史文軍，萬夕和，黎慧，沈輝，王李寶，喬毅，孫瑞健

（江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通226007）

酶解異育銀鯽制備不同分子量段抗氧化肽的研究

史文軍，萬夕和*，黎慧，沈輝，王李寶，喬毅，孫瑞健

（江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通226007）

以異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）蛋白為原料，以酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為評價(jià)指標(biāo)，從酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶8種蛋白酶中篩選出風(fēng)味蛋白酶作為最佳酶解用酶，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定風(fēng)味蛋白酶酶解的最佳工藝條件為：加酶量3 000 U/g、底物濃度7%、酶解pH 7.5、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間4 h。在該條件下對異育銀鯽的水解度為46.78%，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為90.12%、羥自由基清除率為82.31%、超氧陰離子自由基清除率為79.45%；在此基礎(chǔ)上對酶解液進(jìn)行硫酸銨鹽析、活性炭脫腥、超濾膜分段、透析脫鹽、濃縮和干燥，得到不同分子量段酶解產(chǎn)物。

異育銀鯽；酶解；自由基；抗氧化肽

異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）是中國科學(xué)院水生生物研究所的魚類育種專家于二十世紀(jì)七八十年代研制成功的一種鯽魚養(yǎng)殖新品種，然而，隨著異育銀鯽養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，病害導(dǎo)致異育銀鯽死亡的數(shù)量逐漸增加，特別是近些年，由于“鰓出血”病的影響，江蘇沿海，特別是鹽城地區(qū)養(yǎng)殖損失慘重。另一方面，由于技術(shù)和人為忽視的原因，死亡的異育銀鯽沒有得到很好的利用，這不僅造成資源的浪費(fèi)，而且造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。在魚體組織中，蛋白質(zhì)是最主要的有機(jī)組分，經(jīng)測定，異育銀鯽的含肉率在48.18%～54.19%之間，肌肉蛋白質(zhì)含量在17.58%～18.03%，氨基酸構(gòu)成中，谷氨酸含量為最高，其次為天冬氨酸、亮氨酸和賴氨酸[1-2]。

人體代謝過程中會(huì)不斷產(chǎn)生自由基，當(dāng)自由基的產(chǎn)生和清除動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)時(shí)，機(jī)體內(nèi)一些正常生理生化反應(yīng)就會(huì)發(fā)生紊亂，引起機(jī)體的組織和細(xì)胞的損傷，進(jìn)而引發(fā)慢性疾病及衰老效應(yīng)，如癌癥、心血管病和炎癥等[3]。而抗氧化肽可以清除體內(nèi)多余的自由基，增加機(jī)體免疫力，延緩衰老，從而實(shí)現(xiàn)機(jī)體的自我保護(hù)?？寡趸氖且环N以休眠形式存在于母蛋白質(zhì)序列中的特異性蛋白質(zhì)片段，當(dāng)水解釋放后才能表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗氧化活性[4]。與酸法和堿法水解相比，酶法水解蛋白水解效率高，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)生毒性物質(zhì)的可能性小，同時(shí)隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量變小，轉(zhuǎn)化為小分子肽或者游離氨基酸，更易于人體消化吸收和利用[5]。不同分子量的酶解產(chǎn)物，其吸收能力和生物活性差異較大，目前多是使用超濾法對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分子量大小分段的[6]。如郝更新[7]等通過超濾工藝從牡蠣貝肉蛋白酶解液中分離富集抗氧化活性肽；林慧敏[8]等采用超濾膜對帶魚蛋白酶解液進(jìn)行分級分離獲得了高抗菌、抗氧化活性的帶魚蛋白亞鐵螯合肽（Fe-HPH）；Mohamed Beva Kelfala Foh[9]等研究了超濾對羅非魚蛋白水解物抗氧化活性的影響。

本文以異育銀鯽蛋白為原料，選擇體外DPPH自由基清除率為評價(jià)指標(biāo)，從8種蛋白酶中篩選出最適制備異育銀鯽抗氧化肽的蛋白水解酶，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝，確定合適的加酶量、底物濃度、酶解溫度、酶解pH值和酶解時(shí)間，并通過超濾分段的方法將其分成不同分子量段的抗氧化肽，以期為發(fā)病異育銀鯽的綜合開發(fā)及利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異育銀鯽：取自江蘇省鹽城市大豐區(qū)養(yǎng)殖塘口，低溫運(yùn)至江蘇省海洋水產(chǎn)研究所海洋生物技術(shù)試驗(yàn)室，-20℃保存，使用時(shí)室溫解凍。

酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶（均為食品級）：天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；試驗(yàn)所使用的硫酸、鹽酸、氯化鈉等各類試劑均為分析純。所用蛋白酶的各項(xiàng)參數(shù)見表1。

表1 8種蛋白酶的特征性參數(shù)值Table 1 Feature values of eight enzymes

1.2 主要儀器設(shè)備

PHS-2F pH酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DL-I-15臺式封閉電爐：江陰市保利科研器械有限公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)：島津國際貿(mào)易（上海）有限公司；DK-S26水浴鍋：海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司：SHY-2A恒溫水浴振蕩器；常州麥科諾儀器有限公司；AB54-S電子分析天平：梅特勒-托利多常州公司；蠕動(dòng)泵：上海滬西有限公司；超濾板：美國頗爾公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步琦有限公司。

2 方法

2.1 樣品預(yù)處理

將-20℃保存的異育銀鯽，于室溫下放置解凍，去除魚鱗和內(nèi)臟后，將魚肉分成2 cm～3 cm每段；按1∶5（g/mL）加入無乙醇，脫脂 2 h，期間每 1 h更換一次液體；然后用自來水沖洗干凈，純水浸泡一次；50℃烘干5 h；用組織粉碎機(jī)將其粉碎，放置于干燥器里貯藏備用。

2.2 蛋白質(zhì)含量的測定

參照GB/T5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法。

2.3 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取預(yù)先于105℃烘箱干燥至恒重的甘氨酸0.100 0 g（準(zhǔn)確至0.000 1 g），用蒸餾水定容至100 mL，取2.0 mL用蒸餾水定容至100 mL，即得20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液；用蒸餾水分別稀釋至 2、4、6、8、10、14、16 μg/mL和20 μg/mL 8個(gè)梯度，分別取上述溶液2.0 mL至具塞試管中，并以蒸餾水作為空白組，各加1.00 mL茚三酮顯色劑，混勻后置于沸水浴中加熱15 min，立即冷水中冷卻，加入5.00 mL 40%乙醇溶液，劇烈震蕩數(shù)分鐘至棕紅色退去，室溫靜置15 min，用紫外分光光度計(jì)測570 nm處吸光值，以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，甘氨酸濃度C為橫坐標(biāo)，繪制甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 水解度的測定

茚三酮比色法[10]，具體是將蛋白水解上清液稀釋至合適倍數(shù)，取2.00 mL稀釋液于試管并加入1.00 mL茚三酮顯色劑混勻后沸水浴加熱15 min。同時(shí)作空白試驗(yàn)，以后操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制過程。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水解蛋白液中-NH4的含量，水解度計(jì)算公式如下：

式中：DH為水解度，%；h為水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵數(shù)，mmol；htot為每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)，本試驗(yàn)取7.4mmol/g；水解液-NH4的含量：由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得；N為凱氏定氮測定的氮的濃度，mg/mL。

2.5 酶解試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取一定量的異育銀鯽干粉，加入適當(dāng)比例的超純水，用2 mol/L氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)體系pH值至試驗(yàn)用酶最適pH值，加入適量的水解用蛋白酶，在給定的反應(yīng)溫度下進(jìn)行反應(yīng)，酶解至設(shè)定時(shí)間后，將酶解液置于沸水中滅酶活10 min，10 000 r/min離心15 min，將所得酶解產(chǎn)物（上清）置于冰箱4℃短期保存待用。

2.6 酶解產(chǎn)物抗氧化能力的測定

2.6.1 DPPH自由基清除活性的測定

參照李云濤等[11]的方法，略作改動(dòng)，取1.5 mL待測液與1.5 mL 0.02 mmol/L的DPPH溶液，混勻，室溫黑暗下放置30 min，以1.5 mL 99.5%乙醇和1.5 mL純水的混合液調(diào)零，測定其在517 nm波長下的吸光值，計(jì)算公式如下：

式中：Ai為1.5 mL待測液與1.5 mL 0.02 mmol/L的DPPH溶液的吸光值；A1為1.5 mL99.5%乙醇與1.5 mL0.02mmol/L的DPPH溶液的吸光值；A2為1.5mL DPPH溶液與1.5 mL99.5%乙醇的吸光值。

2.6.2 羥自由基清除活性的測定

參照文獻(xiàn)中的方法[12]，在10 mL具塞比色管依次加入0.8 mL的pH5.0HAc-NaAc緩沖液，1.0 mL1×10-4mol/L的孔雀石綠溶液，2.2 mL2×10-2mol/L的EDTA-Fe2+溶液，1.4 mL0.3%的H2O2溶液，用純水稀釋至10 mL，搖勻，放置45 min后在617 nm波長處測定吸光值A(chǔ)0，同時(shí)測定不加H2O2時(shí)的吸光值A(chǔ)1，同時(shí)測得在加H2O2前加入1 mL所測酶解液，此時(shí)的吸光值計(jì)作Ai，計(jì)算公式如下：

2.6.3 超氧陰離子清除活性的測定

參照張照昱等[13]的方法，取0.05 mol/LpH8.2的Tris-HCl緩沖液2.4 mL，25℃水浴加熱20 min，加入0.3 mL提前預(yù)熱過的4 mmol/L的鄰苯三酚溶液和

式中：A0為不加待測酶解液的吸光值；A1為加待測酶解液的吸光值；A2為不加鄰苯三酚時(shí)溶液的吸光值。

2.7 最適酶的篩選

在加酶量為2 000 U/g，底物濃度為10%，酶解時(shí)間為2 h的相同條件下，選擇各酶最適pH值和最適溫度，分別測定酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解異育銀鯽的水解度及相對應(yīng)酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率，最終篩選出最佳水解蛋白酶[14-16]。

2.8 單因素試驗(yàn)

在最適pH值和溫度的條件下，分別以不同加酶量（500、1 000、1 500、2 000、2 500 U/g 和 3 000 U/g），不同底物濃度（4、6、8、10、12 g/100 mL 和 14 g/100 mL），反應(yīng)時(shí)間（1、1.5、2、2.5、3、3.5 h 和 4 h）為單因素，考察各單因素水平對異育銀鯽蛋白水解度及水解產(chǎn)物抗氧化性的影響。

2.9 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和風(fēng)味蛋白酶最適pH值及溫度條件，運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，研究加酶量、底物濃度、pH值、溫度和反應(yīng)時(shí)間對風(fēng)味蛋白酶酶解異育銀鯽蛋白制備抗氧化肽的影響，并優(yōu)化出各因素的最佳組合。

2.10 不同分子量段抗氧化肽的制備

硫酸銨鹽析：在以上所選最佳酶解工藝條件下進(jìn)行異育銀鯽蛋白質(zhì)酶解，將滅酶后的酶解上清液，在冰水浴條件下加硫酸銨至一定飽和度，然后4℃過夜鹽析，離心收集沉淀；

生理鹽水復(fù)溶：復(fù)溶沉淀用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0含0.15 mol/L氯化鈉）復(fù)溶，然后用活性炭（濃度2%～4%，溫度40℃～50℃）脫腥2 h后，離心收集上清液；

超濾分段：用截留分子量不同的超濾板將其分離為 Mr>10kDa、10kDa>Mr>5kDa、5kDa>Mr>3kDa 及3kDa>Mr 4個(gè)分子量段的抗氧化肽；

透析脫鹽：將各段酶解液分別裝于截留分子量3 kDa的透析袋中，于純水中脫鹽24 h，期間每8 h替換一次純水；

濃縮和干燥：將脫鹽后的各段酶解液通過旋轉(zhuǎn)蒸0.3 mL的待測酶解液，搖勻，25℃反應(yīng)4 min，加一滴10 mmol/L的HCl以終止反應(yīng)，325 nm波長處測定吸光值，計(jì)算公式如下：發(fā)濃縮進(jìn)行濃縮；然后進(jìn)行冷凍干燥。

2.11 數(shù)據(jù)處理

采用Origin和Spass軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均采用±S表示。

3 結(jié)果及分析

3.1 酶解用酶的篩選

在底物濃度10%，加酶量2 000 U/g，酶解時(shí)間2 h的相同條件下，在各蛋白酶自身最適pH值和溫度條件下，分別測得8種蛋白酶酶解異育銀鯽的水解度和相對應(yīng)酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率結(jié)果見圖1。

圖1 不同蛋白酶酶解液的DPPH自由基清除率Fig.1 DPPH scavenging activity of the enzymatic hydrolysates by different proteinases

由圖1可知，其水解度大小順序?yàn)橐鹊鞍酌?菠蘿蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶>木瓜蛋白酶>堿性蛋白酶>中性蛋白酶>酸性蛋白酶>胃蛋白酶，其中胰蛋白酶水解度最高，可以達(dá)到22.94%，而最低的胃蛋白酶，只能達(dá)到7.66%；測得各蛋白酶所對應(yīng)的酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率大小順序?yàn)轱L(fēng)味蛋白酶>菠蘿蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶>堿性蛋白酶>酸性蛋白酶>胃蛋白酶>中性蛋白酶，其中，最高的風(fēng)味蛋白酶酶解液對DPPH自由基清除率達(dá)68.26%，而最低的中性蛋白酶酶解液對DPPH自由基清除率只能達(dá)到16.02%。因此，選擇風(fēng)味蛋白酶作為本試驗(yàn)制備抗氧化肽的酶解用酶，其水解異育銀鯽的水解度19.03%。

3.2 加酶量對酶解液DPPH自由基清除率的影響

在底物濃度為10%，pH值為6.5，反應(yīng)溫度為50℃，酶解時(shí)間為2 h的相同條件下，研究風(fēng)味蛋白酶的（500 U/g～3 000 U/g）加酶量對酶解液DPPH自由基清除率和水解度的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在加酶量達(dá)到2 500 U/g前，隨著加酶量的增加，水解度及酶解液DPPH自由基清除率均成呈上升趨勢，但當(dāng)加酶量達(dá)2 500 U/g后，繼續(xù)增加蛋白酶加入量，水解度變化不明顯，而酶解液DPPH自由基清除率卻呈現(xiàn)下降趨勢。所以選擇2 500 U/g作為風(fēng)味蛋白酶的最適加酶量。

圖2 加酶量對酶解液DPPH自由基清除率的影響Fig.2 DPPH scavenging activity of the enzymatic hydrolysates by different proteinas’concentration

3.3 底物濃度對酶解液DPPH自由基清除率的影響

在加酶量為2 500 U/g，pH值為6.5，反應(yīng)溫度為50℃，酶解2 h的相同條件下，研究（4%～14%）底物濃度對酶解液DPPH自由基清除率和水解度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 底物濃度對酶解液DPPH自由基清除率的影響Fig.3 DPPH scavenging activity of the enzymatic hydrolysates by different substrates’concentration

由圖3可知，在底物濃度達(dá)到8%之前，隨著底物濃度的增加，水解率和酶解液DPPH自由基清除率均呈上升趨勢，但當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)8%后，繼續(xù)增加底物濃度，酶解液DPPH自由基清除率趨于平穩(wěn)，而水解度呈下降趨勢。綜合考慮選擇8%作為風(fēng)味蛋白酶最適反應(yīng)底物濃度。

3.4 酶解時(shí)間對酶解液DPPH自由基清除率的影響

在加酶量為2 500 U/g，pH值為6.5，反應(yīng)溫度為50℃，底物濃度為10%的相同條件下，研究（1 h～4 h）酶解時(shí)間分別對酶解液DPPH自由基清除率和水解度的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，前3 h內(nèi)，隨酶解時(shí)間的延長，水解度和酶解液DPPH自由基清除率均呈上升趨勢；但酶解3 h后，繼續(xù)延長酶解時(shí)間，水解度上升趨勢不明顯，酶解液DPPH自由基清除率卻有下降趨勢。綜合考慮選擇3 h作為最適酶解時(shí)間。

圖4 酶解時(shí)間對酶解液DPPH自由基清除率的影響Fig.4 DPPH scavenging activity of the enzymatic hydrolysates by different hydrolysis time

3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

最適加酶量為2 500 U/g，最適底物濃度為8%，最適酶解時(shí)間為3 h，結(jié)合風(fēng)味蛋白酶最適pH6.5和最適反應(yīng)溫度為50℃。在上述最適單因素的基礎(chǔ)得出正交試驗(yàn)試驗(yàn)水平因素設(shè)計(jì)表，見表2。

表2 正交試驗(yàn)水平因素設(shè)計(jì)表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design

以異育銀鯽酶解液DPPH自由基清除率評價(jià)為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)確定風(fēng)味蛋白酶酶解的最適反應(yīng)組合條件。正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表3，方差分析表見表4。

表3 風(fēng)味蛋白酶酶解條件正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 3 The design and results of orthogonal test

續(xù)表3 風(fēng)味蛋白酶酶解條件正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析Continue table 3 The design and results of orthogonal test

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis

由表3可知，用風(fēng)味蛋白酶酶解異育銀鯽制備抗氧化肽時(shí)，以DPPH自由基清除率為評價(jià)指標(biāo)，對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，發(fā)現(xiàn)各單因素的影響程度依次為加酶量>pH值>反應(yīng)溫度>酶解時(shí)間>底物濃度；最佳試驗(yàn)組合為A3B1C3D3E3，即加酶量為3 000 U/g，底物濃度為7%，pH值為7.5，反應(yīng)溫度為55℃，酶解時(shí)間為4 h。由表4可以看出加酶量、pH值和溫度水平之間存在顯著差異；而底物濃度和反應(yīng)時(shí)間水平之間沒有顯著性差異。

3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)正交試驗(yàn)優(yōu)化出的最佳酶解條件的準(zhǔn)確性，在此最優(yōu)條件（A3B1C3D3E3）下，進(jìn)行異育銀鯽酶解試驗(yàn)，此時(shí)水解度為46.78%，對應(yīng)酶解液DPPH自由基清除率為90.12%，結(jié)果大于正交13號試驗(yàn)組，所以此次正交試驗(yàn)優(yōu)化出的最佳酶解條件是準(zhǔn)確的，可以用于酶解。同時(shí)測定此時(shí)酶解液羥自由基清除率為82.31%、超氧陰離子自由基清除率為79.45%。

3.7 不同飽和度硫酸銨鹽析效果

加入硫酸銨至不同的飽和度，其鹽析效果是不同的，如圖5所示。

圖5 不同飽和度硫酸銨鹽析效果Fig.5 The results of ammonium sulfate precipitation

由圖5可知，隨著硫酸銨飽和度的不斷增加，上清液中蛋白質(zhì)的含量在逐漸降低，即越來越多的蛋白從溶液中析出，當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到90%時(shí)，幾乎所有的蛋白從溶液中析出。

3.8 不同分子量段抗氧肽的得率

將干燥后的各段抗氧化肽進(jìn)行稱量，與加入底物的量進(jìn)行比較，計(jì)算出各段的得率，如表5所示，可見分子量大于10 kDa的抗氧化肽產(chǎn)率是最高的，而分子量小于3 kDa的抗氧化肽產(chǎn)率最低。

表5 不同分子量段抗氧化肽的產(chǎn)率Table 5 Pproduction rate of different molecular weight antioxidant peptides

3.9 不同分子量段抗氧化肽的抗氧化性

將不同分子量段的抗氧化肽粉充分溶于純水中，濃度均為2.0 mg/mL，然后用0.45 μm的濾膜過濾，檢測各段的體外抗氧化性，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，相同濃度下，隨著分子量的降低，其抗氧化活性不斷升高。

4 小結(jié)

1）通過對8種酶水解度和酶解產(chǎn)物自由基清除率的分析，綜合考慮各方面因素，篩選出風(fēng)味蛋白酶作為試驗(yàn)用最佳蛋白水解酶；

圖6 不同分子量段多肽抗氧化效果Fig.6 The antioxidant effect of different molecular weight

2）通過正交優(yōu)化試驗(yàn)可得，風(fēng)味蛋白酶水解異育銀鯽蛋白的最佳水解條件是：

加酶量3 000 U/g，底物濃度7%，pH7.5、反應(yīng)溫度為55℃和酶解時(shí)間4 h。在此最優(yōu)條件下，進(jìn)行異育銀鯽酶解試驗(yàn)，測得水解度為46.78%，對應(yīng)酶解液DPPH自由基清除率為90.12%，同時(shí)測定此時(shí)酶解液羥自由基清除率為82.31%、超氧陰離子自由基清除率為79.45%；

3）通過硫酸銨鹽析、活性炭脫腥和超濾膜分段，將異育銀鯽酶解液按分子量大小分離為Mr>10kDa、10kDa>Mr>5kDa、5kDa>Mr>3kDa及 3kDa>Mr 4個(gè)分子量段的抗氧化肽；其中，3kDa>#分子量段的抗氧化肽抗氧化效果最好，2.0 mg/mL時(shí)其DPPH自由基清除率為90.82%。

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Study on the Preparation of Antioxidant Peptide with Different Molecular Weights from Crucian Carp（Carassius auratus gibelio）Meat Enzymolysis

SHI Wen-jun，WAN Xi-he*，LI Hui，SHEN Hui，WANG Li-bao，QIAO Yi，SUN Rui-jian
（Institute of Oceanology&Marine Fisheries of Jiangsu，Nantong 226007，Jiangsu，China）

Gibel carp （Carassius auratus gibelio）protein was chosed as the raw material.It was independently hydrolyzed by trypsin，pepsin，flavourzyme，neutrase，alcalase，papain，bromelain and acid protease.The antioxidant capability was evaluated by the DPPH free radicals clearance rate.The results showed that the flavourzyme was the best proteolytic enzyme.The single factor and orthogonal experiment showed that the best hydrolysis conditions of the flavourzyme were：enzyme amount 3 000 U/g，substrate concentration 7%，pH=7.5，T=55℃，reaction time 4 h.Under these conditions，the degree of hydrolysis（DH）was 46.78%，the DPPH free radicals clearance rate could achieve to 90.12%，the scavenging rate of hydroxyl radical was 82.31%and the clearance rate of superoxide anion radical was 79.45%.The enzymatic hydrolysates were processed with ammonium sulfate salting-out，active carbon，ultrafiltration，dialysis，concentration and lyophilization，then antioxidant peptide with different molecular weights were got.

Carassius auratus gibelio；enzymatic hydrolysis；free redicals；antioxidant peptide

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.011

異育銀鯽重大疾病防控技術(shù)體系研究與示范（D2015-12）作者簡介：史文軍（1987—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：海洋生物技術(shù)。

*通信作者：萬夕和（1971—），男（漢），研究員，博士，研究方向：海洋生物。

2017-03-13