孫麗娜，范英兵，胡冬慧，楊源濤，林宇童

（黑河學(xué)院 理學(xué)院，黑龍江黑河164300）

響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶提取藍(lán)莓多糖工藝研究

孫麗娜，范英兵*，胡冬慧，楊源濤，林宇童

（黑河學(xué)院 理學(xué)院，黑龍江黑河164300）

采用響應(yīng)面法優(yōu)化野生藍(lán)莓多糖提取工藝，并對(duì)多糖的脫色工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素的試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度三因素三水平，采用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析，得到纖維素酶法提取藍(lán)莓多糖的優(yōu)化條件為：酶添加量0.57%，酶解時(shí)間85 min，酶解溫度38℃，提取率2.91%；各因素的影響順序?yàn)椋好附鉁囟?酶添加量>酶解時(shí)間。

響應(yīng)面法；纖維素酶；藍(lán)莓；提取

藍(lán)莓，別稱藍(lán)漿果、紅豆果、烏飯樹(shù)、越桔等，是杜鵑花科越橘屬植物[1]。因其果味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“漿果之王”[2]，被國(guó)際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[3]。我國(guó)野生藍(lán)莓主要分布在長(zhǎng)白山、大興安嶺和小興安嶺地區(qū)，且大部分在大興安嶺地區(qū)。

藍(lán)莓果實(shí)中含有原花青素、花色苷、酚酸、微量元素多種活性成分，具有抗癌、強(qiáng)心、明目、防止腦神經(jīng)老化、軟化血管、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等藥理活性[4-5]。藍(lán)莓中也含有多糖成分，糖是重要的生命活性物質(zhì)之一，涉及到人體多細(xì)胞生命的全部空間和時(shí)間，而多糖作為糖類中的重要一類，又具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥、抗衰老及降血糖等功能[6-7]。由于多糖在提取時(shí)，往往成分中含有色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，因此必須要對(duì)多糖進(jìn)行純化。目前，大孔吸附樹(shù)脂作為一種廉價(jià)、高效的高分子吸附材料，被越來(lái)越多的應(yīng)用于多糖的脫色研究[8-9]。

本試驗(yàn)以黑河地區(qū)野生藍(lán)莓味研究對(duì)象，探究藍(lán)莓多糖的提取的最佳工藝條件，采用大孔吸附樹(shù)脂為脫色劑，研究其對(duì)藍(lán)莓多糖脫色的最佳工藝條件，寄希望本研究為藍(lán)莓多糖工業(yè)化的提取及脫色操作提供一定的理論依據(jù)。

1 材料、試劑與設(shè)備

1.1 材料與試劑

野生藍(lán)莓：大興安嶺地區(qū)；纖維素酶（30 U/mg，生化級(jí)）：Rubio公司；D101型大孔吸附樹(shù)脂：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、濃硫酸、乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水。

1.2 設(shè)備

FW-100型粉碎機(jī)：上海世邦有限公司；DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；JA20-03N型電子天平：上海平軒科學(xué)儀器有限公司；DZ-2BCII型真空干燥箱：上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型真空抽濾裝置：鄭州賽克斯玻璃儀器有限公司；DZF6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；T6紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司

2 方法

2.1 藍(lán)莓多糖的提取工藝流程

新鮮藍(lán)莓→干燥至恒重→粉碎，過(guò)篩→加水50倍攪拌均勻→調(diào)節(jié)pH7.0→加入纖維素酶→100℃滅酶15 min→Sevage法除去蛋白→大孔吸附樹(shù)脂脫色→醇沉→抽濾→乙醚、丙酮洗滌抽濾→真空干燥得到藍(lán)莓粗多糖→稱重

2.2 藍(lán)莓多糖提取的單因素試驗(yàn)

固定料液（蒸餾水）比為1∶50（g/mL），分別以酶的添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度為影響因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察對(duì)藍(lán)莓粗多糖提取率的影響。

2.3 響應(yīng)面分析法

在單因素的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取合適的因子，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，以多糖提取率為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分，因素水平表設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table 1 The table of experiment factors and levels optimized by response surface

2.4 藍(lán)莓粗多糖提取率的計(jì)算

藍(lán)莓粗多糖提取率的計(jì)算公式如下：

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 酶添加量對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響

酶添加量對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 酶添加量對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響Fig.1 The effects of the additive amount of enzyme

由圖1可以看出，隨著酶添加量的增加，藍(lán)莓多糖提取率增加，這一階段影響藍(lán)莓提取率的主要因素是酶含量；在酶添加量達(dá)到0.6%時(shí)，藍(lán)莓多糖的提取率達(dá)到了最大；繼續(xù)增大酶添加量，藍(lán)莓多糖提取率的增加不明顯，這時(shí)影響藍(lán)莓多糖提取率的主要因素是底物的量，增加酶用量，藍(lán)莓多糖提取率無(wú)明顯增加，而且會(huì)增大成本。因此，較佳酶添加量0.6%。

3.1.2 酶解時(shí)間對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響如圖2。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響Fig.2 The effects of the time of enzymolysis to the extraction rate of blueberry polysaccharide

由圖2可知，隨酶解時(shí)間的增加，藍(lán)莓多糖提取率有明顯增大，但在前90 min內(nèi)增加趨勢(shì)明顯。90 min后，反而有所下降。這是由于隨著水解時(shí)間的增加，部分多糖水受到破壞。因此，為保證提取率同時(shí)保證有效成分完好，較佳酶解時(shí)間為60 min左右。

3.1.3 酶解溫度對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響

酶解溫度對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響Fig.3 The effects of the temperature of enzymolysis

由圖3可以看出，酶解溫度40℃時(shí)，藍(lán)莓多糖的提取率最大，隨溫度的升高，藍(lán)莓多糖提取率反而有所下降，主要由于酶活性與溫度有關(guān)，溫度過(guò)高，會(huì)破壞酶結(jié)構(gòu)，使酶失去活性，溫度過(guò)低，酶催化作用不能充分發(fā)揮，因此，較佳酶解溫度在40℃左右。

3.2 響應(yīng)面分析法

3.2.1 響應(yīng)面分析法的設(shè)計(jì)

利用Box-Benhnken的設(shè)計(jì)原理，共設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中1號(hào)～12號(hào)是析因設(shè)點(diǎn)，13號(hào)～17號(hào)零點(diǎn)，析因點(diǎn)為自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估算試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The design and results of Box-Benhnken experiments

以藍(lán)莓多糖的提取率為響應(yīng)值Y，通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合后，得到回歸方程如下：

3.2.2 回歸模型方差分析

回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 The result of the variance analysis on regression models

由表3可以看出，模型F檢驗(yàn)結(jié)果為P=0.000 2<0.01，表明該回歸方程模擬及其顯著，且模型失擬項(xiàng)P=0.568 2>0.05不顯著，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.968 2，說(shuō)明模型擬合程度較好。校正系數(shù)RAdj2=0.927 2說(shuō)明該模型能解釋92.72%響應(yīng)值的變化，僅有總變異7.29%不能用此模型來(lái)解釋。因此，可以用此模型來(lái)分析和和預(yù)測(cè)纖維素酶提取藍(lán)莓多糖的工藝條件。

由表 3 中的方差分析結(jié)果可知，A、B、C、A2、B2、C2對(duì)藍(lán)莓多糖的提取率影響均顯著，影響的主次順序?yàn)镃>A>B，即酶解溫度>酶添加量>酶解時(shí)間。

3.2.3 最佳條件的確定

酶添加量和酶解時(shí)間對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響見(jiàn)圖4，酶添加量和酶解溫度對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響見(jiàn)圖5，酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響見(jiàn)圖6。

圖4 酶添加量和酶解時(shí)間對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響Fig.4 The effects of the addictive amount and time of enzymolysis to the extraction rate of blueberry polysaccharide

圖4、圖5、圖6可以看出，酶添加量、酶解時(shí)間及酶解溫度的兩兩因素之間對(duì)藍(lán)莓多糖的提取率影響不大，也就是交互作用不顯著。

響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最佳試驗(yàn)組酶添加量為0.57%，酶解時(shí)間84.47 min，酶解溫度37.57℃。該條件下藍(lán)莓多糖的提取率為2.917 62%。

圖5 酶添加量和酶解溫度對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響Fig.5 The effects of the temperature and addictive amount of enzymolysis to the extraction rate of blueberry polysaccharide

圖6 酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響Fig.6 The effects of the temperature and time of enzymolysis to the extraction rate of blueberry polysaccharide

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)的可行性，響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后得到的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)，考慮到試驗(yàn)和生產(chǎn)中實(shí)際操作的可行性和便利性，酶添加量0.57%，酶解時(shí)間75 min，酶解溫度38℃。最佳條件驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 最佳條件驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The best condition validation experiment results

由表4可知，3組驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果中平均得率為2.91%。與理論值相差0.076 2%，因此，響應(yīng)面法對(duì)纖維素酶輔助提取藍(lán)莓多糖的工藝優(yōu)化是可行的。并且具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究采用纖維素酶法提取藍(lán)莓多糖，該工藝通過(guò)酶水解破壞植物細(xì)胞壁的作用，使細(xì)胞內(nèi)多糖物質(zhì)充分溶出，從而提高了藍(lán)莓多糖的提取率。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)可得到：影響因素的順序酶解溫度酶添加量酶解時(shí)間；纖維素酶法提取藍(lán)莓多糖的最佳條件為：酶添加量0.57%，酶解時(shí)間85 min，酶解溫度38℃，提取率達(dá)到2.91%。與模型預(yù)估值接近，說(shuō)明用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型準(zhǔn)確、可靠。試驗(yàn)所建立的工藝條件酶用量少、條件溫和、材料易得、價(jià)格低廉、提取率高，為藍(lán)莓多糖的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

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Optimization of Cellulose Extraction of Blueberry Polysaccharide by Response Surface Methodology

SUN Li-na，F(xiàn)AN Ying-bing*，HU Dong-hui，YANG Yuan-tao，LIN Yu-tong
（College of Science，Heihe College，Heihe 164300，Heilongjiang，China）

The extraction process of wild blueberry polysaccharide was optimized by response surface methodology，and the decolorization process of polysaccharide was optimized.On the basis of single factor test，the three factors and three levels of enzyme addition，enzymolysis time and enzymolysis temperature were selected.The design experiment and result analysis were carried out by using Design-Expert software to obtain the method of enzymatic extraction of blueberry polysaccharide The optimum conditions were as follows：enzyme addition amount 0.57%，enzymolysis time 85 min，enzymolysis temperature 38℃，extraction rate 2.91%；the influence order of each factor was：enzymolysis temperature>enzyme dosage>enzymolysis time.

response surface methodology；cellulose；blueberry；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.010

黑河學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJZ201502）；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201613744022）

孫麗娜（1983—），女（漢），助教，碩士研究生，研究方向：天然藥物化學(xué)。

*通信作者：范英兵（1984—），男，講師。

2017-05-03