聶小偉，何粉霞，陳志兵，尹曉斌，孫冬梅，高森森，孫齊卓

（威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系，山東威海264300）

響應(yīng)面優(yōu)化海帶巖藻聚糖硫酸酯的提取工藝研究

聶小偉，何粉霞，陳志兵，尹曉斌，孫冬梅，高森森，孫齊卓

（威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系，山東威海264300）

以海帶加工下腳料為試驗材料，運用響應(yīng)面分析，優(yōu)化超聲波輔助酸液提取巖藻聚糖硫酸酯工藝條件。單因素試驗顯示，在超聲波功率為150 W，浸提2次時能達到較好穩(wěn)定效果。在上述基礎(chǔ)上，選取的自變量為浸提液pH值、液料比（mL/g）、浸提溫度（℃）和超聲波時間（min），響應(yīng)值為巖藻聚糖硫酸酯提取率（%），結(jié)合Box-Behnken試驗設(shè)計，探討巖藻聚糖硫酸酯提取率受各因素及其交互作用的影響。結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)：浸提液為pH1.60、液料比為37∶1（mL/g）、浸提溫度為78℃和超聲波處理時間為71 min。經(jīng)試驗驗證得到，33.86%的巖藻聚糖硫酸酯提取率與34.30%的理論預(yù)測值相比，其相對誤差為1.28%。由此可見，經(jīng)優(yōu)化的工藝參數(shù)可靠，回歸模型預(yù)測效果較好。研究結(jié)果可為從海帶加工下腳料中巖藻聚糖硫酸酯的提取提供技術(shù)參考。

巖藻聚糖硫酸酯；超聲波；海帶下腳料；響應(yīng)面分析；提取工藝

我國是海帶的主要產(chǎn)地，目前海帶主要被應(yīng)用于提取甘露醇、碘、褐藻酸鈉和加工成食品等，其利用的技術(shù)水平不高，同時產(chǎn)生大量的廢棄物。對其營養(yǎng)成分分析顯示，海帶干重的70%左右是人體所需的營養(yǎng)元素[1]，其中巖藻聚糖硫酸酯含量極為豐富。但大量的海帶加工下腳料因成分復(fù)雜，且廣泛存在于生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的下腳料中，難以處理和利用。通常將其作為廢棄物處理，在造成環(huán)境污染的同時，還使得大量的生物活性物質(zhì)的浪費。

海帶巖藻聚糖硫酸酯（fucoidan），是一種成分較為復(fù)雜的水溶性大分子多糖，主要是由硫酸基團和L-巖藻糖構(gòu)成。研究表明：它具有抗氧化[2]、抗凝血[3]、抗病毒[4-6]和抗腫瘤[7-8]等多種生理活性，并隨其在不同領(lǐng)域的應(yīng)用價值不斷推廣，對其需求量也在不斷增加。因此，如何有效利用海帶加工下腳料，提高其巖藻聚糖硫酸酯的提取率，是對其進行高質(zhì)化利用的關(guān)鍵。

本課題以海帶工業(yè)生產(chǎn)、加工食品中產(chǎn)生的海帶加工下腳料——廢棄物為原料，對超聲波輔助酸液提取巖藻聚糖硫酸酯工藝參數(shù)進行響應(yīng)面法中Box-Behnke試驗設(shè)計優(yōu)化研究，以期能夠為海帶加工廢棄料的綜合開發(fā)利用提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶加工下腳料：山東海之寶海洋生物科技有限公司提供。將其在60℃下烘干，用高速粉碎機粉碎，測定水分含量，待用。

L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鹽酸半胱氨酸（生化純）：國藥集團；檸檬酸：吳江市永和精細(xì)化工有限公司：95%乙醇：天津中和盛泰化工有限公司；濃硫酸：青島寶澤化工有限公司；氫氧化鈉：北京康普匯維科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-300D數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機：上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HH型恒溫水浴鍋：金壇市國旺實驗儀器廠；翔藝V1800型可見分光光度計：翔藝儀器（上海）有限公司；CP213型電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；SC-3612低速大容量離心機：中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海帶巖藻聚糖硫酸酯浸提工藝流程[9]

海帶→洗凈（流水沖洗）→烘干（風(fēng)速6 m/s、溫度60℃、3 h、測得水分含量6.8%）→粉粹（高速破碎，過60目篩）→按一定液料比（mL/g）加入一定pH值的檸檬酸溶液→超聲波處理（控制超聲波功率、溫度和時間）→浸提物離心→取上清液→用4 mol/L氫氧化鈉溶液中和→低溫減壓濃縮（真空度小于0.1 MPa，濃縮到原體積的1/3以上）→醇沉（用95%乙醇調(diào)節(jié)浸提液乙醇濃度至60%）→4℃以下靜置（至固液明顯分層）→離心取沉淀物（5 000 r/min，10 min）→用95%乙醇洗滌沉淀物，待用→真空干燥（0.1 MPa以下，40℃）→粗品（海帶巖藻聚糖硫酸酯）

1.3.2 海帶巖藻聚糖硫酸酯提取率的測定

1.3.2.1 巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別選定L-巖藻糖和純凈水為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和溶劑，配制成濃度為4%的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液（4 g/100 mL）。取6只具塞刻度試管，標(biāo)號為 1、2、3、4、5、6；分別準(zhǔn)確移取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 的上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，加純凈水至1.00 mL；隨后，分別加入4.50 mL硫酸溶液（水∶硫酸=6∶1，體積比），振蕩搖勻，在冰水浴中冷卻1 min；再放置于沸水浴10 min后，用自來水冷卻至室溫后分別加入3%的半胱氨酸鹽酸鹽溶液（3 g/100 mL）0.10 mL，搖勻，在 37℃水浴中靜置 90 min，分別測定其在396 nm和427 nm下的吸光度，平行測定3次取平均值。以吸光度之差的平均值為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程式為Y=19.857X+0.008 2，R2=0.998 3。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液質(zhì)量濃度在0.001 mg/mL～0.032 mg/mL范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性較好。

1.3.2.2 海帶巖藻聚糖硫酸酯提取率的計算[10]

將2次浸提液合并，經(jīng)減壓濃縮后，用純凈水定容至200 mL，準(zhǔn)確移取1.00 mL上述容量瓶中樣品液，按1.2.2.1方法操作，分別在波長為396 nm和427 nm下測定其吸光度，平行測定3次，取吸光度差值的平均值。按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和公式1-1計算海帶巖藻聚糖硫酸酯的提取率。

式中：n為稀釋倍數(shù)；C為樣品浸提液中巖藻聚糖硫酸酯的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為移取的測定浸提液體積，mL；W為試驗原料水分含量，%；m為稱取原料的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

準(zhǔn)確稱取2.50 g預(yù)處理樣品，以液料比35 mL/g加入pH2.0的浸提液，在超聲波功率120 W，浸提溫度60℃和浸提60 min條件下浸提2次，每個水平下重復(fù)3次，計算巖藻聚糖硫酸酯的平均提取率。其他條件固定，分別考察浸提液 pH 值（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00）、液料比（10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1、40 ∶1、45 ∶1、50 ∶1、55 ∶1、60 ∶1，mL/g）、浸提溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、超聲波時間（15、25、35、45、55、65、75、85、95、105 min）、超聲波功率（120、150、180、210、240、270、300 W） 對藻聚糖硫酸酯提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在前期試驗和1.2.3的基礎(chǔ)上，運用Box-Behnken試驗設(shè)計，以巖藻聚糖硫酸酯平均提取率作為響應(yīng)值，對浸提效果影響較大的4個因素，浸提液pH值、液料比、浸提溫度和超聲波時間及相應(yīng)水平進行條件優(yōu)化和響應(yīng)面分析，因素水平及編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken設(shè)計試驗因素水平及編碼Table 1 Levels and codes of independent variables used for Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差和響應(yīng)面分析，以及預(yù)測模型的建立，所有試驗平行重復(fù)3次，響應(yīng)值取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提次數(shù)的確定

圖1所示為不同浸提次數(shù)的藻聚糖硫酸酯提取率。

圖1 浸提次數(shù)對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響Fig.1 Effect of different temperature on extraction efficiency

從圖1中可以看出，當(dāng)浸提次數(shù)超過2次后，提取率變化不明顯。所以，確定浸提次數(shù)為2次，并對超聲波輔助酸液浸提工藝進行優(yōu)化。

2.2 單因素試驗結(jié)果[12]

2.2.1 浸提液pH值對海帶巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響

巖藻聚糖硫酸酯浸提效果受浸提液pH值的影響，見圖2。

圖2 pH值對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響Fig.2 Effect of different pH on extraction efficiency

由圖2可知，浸提液pH值在1.10～1.50之間，浸提效果隨之增加；浸提液pH值為1.50～3.0時，浸提效果隨之降低；當(dāng)浸提液pH值在3.50～5.00之間時，浸提效果趨于平緩，變化不大。由此可見，液料比為40∶1（mL/g），浸提溫度70℃，超聲波功率為150 W下浸提75 min時，巖藻聚糖硫酸酯的提取率受浸提液pH值的影響較大。pH值過低，酸性較強，可能會導(dǎo)致巖藻聚糖硫酸酯降解，破壞其結(jié)構(gòu)；pH值過大，會導(dǎo)致褐藻膠和褐藻酸沉淀不完全，均會造成巖藻聚糖硫酸酯浸提效果不佳。因此，選定pH 1.50為較佳的浸提液pH值。

2.2.2 液料比對海帶巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響

巖藻聚糖硫酸酯浸提效果受液料比的影響，見圖3。

圖3 液料比對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響Fig.3 Effect of different liquid-solid ratio on extraction efficiency

由圖3可知，巖藻聚糖硫酸酯提取率隨著液料比的增加而提高。尤其液料比在 10∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）之間時，提取率增加較快；在 35∶1（mL/g）～60∶1（mL/g）之間時，提取率的變化不明顯。這可能是由于浸提液較多，超聲波難于作用到樣品，使得巖藻聚糖硫酸酯溶出速度減慢，導(dǎo)致提取率的增加緩慢。在實際生產(chǎn)過程中，如果浸提溶劑量太大，后續(xù)濃縮困難，導(dǎo)致能耗增加和工作效率降低等問題，因此確定液料比為35∶1（mL/g）較佳。

2.2.3 提溫度對海帶巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響

巖藻聚糖硫酸酯浸提效果受浸提溫度的影響，見圖4。

從圖4中可以看出，當(dāng)溫度在30℃～50℃之間時，提取率增加趨于平緩；當(dāng)溫度在50℃～80℃之間時，提取率隨溫度的升高而顯著提高?？赡苁怯捎跍囟仍礁撸肿泳哂懈邉幽?，運動速度更快，目標(biāo)物質(zhì)溶出增加。但過高的溫度會增加能耗，造成儀器設(shè)備損壞。因此，將浸提溫度選定為70℃較合適。

圖4 浸提溫度對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響Fig.4 Effect of different temperature on extraction efficiency

2.2.4 浸提時間對海帶巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響

巖藻聚糖硫酸酯浸提效果受浸提時間的影響，見圖5。

圖5 浸提時間對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響Fig.5 Effect of different time on extraction efficiency

由圖5可見，浸提時間在10 min～65 min之間時，提取率隨時間延長而升高。但浸提時間超過65 min之后，提取率略有降低，并且隨后變化趨于平緩。可能是隨加熱時間延長，物料獲取能量越大，分子運動更劇烈，溶出量越大；但時間過長，能量過高，導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)破壞。同時，避免造成能耗較大等問題，所以選擇超聲輔助浸提時間65 min較合適。

2.2.5 超聲波功率對海帶巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響[13]

巖藻聚糖硫酸酯浸提效果受超聲波功率的影響，見圖6。

由圖6可見，超聲波功率在120 W～180W之間，提取率隨之增加較大；超聲波功率在180 W～240W之間，提取率變化不明顯。當(dāng)超聲波功率在240 W～300W之間時，提取率隨功率的增加顯著降低。但在各水平下提取率均達到30%以上，可推斷超聲波功率對巖藻聚糖硫酸酯提取率影響不顯著。同時表明，超聲波功率過大，可能會造成巖藻聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)的破壞和分子降解。因此，固定超聲波功率為150 W，進行其他因素各水平的浸提優(yōu)化試驗。

圖6 浸提功率對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響Fig.6 Effect of different power on extraction efficiency

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面法分析數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性分析[14]

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定浸提液pH值（X1）、液料比（X2）、浸提溫度（X3）、超聲波時間（X4）為影響因素，巖藻聚糖硫酸酯提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗設(shè)計原理，實施四因素三水平的響應(yīng)面分析。運用Design-Expert 8.0試驗設(shè)計軟件，分析處理表2中試驗結(jié)果數(shù)據(jù)，得到二次多元回歸方程預(yù)測模型：

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

續(xù)表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 2 Box-Behnken design with experimental results

對試驗結(jié)果表2中數(shù)據(jù)進行方差分析與顯著性檢驗，見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

結(jié)果表明，該回歸模型高度顯著（P＜0.001），失擬項不顯著，決定系數(shù)R2=0.826 1，R2Adj=0.652 1，說明此回歸模型與實際擬合度較好。預(yù)測模型方程能很好地擬合真實的響應(yīng)面，可以很好的用于超聲波輔助酸液提取海帶加工廢棄料中海帶巖藻聚糖硫酸酯的提取的工藝條件預(yù)測。

同時，可以得出以下結(jié)論：通過F檢驗確定4個因素對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響大小為：X3＞X4＞X2＞X1，即浸提溫度（℃）＞超聲波時間（min）＞液料比（mL/g）＞浸提液pH值。該回歸模型中一次項X3，二次項X12、X32和交互項X2X3、X3X4影響達到高度顯著水平（P＜0.01）；二次項 X22、X42和交互相 X1X3影響達到顯著水平（P＜0.05）；可見，各因素對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.3.2 響應(yīng)面曲面分析[15]

響應(yīng)面曲面分析見圖7。

圖7 各兩因素交互作用對巖藻聚糖硫酸酯提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot showing the effects of four variables on the extraction rate of fucoidan

響應(yīng)面圖形狀，能反映出各因素之間交互作用的強弱程度。當(dāng)曲面坡度越陡峭、等高線越成橢圓形，表示兩因素交互作用影響越強；當(dāng)曲面坡度越平緩、等高線越成圓形，表示兩因素交互作用影響越弱。如圖7b、7c、7d所示，響應(yīng)面坡度較陡峭，且形成橢圓較大，表明浸提溫度和浸提液pH值、浸提溫度和超聲波時間、浸提溫度和液料比兩兩因素之間交互作用較強。如圖7a、7e、7f所示，曲面坡度較為平緩，等高線顯現(xiàn)圓形，表明液料比和浸提液pH值、超聲波時間和浸提液pH值、液料比和超聲波時間的兩兩因素交互效應(yīng)較弱。同時，由圖7b、7c可看出，隨著浸提液溫度的升高，巖藻聚糖硫酸酯提取率明顯提高，也表明浸提溫度對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響較大；當(dāng)浸提溫度為70℃～80℃時，提取率達到最高。在試驗考察范圍內(nèi)，綜合分析圖7和表3，可以得出考察因素：浸提溫度、超聲波時間、液料比和浸提液pH值對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響依次減弱。

2.4 提取工藝條件的驗證與確定[16]

為了更明確巖藻聚糖硫酸酯提取的最佳工藝參數(shù)，在模型參數(shù)范圍內(nèi)采用Design Expert軟件進行進一步優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：浸提液pH為1.57、液料比為 36.925∶1（mL/g）、浸提溫度為 77.85℃、超聲波時間為71.05 min；按上述條件，由預(yù)測模型得到巖藻聚糖硫酸酯提取率的最大理論值為34.29%。對響應(yīng)面法進行可靠性檢驗，結(jié)合實際試驗條件，對提取工藝參數(shù)進行了適當(dāng)修正：浸提液pH值為1.60、液料比為37∶1（mL/g）、浸提溫度為78℃、超聲波時間為 71min。在該修正參數(shù)下，得到理論預(yù)測值為34.30%，驗證試驗的平均提取率為33.86%。與理論預(yù)測值相比較，計算其相對誤差為1.28%。

3 結(jié)論

1）以單因素試驗為基礎(chǔ)，采用Box-Behnken試驗設(shè)計，構(gòu)建超聲波輔助酸液浸提巖藻聚糖硫酸酯的優(yōu)化回歸模型。在該試驗條件范圍內(nèi)，此模型能準(zhǔn)確預(yù)測巖藻聚糖硫酸酯提取率。

2）通過對Box-Behnken試驗設(shè)計的試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，得到浸提溫度（℃）、超聲波時間（min）、液料比（mL/g）和浸提液pH值對巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響依次減弱。

3）超聲波輔助酸液浸提巖藻聚糖硫酸酯優(yōu)化的較佳工藝參數(shù)為浸提液pH值為1.60、液料比為37∶1（mL/g）、浸提溫度為78℃、超聲波時間為71 min。在該工藝條件下，驗證試驗的平均提取率為33.86%，與理論預(yù)測值相比較，其相對誤差為1.28%。結(jié)果表明，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的超聲波輔助酸液浸提海帶加工廢棄料中巖藻聚糖硫酸酯浸提工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可信，具有較高的實用價值。

研究結(jié)果表明，通過超聲波輔助酸液浸提海帶加工廢棄料中巖藻聚糖硫酸酯，與傳統(tǒng)方法對比，不僅大大縮短了浸提時間和降低了加熱溫度，提高了提取率；而且避免了環(huán)境的污染，提高了海帶資源的利用率。為海帶化工業(yè)和食品加工廢棄料中巖藻聚糖硫酸酯的進一步開發(fā)提供了理論技術(shù)依據(jù)。

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Study on the Extraction Technology of Fucoidan from Kelp Off-cuts by Response Surface Methodology

NIE Xiao-wei，HE Fen-xia，CHEN Zhi-bing，YIN Xiao-bin，SUN Dong-mei，GAO Sen-sen，SUN Qi-zhuo
（College of Food Engineering，Weihai Ocean Vocational College，Weihai 264300，Shandong，China）

The kelp off-cuts was used as raw materials.The ultrasonic-assisted extraction of fucoidan from kelp off-cuts with acidizing fluid.Fucoidan was optimized using the response surface methodology.The results of onefactor-at-a-time experiments showed that provided the best stability for the proanthocyanidins under power ultrasonics 150 W and extraction two times.pH，liquid to solid ratio（mL/g），extraction temperature（℃），and ultrasonic time（min）were selected as independent variables，while the extraction yield of fucoidan（%）was taken as response variable.The optimization was carried out based on Box-Behnken experimental design by investigating the individual and combined effects of the four factors on the response variable.The optimum extraction conditions were determined as follows：pH was 1.60 water extract with solid-liquid ratio of 37 ∶1（mL/g）at 78℃for 71 min.Under these conditions，the fucoidan yield obtained was 33.86%with a relative error of 1.28%as compared with the model prediction of 34.30%indicating that these parameters are reliable.The experiment result was consistent with the prediction result.This research can provide a technical reference for fucoidan extraction from kelp off-cuts.

fucoidan；ultrasonic；kelp off-cuts；response surface methodology；extraction process

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.008

2016年山東省高等學(xué)?？萍加媱濏椖浚↗16LE60）；2015年山東省高等學(xué)?？萍加媱濏椖浚↗15LE55）

聶小偉（1984—），男（漢），講師，碩士研究生，研究方向：海洋食品綜合資源開發(fā)利用。

2017-04-11