應瑞峰，黃梅桂，*，王耀松，李婷婷，2，范龔健，吳彩娥

（1.南京林業(yè)大學輕工科學與工程學院，江蘇南京210037；2.浙江森養(yǎng)道生物科技有限公司，浙江蘭溪321100）

超聲波微波協(xié)同提取青錢柳超微粉多糖及活性研究

應瑞峰1，黃梅桂1，*，王耀松1，李婷婷1，2，范龔健1，吳彩娥1

（1.南京林業(yè)大學輕工科學與工程學院，江蘇南京210037；2.浙江森養(yǎng)道生物科技有限公司，浙江蘭溪321100）

應用超聲波微波復合法提取青錢柳葉超微粉多糖，試驗在不同提取時間、液料比、超聲波功率和微波功率等條件下測定多糖的提取率，選出最佳超聲波-微波協(xié)同提取工藝。超聲波微波輔助提取法的最佳工藝為超聲功率360 W，微波功率100 W，處理時間20 min，多糖得率高達10.02%。對熱水法和超聲波微波法提取的多糖進行抗氧化，抗腫瘤和降血糖的活性測定，試驗結果顯示青錢柳多糖具有很強的抗氧化性，較弱的抗腫瘤活性和很強的α-葡萄糖苷酶抑制能力。超聲波微波提取的青錢柳多糖其生物活性顯著高于熱水法提取的多糖。試驗結果表明超聲波微波提取法不但效率高，而且可以提高多糖的活性。

青錢柳；多糖；超聲波；微波；降血糖

青錢柳又名青錢李，搖錢樹等，是冰川世紀時期幸存下來的珍貴樹種，是我國特有的植物，屬于國家二級保護樹種。青錢柳廣泛分布于我國各地，比較集中分布在江西、湖北、浙江等地，生長在在海拔420～2500米的山區(qū)或石灰?guī)r山地[1-2]。多年的研究發(fā)現(xiàn)青錢柳葉中含有多種活性成分，包括黃酮類物質、三萜類物質、多糖、有機酸類等，具有重要的生理活性功能，尤其青錢柳葉多糖，具有降血糖、降血壓、抗氧化等多種重要的生物活性[3-8]。目前，植物多糖的提取主要包括熱水浸提法和酸、堿提取法。熱水浸提法成本低、操作簡單，而且提取過程比較溫和，多糖分子結構不被破壞，但提取得到的多糖往往得率低，含量也低的缺點。對于植物多糖的提取，可以加酸或加堿提高多糖的提取率，但強酸、強堿會引起多糖的糖苷鍵斷裂，從而影響多糖的活性并且會造成環(huán)境污染。近年來，超聲微波協(xié)同提取技術逐步被應用到植物活性多糖的輔助提取，超聲波提取技術主要是利用超聲波對溶劑的空化作用和次級效應，更易于植物多糖的浸出和擴散。微波輔助提取技術是利用微波射線能夠輻射溶劑并加熱植物細胞內(nèi)部，破壞植物的細胞壁，使多糖更容易從細胞中釋放出來，并溶解到溶劑中[9-10]。本研究應用超聲波協(xié)同微波法對青錢柳葉超微粉進行多糖的提取，尋找最佳提取條件，最大限度地提高多糖得率，對提取得到的多糖進行活性研究，其研究結果能為青錢柳開發(fā)和綜合利用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳葉：由南京林業(yè)大學白馬基地提供；實驗用水為超純水；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、DMSO：Sigma公司；96孔細胞培養(yǎng)板：Costar公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清：Gibco公司；Eno－GeneCellTMCounting Kit-8（CCK-8）細胞活力檢測試劑盒：南京恩晶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

XO-SM200超聲波微波復合反應系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；QT-58A智能紫外檢測儀：上海琪特分析儀器有限公司；激光粒度分析儀歐美克LSPOS（Ⅵ）：珠海歐美克儀器有限公司；TU-1800PC紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；XD-202熒光倒置生物顯微鏡：南京江南永新光學有限公司；Quanta 200環(huán)境掃描電鏡：美國FEI公司；Thermo MK3酶標儀：美國熱電公司。

1.3 提取方法與試驗條件

1.3.1 超微粉碎法

利用噴射空氣將青錢柳干葉加速到聲速，粒子與壁面產(chǎn)生劇烈的沖擊碰撞、摩擦、剪切使干葉粉碎。粉碎后的細料隨上升氣流傳送到分級區(qū)，并從分級口出來，這部分顆粒為細粉，未被分級器分選的粗料重新返回粉碎。

1.3.2 激光粒度分析法

取1 g青錢柳葉微粉加入10 mL去離子水，制成懸浮液，用去離子水稀釋至300 mL，充分分散，試驗過程中轉速為2 500 r/min，超聲2 min，無氣泡出現(xiàn)，試驗重復3次。

1.3.3 掃描電子顯微鏡樣品制備及觀察

青錢柳葉顆粒干燥之后，鍍金處理，掃描電鏡觀察。

1.3.4 提取步驟

多糖超聲波微波法提取工藝：青錢柳→超微粉碎→超聲波微波復合提取→過濾→80%醇沉→離心→沉淀復溶→透析→醇沉→干燥→多糖。

多糖熱水法提取工藝：青錢柳→超微粉碎→熱水提取→過濾→80%醇沉→離心→沉淀復溶→透析→醇沉→干燥→多糖。

1.3.5 單因素試驗

提取時間的選擇：取2.0 g的青錢柳干粉加入100 mL蒸餾水，提取過程超聲波功率為360 W，處理10、20、30、40、50、60 min，測定多糖提取率；液料比對多糖提取率的影響：取青錢柳干粉，以 5、10、20、30、40 mL/g的液料比，360 W的超聲波功率處理30 min，分別測定多糖得率；超聲波功率對多糖提取率的影響：取青錢柳粉，按照液料比30 mL/g加入蒸餾水，超聲功率分別為 120、240、360、480、600、720 W 條件下，超聲波處理30 min，分別測定多糖提取率；微波功率對青錢柳多糖提取率的影響：取青錢柳粉，按照液料比30mL/g加入去離子水，分別在 100、200、300、400、500W條件下，超聲波處理30 min，分別測定多糖提取率。

1.3.6 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用三因素三水平，按L9（34）正交設計進行青錢柳多糖熱水提取正交試驗，以總糖得率作為響應值，每組試驗均重復3次。

1.4 多糖含量測定

采用苯酚－硫酸法，以葡萄糖為標準品，測定總糖含量。

1.5 活性試驗條件

1.5.1 青錢柳多糖體外抗氧化活性

清除超氧陰離子的測定：將桑黃多糖用Tris-HCl緩沖液（pH8.0，16 mmol/L）溶解，制成不同濃度的樣品溶液。氯化硝基四氮唑藍（Nitrotetrazolium Blue chloride，NBT）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH） 均用 Tris-HCl緩沖液（pH8.0，16 mmol/L）溶解，濃度分別為 300、468 μmol/L；吩嗪硫酸甲酯（Phenazine methosulfate，PMS）用蒸餾水溶解，濃度為60 μmol/L。取1.50 mL不同濃度的樣品溶液，0.50 mL NBT，0.5 mL NADH，混勻，并且加入0.5 mL的PMS，將樣品換為1.50 mL的緩沖溶液作為空白對照，相同的操作方法，在25℃的水浴中放置5 min后測定吸光度（波長為560 nm），樣品重復3次。超氧負離子清除率I的計算公式如下：

式中：I為樣品對超氧負離子的清除率（Scavenging effect）；A樣品為樣品測試值；A空白為空白對照值。

清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH自由基）能力測定：稱取樣品分別配制成12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL 濃度的溶液。配制 0.1 mmol/L DPPH溶液。準確移取各個待測液2.0 mL于10 mL透明試管中。使用移液管分別加入2.0 mL，0.1 mmol/L DPPH溶液，用震蕩機混勻，放置一段時間，再用紫外分光光度計測定517 nm波長處的吸光度，記為A樣品。做3組平行試驗。準確移取各濃度待測液2.0 mL與相應溶劑（水）2.0 mL，再用震蕩機混勻，放置一段時間，測定在517 nm波長處的吸光度，記為A對照。準確移取DPPH溶液2.0 mL與相應溶劑（無水乙醇）2.0 mL，震蕩機混勻，測定在517 nm波長處的吸光度，記為A空白。為了分析試驗結果，VC作為陽性對照物，按以下公式計算DPPH自由基清除率：

式中：I為樣品對DPPH自由基的清除率；A樣品為樣品測試值；A空白為空白值；A對照為對照值。

1.5.2 青錢柳多糖體外抗腫瘤活性

CCK-8染色法檢測細胞活力：取活細胞進行實驗，細胞增殖抑制試驗采用EnoGeneCellTMCounting Kit-8（CCK-8）細胞活力檢測試劑盒?？装逯忻靠准尤?00 μL的細胞懸液，孔板在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，試驗設立陰性對照組，溶媒對照組，陽性對照組，孔板在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，孔內(nèi)加入10μLCCK-8溶液，培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm處的OD值，計算樣品對人宮頸癌細胞Hela細胞的抑制率。

式中：I為樣品對宮頸癌細胞Hela細胞的抑制率；A樣品為樣品測試值；A空白為空白值。

1.5.3 青錢柳多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制測定

2 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）和1 mL 0.01 U/mL的α-葡萄糖苷酶加入空白試管中；1.5 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）與1.5 mL不同濃度的樣品溶液和1 mL 0.01 U/mL的α-葡萄糖苷酶加入樣品管中；2.5 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）和0.5 mL不同濃度的樣品溶液加入背景管中。將空白管、樣品管和背景管于37℃水浴15 min后，各管中加入1 mL，2.5 mol/L的底物（PNPG），于37℃水浴反應30 min后，各管中再加入4 mL，0.1 mol/L Na2CO3溶液終止反應，在波長405 nm處測定吸光值。不同濃度樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率根據(jù)公式計算：

式中：I為樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率；A樣品為樣品測試值；A空白為空白值；A背景為對照值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 12.0軟件進行數(shù)據(jù)分析（t檢驗），分析組間差異。實驗數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結果與分析

2.1 超微粉碎青錢柳粒徑分析

超微粉碎青錢柳粒徑分析見圖1。

圖1顯示經(jīng)超音速氣流粉碎后的青錢柳顆粒細小，粒度分布較窄，不存在較大組織塊，顆粒粒徑遠小于 100 μm，顆粒分布區(qū)間大致為 0.30 μm～30 μm，因此此方法適合青錢柳干葉等這類熱敏性及生物活性物質的粉碎。激光粒度分析儀測定青錢柳細粉的粒徑[11-12]，青錢柳粒徑為 0.2 μm～30 μm 的顆粒，平均粒徑為 10 μm。

2.2 超聲波微波協(xié)同作用

青錢柳葉微粉多糖的提取分析見圖2。

圖2 提取條件對青錢柳多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction conditions on the extraction yield of polysaccharides from Cyclocarya paliurus

圖2顯示青錢柳葉微粉多糖的提取率在熱水提取的過程當中，隨著液料比值的不斷增大，得率會顯著增高，較高的液料比加快了水的傳質過程，當液料比為30mL/g時，青錢柳多糖得率最高。隨著超聲波功率的加大（≤360 W），多糖得率大幅的增加，功率在360 W時多糖的得率達到最高值。提取過程中，多糖得率隨著超聲波作用時間增加而增大，30 min內(nèi)的增加趨勢明顯，30 min時達到最大值，30 min之后多糖得率反而緩慢下降。超聲波作用于青錢柳時間太長，很可能會使青錢柳中的多糖成分受到一定的破壞，而使得率降低。微波功率在300 W時，多糖的提取率最高，超過300 W，提取率趨于穩(wěn)定。

以超聲波功率、提取時間和微波功率作為影響青錢柳多糖提取率的因素，在單因素試驗的基礎上，設計了L9（34）正交試驗方案，進一步研究超聲波微波協(xié)同提取青錢柳多糖的最優(yōu)提取參數(shù)，結果見表1～表3。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

表2 正交試驗設計與結果Table 2 Results and range analysis of orthogonal array design

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Analysis of variance in orthogonal array design

表1～表3顯示，試驗顯著性最強的單因素為超聲波功率，其次是提取時間。提取最優(yōu)參數(shù)為：超聲功率360 W，微波功率100 W，提取時間40 min，通過試驗驗證，在360 W超聲功率，微波功率100 W，提取20 min時青錢柳多糖的提取率最高。由此并聯(lián)系實際，可得出超聲波微波輔助提取法的最佳工藝為超聲功率360 W，微波功率100 W，在提取時間為20 min，液料比30 mL/g時，多糖得率高達10.02%。青錢柳超微粉超聲波微波法多糖得率極顯著高于熱水法多糖得率4.51%（同等液料比與提取時間），并且其多糖含量為26.11%，顯著高于青錢柳熱水法18.23%。超聲波微波輔助提取是基于超聲波和微波場的瞬時穿透性加熱方式進行提取的方法，使青錢柳干葉微粉在微波場作用下迅速產(chǎn)生大量熱能，可加速葉內(nèi)多糖由固體內(nèi)部向固液界面擴散的速率。超聲波微波提取顯著地優(yōu)于傳統(tǒng)熱水提取法，此項技術有效提高了提取的選擇性，減少了提取時間。超聲波微波協(xié)同條件下多糖的提取是一快速的組織崩解過程，這一過程使提取時間縮短，而且多糖得率和品質提高[11-12]。

2.3 青錢柳多糖活性研究

青錢柳葉多糖的抗氧化分析見圖3和圖4。

圖3 青錢柳多糖對DPPH自由基的清除率曲線Fig.3 Scavenging curves of the polysaccharides from Cyclocarya paliurus DPPH radicals

圖4 青錢柳多糖對超氧陰離子清除率曲線Fig.4 Scavenging curves of the polysaccharides from Cyclocarya paliurus superoxide anion radicals

在多糖提取率提高的情況下，試驗對熱水法和超聲波微波提取的多糖進行清除DPPH自由基和清除超氧陰離子的活性測定（圖3和圖4），考察多糖活性的差異，試驗結果顯示隨著青錢柳多糖濃度的逐漸增加，其清除DPPH自由基和超氧陰離子的能力增強，而且清除效果與青錢柳質量濃度之間存在明顯的量效關系。雖然青錢柳多糖清除DPPH自由基和超氧陰離子的能力不及VC，但也呈現(xiàn)很強的抗氧化性。超聲波微波提取的青錢柳多糖其抗氧化活性高于熱水法提取的多糖。

青錢柳葉多糖的抗腫瘤分析見圖5。

圖5 多糖質量濃度對Hela癌細胞的抑制率Fig.5 Effects of different polysaccharide concentrations on inhibitive rate of cancel cell Hela

對熱水法和超聲波微波提取的多糖進行抗腫瘤對比試驗（圖5），青錢柳多糖對癌細胞HepG2有較弱的細胞毒活性，超聲波微波提取的青錢柳多糖其抗腫瘤活性略強。

青錢柳葉多糖的α-葡萄糖苷酶抑制分析見圖6。

圖6 青錢柳多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.6 Inhibition rate of α-glucose glycoside by the polysaccharides from Cyclocarya paliurus

α-葡萄糖苷酶抑制劑用于治療II型糖尿病，它是腸道吸收過程中的關鍵酶，淀粉等碳水化合物在α-葡萄糖苷酶的作用下轉化為葡萄糖，通過小腸的吸收，進入血液。因此抑制ɑ-葡萄糖苷酶活性，能夠延緩小腸消化吸收碳水化合物，對維持人類的血糖值有著重要作用[13-16]。如圖6可見，當樣液濃度在0～100 mg/mL范圍時，青錢柳多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨著樣液濃度的增加而增加。濃度在90 mg/mL時，青錢柳多糖抑制率最高為97.9%，當樣品濃度大于70 mg/mL時，青錢柳多糖對葡萄糖苷酶的抑制率已趨于平緩。青錢柳葉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著多糖濃度的增加，存在量效關系，其中超聲波微波提取的多糖的 IC50值比較小，為（14.50±0.50）mg/mL，抑制活性極顯著高于熱水提取青錢柳多糖（21.10±1.02）mg/mL。試驗結果表面，超聲波微波協(xié)同提取法不但效率高，而且可以一定限度地提高多糖的活性。

3 結論

傳統(tǒng)熱水提取法，青錢柳葉超微粉多糖得率僅為4.51%，應用超聲波微波復合法提取青錢柳葉超微粉多糖，有效提高了提取率，多糖得率高達10.02%。超聲波微波輔助提取法的最佳工藝為超聲功率360 W，微波功率100 W，處理時間20 min。兩種方法提取的青錢柳多糖，進行了活性研究，發(fā)現(xiàn)通過超聲波微波復合提取的青錢柳多糖有較好的抗氧化和降血糖活性。

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Ultrasonic-Microwave Synergistic Extraction and Activity of Polysaccharides from Cyclocarya paliurus

YING Rui-feng1，HUANG Mei-gui1，*，WANG Yao-song1，LI Ting-ting1，2，F(xiàn)AN Gong-jian1，WU Cai-e1
（1.College of Light Industry of Science and Engineering，Nanjing Forest University，Nanjing 210037，Jiangsu，China；2.Zhejiang Senyangdao Biotechnology Co.，Ltd.，Lanxi 321100，Zhejiang，China）

Ultrasonic-microwave synergistic extraction of polysaccharides from Cyclocarya paliurus was proposed.The optimal conditions of extraction time，solvent-to-solid ratio，ultrasonic power and microwave power for extracting polysaccharides from Cyclocarya paliurus were studied，respectively.The combined use of ultrasonic and microwave provided a time-saving and high-yield method for polysaccharides extraction from Cyclocarya paliurus.The optimal conditions of extraction was ultrasonic power 360 W，microwave power 100 W and the treatment time 20 min，the yield extraction of polysaccharides was 10.02%.The antioxidant，antitumor activity and hypoglycemic activity of the polysaccharide from Cyclocarya paliurus were studied，the polysaccharides had very strong antioxidant ability，low antitumor activity and high hypoglycemic activity.The polysaccharide extracted by ultrasonic microwave method exhibited higher activity.The results showed the method was not only efficient，but also can improve the activity of polysaccharides.

Cyclocarya paliurus；polysaccharides；ultrasonic；microwave；hypoglycemic

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.006

國家自然青年科學基金資助項目（31600153）；南京林業(yè)大學引進高層次人才和高層次留學回國人員科研基金（GXL2013026）作者簡介：應瑞峰（1982—），男（漢），副教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物。

*通信作者

2017-09-04