， ， ， ， (.福建省熱帶作物科學研究所， 福建 漳州 36300；.福建省莆田市湄洲灣北岸經(jīng)濟開發(fā)區(qū)住房和城鄉(xiāng)建設局園林處， 福建 莆田 355)

高山羊齒孢子的組織培養(yǎng)

何雪嬌1，余智城1，鄭少緣2，林金水1，林智明1
(1.福建省熱帶作物科學研究所， 福建 漳州 363001；2.福建省莆田市湄洲灣北岸經(jīng)濟開發(fā)區(qū)住房和城鄉(xiāng)建設局園林處， 福建 莆田 351152)

[目的]探討不同滅菌方式對組織培養(yǎng)中高山羊齒孢子成活率的影響以及不同培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)率的影響。[方法]利用NaClO、NaClO+酒精、升汞、升汞+酒精、升汞+NaClO、酒精這6種不同滅菌方式研究其對高山羊齒孢子成活率的影響；考慮4因素基本培養(yǎng)基、蔗糖、NAA、6-BA進行L16(44)正交設計，研究其對高山羊齒孢子萌發(fā)率的影響。[結果]6種滅菌處理中，NaClO+酒精的滅菌效果最好；酒精的滅菌效果最差；在正交實驗中，以1/2 MS+3%蔗糖+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA為高山羊齒孢子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，萌發(fā)率達63.69%，以不加任何激素的MS培養(yǎng)基中萌發(fā)率最低。[結論]2種不同的滅菌劑混合使用比單獨使用滅菌劑的效果好；基本培養(yǎng)基對高山羊齒孢子萌發(fā)率的影響最大，影響順序為：基本培養(yǎng)基gt;6-BAgt;蔗糖gt;NAA。

高山羊齒； 滅菌方式； 組織培養(yǎng)； 孢子成活率； 孢子萌發(fā)率

高山羊齒屬骨碎補科骨碎補屬植物，因其獨特的葉型、具有金屬光澤的濃綠葉色、有較長瓶插壽命而成為一種新興的切葉材料，備受推崇。分株繁殖是高山羊齒主要的繁殖方式，但需要的母株量很大。高山羊齒葉背的孢子量很大，利用孢子進行繁殖，具有增殖速度快、繁殖系數(shù)大等特點。孢子繁殖在國內(nèi)外觀賞蕨中應用較為廣泛，如鐵線蕨[1-3]、莢果蕨[4]、江南星蕨[5]、白玉鳳尾蕨[6]、海南白桫欏[7]、紫萁[8-9]、猴腿蹄蓋蕨[10]、多齒蹄蓋蕨[11]、華槲蕨[12]、大葉黑桫欏[13]等。孢子的無菌消毒對孢子成活率的影響較大；在進行無菌培養(yǎng)時，培養(yǎng)基組分對孢子萌發(fā)率的影響很大。通過不同滅菌方式和不同培養(yǎng)基對高山羊齒孢子成活率及萌發(fā)率的影響來探討高山羊齒的無菌培養(yǎng)的最適條件，旨在加快高山羊齒的繁殖進程，緩解高山羊齒在繁殖過程中對母株的需求壓力，并可對其種質(zhì)進行有效的保存，并為此物種的開發(fā)利用、物種的起源及演化進程及育種等方面的研究奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

高山羊齒葉背孢子采集于福建省熱帶作物科學研究所。將具有成熟孢子囊的葉片剪下，噴洗吸干，剪成小塊狀，放入潔凈的收集袋中，置于實驗室中的干燥通風處，待孢子自然散落后，將混在孢子中的葉片、莖桿等雜物挑干凈，收集于硫酸紙袋中[14]，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 不同滅菌方法對高山羊齒孢子萌發(fā)率的影響

用雙層紗布將供試高山羊齒孢子包好，用少許洗滌液輕輕搓洗后，用自來水沖洗5遍，再置于不間斷水流下沖洗3 h，然后再將處理好的孢子進行不同方法滅菌，研究不同的滅菌方法對高山羊齒孢子萌發(fā)率的影響。供試方法[14]有： 1) 將用單層紗布包裹好的高山羊齒孢子完全浸入70%酒精中滅菌10 s，然后用無菌水沖洗5次； 2) 將用單層紗布包裹好的高山羊齒孢子完全浸入2%NaClO中滅菌20 min，然后用無菌水水沖洗5次； 3) 將用單層紗布包裹好的高山羊齒孢子完全浸入0.2%升汞中滅菌5 min，然后用無菌水沖洗5次； 4) 將用單層紗布包裹好的高山羊齒孢子完全浸入2%NaClO中滅菌20 min，然后用無菌水沖洗5次，接著再放入70%酒精中滅菌10 s，再用無菌水沖洗5次； 5) 將用單層紗布包裹好的高山羊齒孢子完全浸入0.2%升汞中滅菌5 min，然后用無菌水沖洗5次，接著再放入70%酒精中滅菌10 s，再用無菌水沖洗5次； 6) 將用單層紗布包裹好的高山羊齒孢子完全浸入0.2%升汞中滅菌5 min，然后用無菌水沖洗5次，接著再放入2%NaClO中滅菌20 min，再用無菌水沖洗5次；每個處理接種10個培養(yǎng)皿，重復3次。

1.2.2 培養(yǎng)基的選擇

采用不同無機鹽濃度的MS培養(yǎng)基、不同蔗糖濃度、不同濃度的6-BA、不同濃度的NAA進行四因素四水平的正交設計，各因素所采用的水平如下：

培養(yǎng)基：MS、1/2 MS、1/4 MS、1/8 MS；

蔗糖濃度(%)：0、1、2、3；

6-BA濃度(mg/L)：0、0.5、1、2；

NAA濃度(mg/L)：0、0.1、0.2、0.3。

L16(44)正交試驗見表1。

共計16個組合，每個處理接種10個培養(yǎng)皿，3次重復。每升培養(yǎng)基中含瓊脂7 g，配置好的培養(yǎng)基pH值為5.6～5.8。將配好的培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中，在高壓鍋內(nèi)溫度達到121 ℃，壓力為0.1 MPa的條件下持續(xù)滅菌20 min。滅菌完成后取出備用。

1.2.3 高山羊齒孢子萌發(fā)率的測定

高山羊齒孢子在培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d左右表面開始顯現(xiàn)綠色。此時即可將培養(yǎng)皿放在顯微鏡下觀察，一個培養(yǎng)皿可隨機挑選3個視野，統(tǒng)計每個視野的孢子總數(shù)和孢子萌發(fā)數(shù)，用孢子萌發(fā)數(shù)除以孢子總數(shù)即為孢子萌發(fā)率。3個視野的平均值即為一個培養(yǎng)皿的孢子萌發(fā)率值[15]。

表1 正交試驗設計

試驗編號基本培養(yǎng)基蔗糖濃度(%)6?BA濃度(mg/L)NAA濃度(mg/L)1MS0002MS10．50．13MS210．24MS320．351/2MS00．50．261/2MS100．371/2MS22081/2MS310．191/4MS010．3101/4MS120．2111/4MS200．1121/4MS30．50131/8MS020．1141/8MS110151/8MS20．50．3161/8MS300．2

2 結果與分析

2.1 滅菌方式的確定

在試驗過程中，分別采用70%酒精、0.2%升汞和2%NaClO這3種滅菌劑單獨使用和兩兩配合的方式，研究幾種不同滅菌方法對高山羊齒孢子萌發(fā)的影響，結果見表2。由表2可看出，當滅菌劑單獨使用時，效果最差的是70%酒精，污染率達到100%；效果最好的是0.2%升汞； 2%NaClO居中。當滅菌劑兩兩配合使用時，有較好的滅菌效果，且比單獨使用滅菌劑的效果好。6種滅菌處理中，處理4效果最好，成活率達到66.67%；處理6方式僅次之，污染率為36.67%，成活率為63.33%，處理6采用的是升汞和NaClO相結合的方式，但升汞有劇毒，可能會對實驗人員產(chǎn)生傷害。因此，處理4滅菌方法較佳，即用單層紗布包裹好的高山羊齒孢子完全浸入2%NaClO中滅菌20 min，然后用無菌水沖洗5次，接著再放入70%酒精中滅菌10 s，再用無菌水沖洗5次，是高山羊齒孢子滅菌的較好方法。

表2 不同滅菌方法對高山羊齒孢子成活率的影響

處理編號接種數(shù)污染數(shù)污染率(%)成活數(shù)成活率(%)13030100002302066．671033．333301653．331446．674301033．332066．675301446．671653．336301136．671963．33空白101010000

表3 正交試驗對高山羊齒孢子萌發(fā)率的影響

試驗編號基本培養(yǎng)基蔗糖濃度(%)6?BA濃度(mg/L)NAA濃度(mg/L)萌發(fā)率(%)1MS00037．35cA2MS10．50．148．33abcA3MS210．242．56abcA4MS320．338．17bcA51/2MS00．50．257．35abcA61/2MS100．360．94aA71/2MS22056．37abcA81/2MS310．163．69aA91/4MS010．357．33abcA101/4MS120．258．61abcA111/4MS200．149．68abcA121/4MS30．5054．12abcA131/8MS020．148．78abcA141/8MS11050．15abcA151/8MS20．50．359．37abA161/8MS300．246．19abcA

2.2 培養(yǎng)基的選擇

L16(44)正交試驗的結果如表3所示，由表3可見，高山羊齒孢子在正交試驗范圍內(nèi)的萌發(fā)率在37.35%～63.69%之間。以處理1(不添加任何激素的MS培養(yǎng)基)萌發(fā)率最低，為37.35%；而以1/2 MS+3%蔗糖+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA為高山羊齒孢子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，萌發(fā)率高達63.69%。且培養(yǎng)基之間無極顯著性差異，處理1與處理6、處理8、處理15間有顯著性差異，處理4與處理6、處理8有顯著性差異。其中基本培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)率的影響最大(見表4)，具有顯著性差異。影響順序為：基本培養(yǎng)基gt;6-BAgt;蔗糖gt;NAA。

不同基本培養(yǎng)基類型對高山羊齒孢子萌發(fā)率的影響見圖1。由圖1可知，隨著無機鹽濃度的逐漸降低，高山羊齒孢子的萌發(fā)率呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。當基本培養(yǎng)基類型為1/2 MS時，萌發(fā)率最高，為59.59%。當基本培養(yǎng)基類型為MS時，萌發(fā)率最低，為41.60%。當基本培養(yǎng)基類型為1/4 MS和1/8 MS時，孢子萌發(fā)率分別為54.94%、51.12%，這二者間差異不顯著。可見，1/2 MS較適合高山羊齒孢子萌發(fā)。

表4 正交設計方差分析(完全隨機模型)

變異來源平方和自由度均方F值顯著水平x(1)699．68333233．22789．931410．04566?x(2)46．00532315．335110．653010．63265x(3)95．93182331．977271．361670．40289x(4)43．97642314．658810．624210．64597誤差70．45157323．48386總和956．0484

圖1 不同培養(yǎng)基類型對高山羊齒孢子萌發(fā)率的影響

不同蔗糖濃度對高山羊齒孢子萌發(fā)率的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著蔗糖濃度的不斷提高，高山羊齒孢子的萌發(fā)率也呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。當蔗糖濃度為1%時，萌發(fā)率最高，為54.51%；蔗糖濃度為2%其次，萌發(fā)率為52.00%；不添加蔗糖和添加3%蔗糖的萌發(fā)率為50.20%、50.54%?？梢姡煌崽菨舛葘Ω呱窖螨X孢子萌發(fā)率的影響不大。

圖2 不同蔗糖濃度對高山羊齒孢子萌發(fā)率的影響

不同激素對高山羊齒孢子萌發(fā)率的影響見圖3，當6-BA濃度為0.5 mg/L時萌發(fā)率最佳，為54.79%，不添加6-BA的萌發(fā)率最低，為48.54%。而隨著6-BA濃度的增加，萌發(fā)率呈緩慢下降的趨勢，萌發(fā)率分別為53.43%、50.48%。最高萌發(fā)率和最低萌發(fā)率之間相差6.25%，差距較大，可見，是否添加激素6-BA對高山羊齒孢子的萌發(fā)影響較大。

圖3 不同6-BA濃度對高山羊齒孢子萌發(fā)率的影響

圖4 不同NAA濃度對高山羊齒孢子萌發(fā)率的影響

而激素NAA的添加并沒有使高山羊齒孢子的萌發(fā)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，但沒有添加NAA時的萌發(fā)率最低，為49.50%?？梢?，NAA的添加對高山羊齒孢子的萌發(fā)具有一定的促進作用，但最佳的NAA濃度及與6-BA較好的配比濃度還有待進一步研究。

3 小 結

幾種不同滅菌方法的比較結果表明，2%NaClO和70%酒精組合滅菌效果好，成活率較高。這與里白孢子的滅菌結果相同。以1/2 MS+3%蔗糖+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA為高山羊齒孢子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，萌發(fā)率達63.69%。研究結果表明，隨著無機鹽濃度的降低，高山羊齒孢子的萌發(fā)率呈先升后降的趨勢，當基本培養(yǎng)基為1/2 MS時，萌發(fā)率最高(為59.59%)。當基本培養(yǎng)基為MS時，萌發(fā)率最低(為41.60%)。徐艷[13]、程治英等[16]的研究表明，低濃度的無機鹽濃度更有利于蕨類植物孢子的萌發(fā)。郭慶勛等[10]對猴腿蹄蓋蕨的研究表明，1/2 MS的孢子萌發(fā)速度高于MS的孢子萌發(fā)速度。Khoo和Thomas的研究表明，培養(yǎng)基中含有較高濃度的無機鹽濃度會延緩Adiantum raddianum孢子的萌發(fā)[17]。Higuchi H等[18]的研究表明，MS培養(yǎng)基是鳥巢蕨良好的培養(yǎng)基類型。蕨菜孢子的前期萌發(fā)也以MS培養(yǎng)基效果較好[19]。何義發(fā)[9]、魯雪華[20]等的研究表明，有些蕨類植物孢子在MS培養(yǎng)基也能較好萌發(fā)。而蜈蚣草孢子在MS、1/2 MS、1/5 MS、1/10 MS上均能萌發(fā)良好[21]。腎蕨、紅蓋鱗毛蕨、假鞭葉鐵線蕨、薄葉碎米蕨這4種蕨類植物在1/2 MS、MS上均能萌發(fā)[22]。可見，不同蕨類植物的最適基本培養(yǎng)基也有所不同，但大多采用的基本培養(yǎng)基為MS，在此基礎上調(diào)整無機鹽的濃度，最常采用的是1/2 MS培養(yǎng)基。

添加1%蔗糖濃度時，高山羊齒孢子萌發(fā)率較添加其它蔗糖濃度高，隨著蔗糖濃度的增加，孢子萌發(fā)率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。徐艷等[6]、Savita G等[23]的研究都表明，低于2%的蔗糖濃度較適于白玉鳳尾蕨孢子的萌發(fā)。而紫萁孢子在蔗糖濃度為2%～3%時，萌發(fā)率較高，低于或高于該濃度都會抑制孢子的萌發(fā)[24]。徐艷等[6]的研究表明，在培養(yǎng)基中不添加或者添加低濃度(低于2%)的蔗糖有利于孢子的萌發(fā)，過高的糖濃度(高于3%)也會抑制孢子的萌發(fā)。鮑敏等[25]發(fā)現(xiàn)，在無機培養(yǎng)基中添加蔗糖比沒有添加蔗糖的孢子萌發(fā)率得到了大幅度提升?？梢?，在孢子萌發(fā)過程中，添加一定濃度的蔗糖具有一定的促進作用，但蔗糖濃度太高反而會抑制孢子萌發(fā)。

添加激素對高山羊齒孢子的萌發(fā)有一定的影響，其中6-BA相較NAA而言，影響較大。郭慶勛等[10]的研究表明，2,4-D、6-BA、KT、NAA這4種激素中KT對猴腿蹄蓋蕨孢子萌發(fā)的效果最好，6-BA和NAA次之。在孢子萌發(fā)時加入激素，大多都有一定的促進作用，至于各激素的影響程度則因物種而異。

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Tissue Culture of Spores ofDavalliamariesiiMoore ex Bak

HEXuejiao1,YUZhicheng1,ZHENGShaoyuan2,LINJinshui1,LINZhiming1
(1.Fujian Institute of Tropical Crop Sciences,Zhangzhou Fujian 363001,China;2.Putian City in Fujian Province According to Economic Development Zone of Housing andUrban-rural Construction Bureau Garden, Putian Fujian 351152,China)

[Purpose]Discussing the influence of the survival rate and germination rate of spores ofDavalliamariesiiMoore ex Bak in the different sterilization ways.[Methods]Use the six different sterilization ways which are NaClO,NaClO add alcohol,mercuric chloride,mercuric chloride add alcohol,mercuric chloride add NaClO,alcohol to reseach the influence of the survival rate of spores ofDavalliamariesiiMoore ex Bak;Consider the four factors which are the minimum medium,sucrose,NAA,6-BA to make the L16(44) orthogonal design,study the influence of the germination rate of spores ofDavalliamariesiiMoore ex Bak.[Result] In the six different sterilization ways,the best sterilization effect is NaClO add alcohol and the worst is alcohol.In the orthogonal experiment,the best germination medium of theDavalliamariesiiMoore ex Bak spores is 1/2 MS+3% sucrose+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA,the germination rate is 63.69%,the lowest germination rate medium is MS which is add no hormone.[Conclusion] the effect which is two sterilization mixed use is better to exclusive use;The greatest impact for the germination rate of spores ofDavalliamariesiiMoore ex Bak is minimum medium,the influence order is minimum medium,6-BA,sucrose,NAA.

Davalliamariesiimoore ex bak; the sterilization ways; tissue culture; the of spores;the germination rate of spores

2016-10-22

福建省屬公益類科研院所基本科研專項“控制高山羊齒葉背孢子生長的栽培技術研究”(2012 GY 04)。

何雪嬌(1984—)，女，湖北十堰人；助理研究員，碩士，主要從事植物生物技術的研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.02.016

S 682.35

A

1001-4705(2017)02-0016-05