， ， (.玉溪中煙種子有限責(zé)任公司， 云南 玉溪 65300； .云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 云南 玉溪 65300)

煙草花粉離體萌發(fā)液體培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化

牛永志1，索文龍1，馬文廣2
(1.玉溪中煙種子有限責(zé)任公司， 云南 玉溪 653100； 2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 云南 玉溪 653100)

以云煙97和紅花大金元花粉為試驗材料，研究了液體培養(yǎng)基配方、花粉濃度對花粉離體萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，濃度配比10%～15%蔗糖、25 mg/L硼酸的液體培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中的花粉濃度以2.5 g/L為宜。

花粉； 萌發(fā)； 培養(yǎng)基

煙草是我國的重要經(jīng)濟作物，目前我國煙葉生產(chǎn)上普遍種植雄性不育系和雜交品種，在繁殖雄性不育系和雜交種種子時，通常需要提前采集父本花粉，經(jīng)過一段時間貯藏，待母本開花后，父本純花粉與花粉介質(zhì)按一定比例配制成介質(zhì)花粉進行授粉。為保證種子的產(chǎn)量和質(zhì)量，經(jīng)過貯藏的花粉在使用之前，需要做花粉活力檢測，以檢驗花粉活力?；ǚ刍盍z測方法主要分3類： 1) 染色法，如氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法、碘鉀(I-KI)染色法等； 2) 花粉離體萌發(fā)測定法； 3) 花粉授粉結(jié)實檢測法。目前使用較多的鑒定方法有TTC染色法和花粉離體萌發(fā)測定法。染色法由于能使未成熟和衰老的花粉著色，而這些花粉不一定具有受精能力，致使花粉活性測定值偏高，花粉授粉結(jié)實檢測法是根據(jù)結(jié)實情況判斷花粉活性，結(jié)果比較準(zhǔn)確，但由于授粉到每個柱頭的花粉量較多，無法定量判斷花粉的活力。李宗平等[1]和孫光玲等[2]報道，花粉離體培養(yǎng)萌發(fā)測定花粉活力是較為理想的煙草花粉活力鑒定方法。煙草花粉離體萌發(fā)測定法，普遍采用將花粉播種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后觀察花粉萌發(fā)情況，經(jīng)常會遇到花粉重疊聚集，花粉粒計數(shù)及活力統(tǒng)計困難，在番茄、唐菖蒲、百合等花粉萌發(fā)測定使用液體培養(yǎng)基取得良好的效果[3-5]，而在煙草花粉活力萌發(fā)測定時使用液體培養(yǎng)基的研究尚未見系統(tǒng)的研究報道。本研究通過對液體培養(yǎng)基進行篩選和優(yōu)化，以期找到一種花粉分散性好、準(zhǔn)確可靠、簡便易行的煙草花粉活力檢測方法，從而為煙草雜交制種中花粉采集、貯藏、授粉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為云煙97和紅花大金元花粉，試劑為蔗糖、硼酸、無水氯化鈣。

1.2 方 法

1.2.1 花粉收集

采集含蕾至花始開期的云煙97和紅花大金元花藥，自然晾干至花藥裂開，篩出花粉，自然晾曬至花粉含水量為6.0%，花粉密封置于4 ℃下貯藏備用。

1.2.2 液體培養(yǎng)基組分篩選

以10%的蔗糖作為花粉萌發(fā)基本液體培養(yǎng)基，加入硼酸、氯化鈣配制成不同組分的液體培養(yǎng)基，設(shè)計了11個液體培養(yǎng)基處理(見表1)。

表1 液體培養(yǎng)基組分

處理培養(yǎng)基組分T1水T210%蔗糖T310%蔗糖+25mg/L硼酸T410%蔗糖+50mg/L硼酸T510%蔗糖+100mg/L硼酸T610%蔗糖+25mg/L硼酸+10mg/L氯化鈣T710%蔗糖+50mg/L硼酸+10mg/L氯化鈣T810%蔗糖+100mg/L硼酸+10mg/L氯化鈣T910%蔗糖+25mg/L硼酸+20mg/L氯化鈣T1010%蔗糖+50mg/L硼酸+20mg/L氯化鈣T1110%蔗糖+100mg/L硼酸+20mg/L氯化鈣

稱取2.5 mg純花粉于2.5 mL離心管內(nèi)，分別加入不同組分的液體培養(yǎng)基，混合均勻后，滴入凹形載玻片凹形槽內(nèi)，然后將載玻片置于加2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，然后將培養(yǎng)皿置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)3 h后，將含有花粉的液體培養(yǎng)基混合均勻后于10×物鏡下進行鏡檢，以花粉管長度超過花粉粒直徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每個處理均設(shè)3次重復(fù)(制3個片)，每重復(fù)隨機觀察3個視野，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。花粉萌發(fā)率(%)=萌發(fā)花粉粒數(shù)/觀察的總花粉粒數(shù)×100%。

1.2.3 蔗糖濃度篩選

根據(jù)液體培養(yǎng)基組分篩選結(jié)果設(shè)置蔗糖濃度分別為10%、15%、20%、25%和30%，稱取2.5 mg純花粉于2.5 mL離心管內(nèi)，分別加入不同蔗糖濃度的液體培養(yǎng)基，混合均勻后，滴入凹形載玻片凹形槽內(nèi)，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)3 h后進行鏡檢，10×物鏡下統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。

1.2.4 花粉濃度篩選

分別稱取1，2.5，5，10，20 mg純花粉于2.5 mL離心管內(nèi)，離心管內(nèi)加入1 mL根據(jù)結(jié)果篩選出較為理想的液體培養(yǎng)基，混合均勻后，滴入凹形載玻片凹形槽內(nèi)，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)3 h后進行鏡檢，10×物鏡下統(tǒng)計視野內(nèi)花粉粒數(shù)和花粉萌發(fā)率。

圖1 不同培養(yǎng)基組分對云煙97花粉萌發(fā)率的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基組分對云煙97和紅花大金元花粉萌發(fā)的影響

不同培養(yǎng)基組分對云煙97花粉萌發(fā)率的影響見圖1。由圖1可知，處理T 3花粉萌發(fā)率最高，為46.98%，處理T 7和T 5其次，花粉萌發(fā)率分別為42.10%和41.07%，處理T 9最低，為1.95%。圖2 A～圖2 C分別為花粉在含有10%蔗糖+25 mg/L硼酸(T 3)、10%蔗糖+50 mg/L硼酸+10 mg/L氯化鈣(T 7)和10%蔗糖+100 mg/L硼酸(T 5)的培養(yǎng)基上花粉粒萌發(fā)情況。

不同培養(yǎng)基組分對紅花大金元花粉萌發(fā)率的影響規(guī)律與云煙97相似。由圖3可知，處理T 3花粉萌發(fā)率最高，為61.76%，處理T 7和T 5其次，花粉萌發(fā)率分別為54.43%和54.07%，處理T 9最低，為2.58%。

2.2 不同蔗糖濃度對云煙97和紅花大金元花粉萌發(fā)的影響

根據(jù)液體培養(yǎng)基組分初步篩選結(jié)果表明，云煙97和紅花大金元花粉在含有10%蔗糖+25 mg/L硼酸的液體培養(yǎng)基上花粉萌發(fā)率最高，為進一步優(yōu)化液體培養(yǎng)基，設(shè)置了5個蔗糖濃度，硼酸濃度均為25 mg/L，不同蔗糖濃度液體培養(yǎng)基對云煙97和紅花大金元花粉萌發(fā)的影響見表2。由表2可知，對于云煙97，花粉在含有10%蔗糖+25 mg/L硼酸和15%蔗糖+25 mg/L硼酸的液體培養(yǎng)基上花粉萌發(fā)率最高，分別為41.78%和42.14%，之后隨著蔗糖濃度的升高，花粉萌發(fā)率急劇下降，花粉在含有30%蔗糖+25 mg/L硼酸的液體培養(yǎng)基上萌發(fā)率僅為0.87%；對于紅花大金元，花粉在含有10%蔗糖+25 mg/L硼酸和15%蔗糖+25 mg/L硼酸液體培養(yǎng)基上花粉萌發(fā)率最高，分別為56.54%和57.06%，之后隨著蔗糖濃度的升高，花粉萌發(fā)率急劇下降，花粉在含有30%蔗糖+25 mg/L硼酸的液體培養(yǎng)基上萌發(fā)率僅為1.21%。

圖2 T 3、T 7和T 5處理對云煙97花粉萌發(fā)率的影響

表2 蔗糖濃度對花粉萌發(fā)率的影響

硼酸濃度(mg/L)蔗糖濃度(%)云煙97花粉萌發(fā)率(%)紅花大金元花粉萌發(fā)率(%)1041．7856．541542．1457．06252013．1517．12257．089．76300．871．21

2.3 不同花粉濃度對云煙97和紅花大金元花粉萌發(fā)的影響

花粉萌發(fā)采用含有10%蔗糖+25 mg/L硼酸的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中花粉濃度對花粉萌發(fā)的影響見表3。由表3可知，花粉濃度為1 g/L時，視野內(nèi)花粉數(shù)平均為87個，云煙97和紅花大金元花粉萌發(fā)率分別為24.26%和27.96%；花粉濃度為2.5 g/L時，視野內(nèi)花粉數(shù)平均為203個，云煙97和紅花大金元花粉萌發(fā)率分別為40.39%和54.35%；當(dāng)花粉濃度為5 g/L時，視野內(nèi)花粉粒數(shù)平均為418個，花粉管出現(xiàn)纏繞重疊，難以統(tǒng)計花粉萌發(fā)率；當(dāng)花粉濃度為10 g/L和20 g/L時，視野內(nèi)花粉粒和花粉管出現(xiàn)重疊，難以統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。圖4為液體培養(yǎng)基中不同花粉濃度下視野內(nèi)紅花大金元花粉粒數(shù)和花粉萌發(fā)情況，從圖4 C～圖4 E可以看出，當(dāng)花粉濃度≥5 g/L，視野內(nèi)花粉粒會疊加，花粉管纏繞重疊，花粉粒數(shù)和花粉萌發(fā)率難以統(tǒng)計。

圖3 不同培養(yǎng)基組分對紅花大金元花粉萌發(fā)率的影響

表3 花粉濃度對花粉萌發(fā)的影響

花粉濃度(g/L)視野內(nèi)花粉數(shù)云煙97花粉萌發(fā)率(%)紅花大金元花粉萌發(fā)率(%)18724．2627．962．520340．3954．355418——10———20———

注：“—”表示無法統(tǒng)計。

3 結(jié)論與討論

1) 對于云煙97和紅花大金元，花粉在含有10%～15%蔗糖+25 mg/L硼酸的液體培養(yǎng)基上花粉萌發(fā)率高，適宜作為云煙97和紅花大金元花粉活力檢測的培養(yǎng)基。

2) 對于云煙97和紅花大金元，使用液體培養(yǎng)基檢測花粉活力，培養(yǎng)基中的花粉濃度以2.5 g/L為宜。

培養(yǎng)基組分、pH值和培養(yǎng)條件影響花粉離體萌發(fā)[6-8]。培養(yǎng)基組分中的蔗糖、硼酸、外源鈣、植物生長調(diào)節(jié)劑等在適宜濃度范圍內(nèi)能促進花粉的萌發(fā)和花粉管的生長，過高抑制花粉萌發(fā)和花粉管生長。本研究結(jié)果表明，對于云煙97和紅花大金元，花粉離體萌發(fā)適宜的液體培養(yǎng)基組分為10%～15%蔗糖+25 mg/L硼酸，蔗糖和硼酸濃度過高，花粉萌發(fā)率下降；同時本研究發(fā)現(xiàn)，如外源Ca2+不是云煙97和紅花大金元花粉離體萌發(fā)所必需的，可能與細胞內(nèi)游離Ca2+的含量有關(guān)。有研究結(jié)果表明，花粉萌發(fā)和花粉管生長對培養(yǎng)基中糖類的濃度具有嚴(yán)格的要求，當(dāng)外界糖濃度低于花粉內(nèi)部的滲透壓時，花粉壁破裂，內(nèi)容物析出，導(dǎo)致花粉失去生活力，而蔗糖濃度高時，又會造成花粉的質(zhì)壁分離而抑制萌發(fā)[9-10]，與本研究結(jié)果基本一致，但本研究未對花粉壁破裂和花粉的質(zhì)壁分離現(xiàn)象進行觀察。

圖4 不同花粉濃度下紅花大金元花粉萌發(fā)情況

本研究只對2個烤煙品種花粉離體萌發(fā)液體培養(yǎng)基中的蔗糖、硼酸、外源Ca2+及花粉濃度進行了初步的篩選和優(yōu)化，有待對烤煙其它品種、白肋煙、香料煙等花粉離體萌發(fā)液體培養(yǎng)基、培養(yǎng)基pH值和培養(yǎng)條件進行篩選和優(yōu)化，同時對影響花粉萌發(fā)和花粉管生長的因素進行系統(tǒng)深入的研究，從而建立一套成熟的、系統(tǒng)的煙草花粉離體活力檢測技術(shù)體系。

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Screening and Optimization of Liquid Culture Medium for Pollen Germination in Vitro

NIUYongzhi1,SUOWenlong1,MAWenguang2

2016-12-25

中國煙草總公司(110201302006)；云南省煙草公司 (2013 YN 10) 資助項目。

牛永志(1980—)，男，河南周口人；碩士，主要從事煙草種子科學(xué)方面研究；E-mail：niuyonzhi@qq.com。

馬文廣(1972—)，男，云南玉溪人；研究員，主要從事煙草品種選育及種子科學(xué)方面研究；E-mail：mwg@tobacco-seed.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.05.078

S 527

A

1001-4705(2017)05-0078-04