李艷

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

自選釀酒酵母（KDLYS9-3）產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶動力學(xué)研究

李艷1，2

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

自選高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的釀酒酵母（KDLYS9-3）在葡萄酒釀造過程中具有增強(qiáng)香氣的效果。依據(jù)菌體生長和產(chǎn)酶試驗(yàn)，利用Logistic方程、DoseResp方程和Nelder方程建立了菌體生長和產(chǎn)酶，以及菌體生長速率與酶生成速率之間關(guān)系的動力學(xué)模型，通過Origin8.0軟件進(jìn)行非線性擬合，并利用Lineweaver-Burk法作圖測定了該菌所產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的動力學(xué)參數(shù)Km值和Vmax值。結(jié)果顯示：自選釀酒酵母KDLYS9-3的菌體生長與產(chǎn)酶的相關(guān)性為部分偶聯(lián)型，動力學(xué)模型與試驗(yàn)值吻合度好，方程能夠反映菌體生長與產(chǎn)酶的變化規(guī)律。菌體生長8 h后開始產(chǎn)酶，菌體進(jìn)入對數(shù)生長期時酶大量生成，到39 h菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，隨著菌體生長進(jìn)入衰亡期后酶也隨之停止產(chǎn)生；利用Lineweaver-Burk法求得酶動力學(xué)參數(shù)Km=8.492 579 mmol/L，Vmax=1.030 715（μmol/L）/min。研究結(jié)果為該菌株的理論研究和實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

自選釀酒酵母（KDLYS9-3）；β-D-葡萄糖苷酶；動力學(xué)方程；米氏常數(shù)（Km）；最大反應(yīng)速率（Vmax）

β-D-葡萄糖苷酶在葡萄酒生產(chǎn)過程中可增加葡萄酒的香氣[1-3]。目前，所用商品β-D-葡萄糖苷酶大多來自于黑曲霉菌發(fā)酵生產(chǎn)得到的酶制劑[4]，該酶的加入改善葡萄酒香氣的同時也給葡萄酒留下造成蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的隱患[5]。因此，篩選可以產(chǎn)生β-D-葡萄糖苷酶的釀酒酵母，在進(jìn)行酒精發(fā)酵的同時提高香氣物質(zhì)含量已成為葡萄酒行業(yè)關(guān)注的重要課題之一。

本研究是對本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的一株高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的釀酒酵母（KDLYS9-3）[6]的菌體生長、產(chǎn)酶以及彼此間的關(guān)系在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立動力學(xué)模型，探索細(xì)胞生長對產(chǎn)酶的影響，并對該菌所產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax進(jìn)行測定，為理論研究和實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 釀酒酵母

自選釀酒酵母KDLYS9-3：本研究室于2010年采摘沙城產(chǎn)區(qū)夾河、沙營和東水泉3個鄉(xiāng)的龍眼葡萄，帶回實(shí)驗(yàn)室后分別進(jìn)行自然發(fā)酵，在自然發(fā)酵后期分離得到的一株酵母菌，對該菌株進(jìn)行了WL培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落和顯微形態(tài)分類，結(jié)合5.8S rRNA-ITS區(qū)域及核糖體26S D1/D2區(qū)域RFLP分析的分子鑒定和基因測序證明是一株釀酒酵母[6]，后經(jīng)王彩肖等[7]鑒定為高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的菌株。該菌株Genebank登錄號為：KX098507，核糖體26S D1/D2區(qū)域限制片長多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析的基因序列為：

AGGGGCATTGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGC AAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCC GCGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTC CTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGG TGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTA AAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCA GCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAAT ATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGAT GGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGACTTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACCACGGACCA。

商品對照菌（安琪葡萄酒酵母）：中國湖北安琪活性干酵母股份有限公司。

培養(yǎng)基：斜面保藏培養(yǎng)基使用固態(tài)YEPD培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基為液態(tài)YEPD培養(yǎng)基。

1.1.2 試劑

對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）：上海寶曼生物科技有限公司；對硝基苯酚（pNP）：天津市博迪化工有限公司；磷酸二氫鈉、檸檬酸和無水碳酸鈉：天津永大化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、葡萄糖、酵母浸粉和瓊脂：北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 儀器

Multiskan FC酶標(biāo)儀：Thermo Fisher Scientific公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；Jnoec-XS-212202型生物顯微鏡：南京雄姿光電儀器有限公司；高速離心機(jī)LG16-C：北京雷博爾離心機(jī)有限公司；ZQTY-70型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶活力的測定

粗酶液的獲得：挑取保藏斜面上的單菌落，接種到Y(jié)EPD液態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種的活化培養(yǎng)，當(dāng)活菌數(shù)達(dá)到108～109個/mL時，以106個/mL的接種量接種到液態(tài)YEPD培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃、190 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后將菌懸液在4 000 r/min下離心15 min，取上清液視為粗酶液待用。

酶活力的測定參考王彩肖等[7]方法。

β-D-葡萄糖苷酶的酶活力單位定義：50℃，pH 5.0時，1 min內(nèi)β-D-葡萄糖苷酶水解底物pNPG產(chǎn)生1 μmol的pNP所需的酶量。

1.2.2 酵母菌生長曲線的測定

測定酵母生長曲線是在發(fā)酵期間定時取樣，用無菌水適當(dāng)稀釋，生物顯微鏡下血球計數(shù)板計數(shù)，得到菌體的濃度，計算公式為：x=50 000nb

式中：x為總菌數(shù)（個/mL）；50 000為生物顯微鏡的自身系數(shù)；n為顯微鏡中上下計數(shù)室菌數(shù)的平均值；b為稀釋倍數(shù)，試驗(yàn)做3次平行。

1.2.3 動力學(xué)方程及參數(shù)的測定

Logistic方程[8]是一種典型的“S”型的模型方程[9-10]，最初被用于人口增長趨勢的統(tǒng)計，該模型和菌體生長具有很大的相似性，所以利用Logistic方程建立菌體生長模型；利用DoseResp方程建立產(chǎn)酶的動力學(xué)模型；菌體生長與產(chǎn)酶之間的關(guān)系模型采用Nelder數(shù)學(xué)方程建立。通過Excel 2003和Origin 8.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)值與方程計算值的線性和非線性擬合，并在模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

分別配制底物濃度為 5、10、20、30、35 mmol/L，在其他條件相同的情況下測定酶活力，利用Lineweaver-Burk法（簡稱L-B法，也稱雙倒數(shù)法）作圖求得自選釀酒酵母KDLYS9-3所產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的動力學(xué)參數(shù)Km值和Vmax值。

2 結(jié)果與分析

2.1 自選釀酒酵母KDLYS9-3生長與產(chǎn)酶的測定

發(fā)酵過程中每間隔一定時間取樣分別測定菌體總數(shù)和酶活力，以時間為橫坐標(biāo)，菌體總數(shù)和β-D-葡萄糖苷酶活力分別為縱坐標(biāo)作圖得到圖1。

圖1 KDLYS9-3產(chǎn)酶與菌數(shù)曲線圖Fig.1 The curve of enzyme and colonies production for KDYLS9-3

可以看出KDLYS9-3存在4 h～8 h的延滯期，在延滯期內(nèi)菌體適應(yīng)新的生長環(huán)境，幾乎檢測不到β-D-葡萄糖苷酶的活力，說明菌種在這個時期產(chǎn)酶較少；8 h～39 h為菌體生長的對數(shù)期，菌體數(shù)量迅速增加。39 h～48 h為菌種生長的穩(wěn)定期。而菌體產(chǎn)酶活力在8 h～42 h快速提高，42 h～48 h期間維持較高活性，說明在菌體生長的對數(shù)期和穩(wěn)定期是菌體產(chǎn)酶的最佳時期；在48 h后菌體生長進(jìn)入衰亡期，菌體產(chǎn)酶量也較低。從菌數(shù)和酶活力的關(guān)系可以得出結(jié)論，自選釀酒酵母KDLYS9-3產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶屬于對數(shù)和穩(wěn)定期型，即在菌體生長的初期和衰亡期不會產(chǎn)生大量的酶，對數(shù)期和穩(wěn)定期為產(chǎn)酶的最佳時期，說明菌體生長與產(chǎn)酶具有半偶聯(lián)的關(guān)系。

2.2 自選釀酒酵母KDLYS9-3菌體生長動力學(xué)模型的建立與擬合

由圖1可以看出菌體的生長符合“S”型曲線，Logistic方程[11]被廣泛地用于描述菌體生長的模型，通過不依賴于基質(zhì)濃度的“S”形曲線，簡單計算得到具有生物學(xué)和幾何意義的發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)[12-13]，說明本研究可以利用Logistic方程建立數(shù)學(xué)模型，基本公式為：

式中：X為菌體的總菌數(shù)，個/mL；Xm為最大細(xì)胞濃度，個/mL；μm為最大比生長速率，h-1。由于在 0～8 h時菌體數(shù)量基本不增加，所以對本方程進(jìn)行改進(jìn)為在t＞8 h進(jìn)行積分，以 t=0 時 X=X0為初始條件，對（1）式積分得：

由式2可以整理為公式3：

由圖1中的生長曲線和試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，Xm為最大的菌體濃度1.50×109個/mL，可將公式3看做為：

圖2 直線回歸方程Fig.2 Linear regression equation

由圖2中的線性回歸方程的直線斜率K=μm=0.241 2，又由截距可以求得 x0為 2.55×106，xm=1.50×109，μm帶入式2中最終得到KDLYS9-3的生長動力學(xué)模型為：

①當(dāng)發(fā)酵時間在t=0時，方程為

②當(dāng)發(fā)酵時間為t＞0 h

由模型計算所得曲線與試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)曲線的對比為圖3。

由圖3和圖4可以看出，所建模型與試驗(yàn)所測得的數(shù)據(jù)具有很高的相似性，各數(shù)據(jù)點(diǎn)的殘差較小，說明模型和實(shí)測值擬合較好，所建模型可以很好的描述菌種細(xì)胞的增長趨勢，既菌體經(jīng)過一段時間的延滯期，之后快速的增長，在39 h之后達(dá)到穩(wěn)定期，之后菌體受環(huán)境的影響，使之在一定的時間內(nèi)保持穩(wěn)定。通過模型與試驗(yàn)的擬合，可以說明所建模型可以應(yīng)用到實(shí)際的發(fā)酵操作中。

圖3 菌體生長動力學(xué)模型預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值對比圖Fig.3 Comparison of predicted values and experimental values of the growth kinetics model of the yeast

圖4 Origin8.0擬合各數(shù)據(jù)點(diǎn)殘差圖Fig.4 The fitting of residual for each data point in Origin8.0

2.3 產(chǎn)酶活力動力學(xué)模型的建立與擬合

由圖1可以看出，酶活曲線呈現(xiàn)類似“S”型，所以本研究使用DoseResp方程進(jìn)行擬合。DoseResp方程是一種“S”型函數(shù)方程，被使用在類菌體生長、受菌體生長的產(chǎn)物生成、基質(zhì)消耗等[14-15]，本研究對產(chǎn)酶活力的動力學(xué)建立模型。DoseResp方程公式為：

式中：P(t)為酶活，U/mL；A1、A2、LOGx0和 C 為待定常數(shù)，t為生長時間，h。

由實(shí)時酶活力測定值P和時間t的對應(yīng)關(guān)系，通過軟件Origin 8.0軟件進(jìn)行擬合，可得到常數(shù)A1、A2、LOGx0和C分別如表1。

表1 DoseResp方程擬合相關(guān)參數(shù)Table 1 Fitting parameters of DoseResp equation

由表1可以看出，常數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差都小于0.5，說明擬合效果較好，P＜0.05，P 值較小，R2=0.998 74，說明擬合模型極顯著，可以反映試驗(yàn)結(jié)果。最終得到產(chǎn)酶酶活數(shù)學(xué)模型為：

由模型的預(yù)測值與試驗(yàn)所得值進(jìn)行比較，做圖5和圖6。

圖5 酶活模型預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值對比圖Fig.5 Comparison of predictive value and experimental value of enzyme activity model

圖6 Origin8.0擬合各數(shù)據(jù)點(diǎn)殘差圖Fig.6 The fitting of residual for each data point in Origin8.0

由圖5和圖6可以看出模型預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值吻合度很好，各個數(shù)據(jù)點(diǎn)與預(yù)測數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的殘差都在-0.000 8～0.000 8之間，說明了所建的方程模型可以很好的反映酶活力與發(fā)酵時間之間的關(guān)系，可以為今后利用自選釀酒酵母KDLYS9-3進(jìn)行釀酒試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。該模型顯示了很好的擬合效果，且具有快速和簡便的優(yōu)點(diǎn)，可以很準(zhǔn)確的反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果。

2.4 菌體生長與產(chǎn)酶相關(guān)性模型的建立

由圖1可以看出，β-D-葡萄糖苷酶是在自選釀酒酵母KDLYS9-3的生長過程中產(chǎn)生的，菌體生長和產(chǎn)酶具有部分偶聯(lián)關(guān)系，本研究利用Nelder方程建立模型，并利用Origin軟件進(jìn)行擬合?；A(chǔ)方程式為公式9：

式中：P（x）為反應(yīng)酶活（U/mL）；a、b0、b1和 b2為待定常數(shù)；x為菌體數(shù)量（106個/mLl）。

經(jīng)過軟件Origin軟件擬合方程參數(shù)為表2。

表2 Nelder方程擬合參數(shù)Table 2 Fitting parameters of Nelder equation

由表2可以看出，常數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差都較小，說明擬合效果較好，P＜0.001，P 值較小，R2=0.984，說明擬合模型極顯著，模型預(yù)測結(jié)果可以很好的反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最終得到菌體生長與產(chǎn)酶的關(guān)系數(shù)學(xué)模型為：

由模型的預(yù)測值與試驗(yàn)所得值進(jìn)行比較，做圖7和圖8。

圖7 總菌數(shù)與酶活的關(guān)系Fig.7 The relationship between total colonies and enzyme activity

圖8 Origin8.0擬合各數(shù)據(jù)點(diǎn)殘差圖Fig.8 The fitting of residual for each data point in Origin8.0

由圖7和圖8可以看出，試驗(yàn)值與模型預(yù)測值吻合較好，說明所建模型符合試驗(yàn)的真實(shí)性，可以很好的對自選釀酒酵母KDLYS9-3的生長與β-D-葡萄糖苷酶的生成之間的關(guān)系進(jìn)行描述，由殘差圖可以看出各數(shù)據(jù)點(diǎn)的殘差在-0.003～0.003之間，也說明了模型可以真實(shí)的反映試驗(yàn)的真實(shí)值，可以用公式10描述菌體生長與產(chǎn)酶之間的半偶聯(lián)關(guān)系。

2.5 KDLYS9-3產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax

利用米氏方程[16]和L-B作圖法對自選釀酒酵母KDLYS9-3產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的動力學(xué)參數(shù)Km值和Vmax值進(jìn)行測定，以商品安琪釀酒酵母為對照菌，分別以底物濃度為橫坐標(biāo)和酶活力為縱坐標(biāo)做圖9。

圖9 底物濃度與酶活的關(guān)系Fig.9 The relationship between substrate concentration and enzyme activity

由圖9可以看出，底物濃度與對酶活力的影響，在底物濃度5 mmol/L～35 mmol/L范圍內(nèi)，酶活力隨底物濃度的升高而逐漸增大。以米氏方程11和12可建立1/S和1/V的一元線性關(guān)系；

以1/S為橫坐標(biāo)和1/V為縱坐標(biāo)做圖10。

圖10 兩種酵母菌所產(chǎn)酶1/V和1/S關(guān)系圖Fig.10 The relationship of 1/V and 1/S in the enzyme from the two yeasts

由圖10可以看出KDLYS9-3和安琪酵母所產(chǎn)酶的1/S和1/V的線性擬合方程分別為y=8.239 5x+0.970 2和y=17.671x+1.8 831，線性相關(guān)性系數(shù)R2分別為0.998 8和0.994 7，擬合直線與試驗(yàn)值吻合度很高，說明擬合效果很好。由橫縱截距可以求出KDLYS9-3的酶動力學(xué)參數(shù)為Km=8.492 579 mmol/L，Vmax=1.030 715（μmol/L）/min；安琪酵母的 β-D-葡萄糖苷酶動力學(xué)參數(shù)為Km=9.383 994 mmol/L，Vmax=0.531 039（μmol/L）/min。

Km可以反映底物與酶的親和力大小，Km越小，說明酶與底物的親和力越強(qiáng)，反之則越弱[17-18]，由兩種菌的酶動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax可以看出：KDLYS9-3的Km值小于安琪酵母的Km值，說明KDLYS9-3所產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶對pNPG底物的反應(yīng)親和力要強(qiáng)于商品菌安琪釀酒酵母。

3 結(jié)論

本文應(yīng)用Logistic方程、DoseResp方程和Nelder方程分別對自選高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的釀酒酵母KDLYS9-3生長、產(chǎn)酶、生長與產(chǎn)酶之間的半偶聯(lián)關(guān)系進(jìn)行了數(shù)學(xué)描述，建立了數(shù)學(xué)模型，結(jié)果顯示出所建數(shù)學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)值吻合性很好，證明了生長和產(chǎn)酶存在的部分偶聯(lián)關(guān)系。對自選菌和商品菌所產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值進(jìn)行測定，由此證明了KDLYS9-3所產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶對pNPG的底物親和力強(qiáng)于對照菌，該菌株具有很好的應(yīng)用潛質(zhì)。

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Research on the Enzyme Kinetics of Poducing Beta-D-Glucosidase from Indigenous Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-3

LI Yan1，2
（1.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China；2.Hebei R&D Center for Fermentation Engineering，Shijiazhuang 050018，Hebei，China）

Indigenous Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-3 produces high activity beta-D-glucosidase，and it has the effect of enhancing aroma during the wine making process.Based on the experiment of bacteria growth and enzyme production，the Logistic equation，DoseResp equation and Nelder equation were used to build a dynamic model for the yeast growth and enzyme production，and the relationship of yeast growth rate and enzyme producing rate in this study.After the nonlinear fitting by Origin 8.0 software，and graphed by the method of Lineweaver-Burk，the kinetic parameters of Kmand Vmaxvalues for the enzymes of this yeast producing beta-D-glycosidase were detected.The result shows that the bacteria growth and enzyme production dynamic model of KDLYS9-3 were correlation with the test results，the dynamic model equation can reflect the variety regulation of bacteria growth and enzyme production，the correlation was part of the coupling relationship.The yeast began to produce enzymes after 8 h growth，and it produced a large number of enzymes when entered the logarithm of growth.The growth of yeast was stable after 39 h.With the decline phase of the yeast，the enzyme also stopped producing.The kinetic parameters of the KDLYS 9-3 enzyme were obtained by the double reciprocal method.The Kmwas 8.492 579 mmol/L，and the Vmaxwas 1.030 715 （mu/L）/min.The results helped set the basement of the strains'theoretical foundation and practical application.

Indigenous Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-3；beta-D-glucosidase；kinetic equation；Km；Vmax

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.032

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2011208028）；河北省科技支撐計劃項(xiàng)目（16227106D）

李艷（1958—），女（漢），教授，本科，研究方向：傳統(tǒng)發(fā)酵工程創(chuàng)新技術(shù)、葡萄酒和果酒釀造。

2017-08-14