌種代謝糖的能力，通常測試時間為24 h～48 h。測試需先通過肉眼觀察顏色反應，記錄數據，再應用軟件與數據庫中典型菌株進行比對，確定鑒定結果[20]。ID%＞80.0%的鑒定結果是可以接受的，其中ID%≥9.9%為“極好的鑒定”，ID%≥99.0%為“很好的鑒定”，ID%≥90.0%為“好的鑒定”，ID%≥80.0%為“可接受的鑒定”。數值越接近99.9%，表示越接近特定菌的典型模式。6株菌的鑒定可信度均大于90.0%，結果可信。

2.4 保藏性能研究

菌種保藏時通常選擇甘油作為保護劑，因為甘油分子的羥基可與菌體表面的自由基聯結，阻斷菌體直接暴露；另外甘油中的小分子能滲透到菌體細胞內部，減少細胞的脫水收縮抑制冰晶形成，從而起到保護作用[21]。冷凍保藏期間甘油對活菌數的影響見表5，保存期間菌株的存活率見表6。

表5 不同濃度甘油保存期間活菌數對數值Table 5 Number of bacteria in different storage conditions

表6 冷凍保藏期間菌株的存活率Table 6 Survival rate of strains during the preservation

根據表5，菌株保存期間活菌數有不同程度地減少，行數據顯著性分析結果顯示，甘油濃度小于70%時，活菌數隨保存時間的變化顯著，而甘油濃度大于70%時，變化不顯著。說明當甘油濃度大于70%時，冷凍保藏可以保證較高的活菌數，達到很好的保護效果。列數據顯著性分析結果顯示，甘油濃度小于70%時，不同濃度甘油的保護效果差異顯著；而甘油濃度大于70%時，差異不顯著。冷凍保藏期間菌株的存活率見表6。

表6更直觀地體現出菌株保存期間存活率的變化情況，存活率與甘油濃度呈線性關系，甘油濃度越大，對菌種的保護性越好。甘油濃度大于70%時，冷凍保藏 120 d 活菌數仍高達 1×109～2×109，存活率在 90%以上；甘油濃度小于70%時，活菌數下降迅速，存活率較低。雖然甘油濃度越高保護效果越好，但濃度過高時，保護液的黏度較高，試驗操作時很難使菌體分散均勻，影響保存效果。因此認為70%甘油對雙歧桿菌的保護效果最佳，菌種于-80℃凍藏120 d后仍能有效活化，且活菌數高達 2×109。

3 結論

雙歧桿菌對生長條件及營養(yǎng)的要求較苛刻，從多菌混合樣品中分離獲得雙歧桿菌難度較大，分離培養(yǎng)基中除含有豐富的維生素、氨基酸、糖類及緩沖鹽類等必需營養(yǎng)物質外，還需要添加雙歧桿菌增殖因子L-半胱氨酸。另外，通過添加莫匹羅星鋰鹽來抑制其他微生物的生長，并結合X-Gal的顯色作用快速準確的分離獲得雙歧桿菌。經鑒定，共分離獲得6株雙歧桿菌，其中3株動物雙歧桿菌，2株青春雙歧桿菌，1株短雙歧桿菌。

菌株鑒定過程中，首先選擇全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定法，該方法自動化水平高、操作簡便、用時較短、試驗報告非常詳細。但其數據庫有局限性，雙歧桿菌只能鑒定到屬水平，需要結合API試劑條補充鑒定。API試劑條數據庫較Vitek 2 Compact數據庫菌株豐富，但需要繁雜的人工操作，觀察時間長且肉眼觀察誤差較大。而先進的分子生物學技術從基因水平鑒定細菌種屬，快速準確，但所需試劑和儀器昂貴，對操作人員專業(yè)性要求較高，企業(yè)廣泛推行難度較大。因此，希望能盡快擴充全自動微生物分析系統(tǒng)的數據庫，以便更好地應用在微生物檢測鑒定領域。

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Isolation，Identification of Bifidobacterium and Preservation Ability Research

WU Yun，LIU Hong-xia，LI Hong-liang，MU Zhi-shen*
（Inner Mongolia Mengniu Dairy（Group）Co.，Ltd.，Huhhot 011500，Inner Mongolia，China）

In order to enrich more types of leavening agents and probiotics resources，faeces collected from seven infants（Alashan，Inner Mongolia）were investigated.On the basis of traditional bacterial separation method，Mupirocin lithium salt and X-Gal were added to the basic medium，to separate the bifidobacterium effectively.Automatic microorganism analytical system and API20A reagent strip were applied to identify the bifidobacterium.In total，six strains of bifidobacterium were obtained from infacts'faeces，among which three strains were Bifidobacterium lactis，two strains were Bifidobacterium adolescentis，and one strain was Bifidobacterium breve，and the optimum storage condition for the bifidobacterium is 70%glycerol.

Bifidobacterium；automatic microorganism analytical system；API20A reagent strip；freezing preservation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.033

內蒙古科技項目（201502056）

烏云（1988—），女（蒙古），工程師，碩士，研究方向：乳制品加工、乳酸菌研究。

*通信作者：母智深（1968—），男，教授，博士，研究方向：乳與乳制品加工、食品微生物、食品功能性成分。

2017-09-13