， ， ， ， (西南科技大學生命科學與工程學院， 四川 綿陽 621010)

·研究報告·

秋水仙素對北柴胡生長的影響

劉宏偉，唐志康，余馬，舒曉燕，侯大斌
(西南科技大學生命科學與工程學院， 四川 綿陽 621010)

[目的]以北柴胡新品種川北柴1號為材料，研究秋水仙素處理對柴胡生長的影響。[方法]對北柴胡審定品種川北柴1號采用生長點滴定和浸泡2種處理方法，0.1%～0.5% 5個處理濃度，3～5 h 3個處理時間、1葉期及5葉期2個處理時期進行誘導。[結果]生長點滴定法對柴胡幼苗生長影響不顯著。浸泡法中秋水仙素濃度、浸泡時間、處理濃度和浸泡時間協(xié)同作用對北柴胡存活率、植株變異率及葉綠素含量有顯著影響。此外，赤霉素添加對北柴胡誘導效果及生長發(fā)育也有顯著影響。[結論]本研究對創(chuàng)制柴胡新材料具有重要意義。

北柴胡； 川北柴1號； 秋水仙素； 方差分析

北柴胡(BupleurumchineseDC.)為傘形科(Umbellifetae)多年生草本植物，其根為常用大宗藥材之一。藥理研究表明，柴胡具有解熱、抗病毒、降血脂、保肝、抗炎、抗腫瘤等功效[1-2]。目前柴胡的使用量在所有中藥中位列前3名，年用量逾1萬t，且隨柴胡為主要原料的藥品不斷開發(fā)上市而快速遞增。但由于近年來野生柴胡資源逐漸枯竭和產地生態(tài)環(huán)境持續(xù)惡化，采挖量逐年減少，加之出口量也不斷增加，而國內又沒有較大規(guī)模且持續(xù)量產的柴胡規(guī)范化種植基地，導致柴胡的供應日趨緊張。

柴胡主要藥用部位(主根)較小，單株產量低(≤1 g)[3]，嚴重制約了柴胡產業(yè)化發(fā)展效率。多倍體育種具有增大植物營養(yǎng)器官的特點，在保留原有藥用成分的基礎上獲取較正常植株大的營養(yǎng)器官，從而獲取新的種質資源[4-5]。通過秋水仙素誘導桔梗[6]、黃芩[7]、金銀花[8]、刺果甘草[9]等藥用植物上成功獲得多倍體植株。本試驗采用秋水仙素誘導柴胡獲得藥用植物新材料，探討秋水仙素誘導對柴胡生長的影響，為加速柴胡產業(yè)化進程提供新的資源。

圖1 秋水仙素處理單株DHcbc 11與空白組長勢對照

1 材料與方法

1.1 材 料

供試柴胡為北柴胡審定品種川北柴1號。該品種由西南科技大學、四川德培源中藥科技開發(fā)有限公司及中國藥科院藥用植物研究所等多家單位共同選育。

1.2 方 法

本研究均在幼苗長出第1片真葉時移栽培育，待所有幼苗成活后選取相同生長時期進行分組處理。所有實驗在環(huán)境可控的加代溫室內(25 ℃)進行，設3次重復。

表1 浸泡法實驗處理條件

A秋水仙素濃度(%)B處理時長(h)C赤霉素10．1131020．2242GA330．33540．450．5

1.2.1 生長點滴定法誘導北柴胡幼苗

當供試材料生長時期處于1葉期、5葉期時，分別用蘸有0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%秋水仙素的棉球，放置于柴胡的生長點處，并且每6 h補充滴加，以保持藥液濃度，處理24 h，每盆5棵，每個處理15株，處理后將棉球移除，并充分洗凈植株上殘存藥液，待進一步生長后，進行觀察和鑒定。

1.2.2 浸泡法誘導北柴胡幼苗

以30棵正常植株為空白對照，當供試材料生長時期處于1葉期時，用水將根部的土洗去，設置包括秋水仙素濃度、浸泡時間及是否添加赤霉素的30個處理的完全隨機組合實驗(表1)。將處理后的柴胡幼苗用小水流浸泡沖洗，每12 h后換1次水，至24 h后倒掉水。將柴胡幼苗移栽至1加侖育苗盆中，每盆4棵，每個處理12株，待對照植株進入拔節(jié)期時進行觀察和鑒定。

1.2.3 存活率的測定

對用秋水仙素處理后的幼苗生長情況進行定期觀察，直至不再死亡。

存活率(%)=存活株數/處理株數×100%。

1.2.4 植株突變率的統(tǒng)計

以處理后植株生長緩慢、葉色濃綠、葉片變大變寬作為形態(tài)變異指標，統(tǒng)計變異率。

變異率(%)=變異株數/處理株數×100%。

1.2.5 植株葉綠素含量(SPAD)的測定

使用SPAD-502葉綠素儀，選取每株植株倒5葉，在距葉尖1/3處測量SPAD值，測量5次，取平均值。以該植株倒5葉距葉尖1/3處測定值的平均值作為該植株葉片葉綠素含量。

1.3 數據統(tǒng)計

統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件(Ver.16.0 developed by IBM，USA.)進行計算。

2 結果與分析

2.1 生長點滴定法對柴胡幼苗誘導的效果

采用生長點滴定法誘導的川北柴1號幼苗，1葉期和5葉期的植株存活率達到了100%。植株變異率為60%，但與對照相比，發(fā)生變異的部位僅限于接觸棉球的葉片，后期生長出的葉片未有變異的性狀，因此該方法對柴胡后期生長不會造成顯著影響。

2.2 浸泡法誘導對柴胡幼苗存活率、變異率和葉綠素含量的影響

與對照植株相比，采用浸泡法處理柴胡幼苗后，部分柴胡植株在幼苗期及成株期生長產生顯著差異，如植株矮化、葉片變厚、葉綠素含量增加等(圖1，圖2)。

2.2.1 不同處理條件對植株的存活率、變異率和葉綠素含量的影響

不同處理條件對植株的存活率、變異率和葉綠素含量的影響不同(表2)。從表2可看出，隨著處理濃度(A)的升高，植株存活率呈逐步降低趨勢，變異率先升高后降低。隨著處理時間(B)的延長，植株存活率降低，變異率提高。隨著處理濃度(A)的升高和處理時間(B)的延長，植株葉綠素含量呈逐步升高趨勢。

表2 不同處理條件下的植株存活率、變異率和葉綠素含量

實驗序號ABC處理株數存活率(%)變異率(%)葉綠素含量實驗序號ABC處理株數存活率(%)變異率(%)葉綠素含量ck———30100019．99161121291．67036．2111111291．672529．96172121258．335039．5122111291．675033．31183121266．672545．6833111283．335035．8519412122516．6738．8344111233．3316．6752．8220512128．338．3347．7855111233．3333．3355．58211221283．3341．6736．3161211291．6766．6736．972222212502535．5172211266．675040．17233221233．332544．3283211284．335041．46244221233．3333．3347．2794211267．672551．542552212252552．59105211233．332551．4626132127541．6741．411131127533．3337．26272321258．3333．3338．63122311267．675036．07283321258．332538．58133311258．3333．3337．97294321216．678．3367．1414431127566．6753．69305321233．3333．3349．39155311258．3341．6752．59

注：A(處理濃度)中，1、2、3、4、5分別代表0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%；B(處理時間)中，1、2、3分別代表3 h、4 h、5 h；C(添加赤霉素)中，1代表未添加赤霉素，2代表添加赤霉素。

注：DHcbc 1502為處理組植株，株高46 cm，ck為對照組植株，株高103 cm。圖2 秋水仙素處理柴胡與空白組株高對照

對秋水仙素濃度、處理時間的兩因素進行方差分析(表3)，可以看出，處理濃度對柴胡幼苗存活率影響極顯著(plt;0.01)，處理時間及其兩者交互作用對柴胡幼苗存活率影響不顯著(pgt;0.05)；處理濃度、處理時間對柴胡幼苗變異率影響不顯著(pgt;0.05)，但其交互作用對柴胡幼苗變異率影響顯著(plt;0.05)；處理濃度對柴胡幼苗葉綠素含量影響極顯著(plt;0.01)，處理時間及處理濃度和處理時間的交互作用對柴胡幼苗葉綠素含量影響不顯著(pgt;0.05)。

從誘變效果看，0.1%～0.5%的秋水仙素對柴胡的誘導均有效果，植株的存活率和變異率受秋水仙素濃度和處理時間2個因素影響，其中A1B2C1和A4B3C1(0.1%的秋水仙素處理4 h和0.4%的秋水仙素處理5 h)組合變異率最高，為66.67%。綜合考慮植株存活率、變異率、實驗成本以及時間等因素，采用0.1%處理4 h的組合進行柴胡多倍體誘導效果最佳。

2.2.2添加赤霉素后不同處理條件對植株的存活率、變異率和葉綠素含量的影響

添加赤霉素后，不同處理條件對植株的存活率、變異率和葉綠素含量的影響不同(表2)。從表2可看出，隨著處理濃度(A)的升高，植株存活率呈逐步降低趨勢，變異率先升高后降低。隨著處理時間(B)的延長，植株存活率先降低后升高，變異率先升高后降低。隨著處理濃度(A)的升高和處理時間(B)的延長，植株葉綠素含量皆呈逐步升高趨勢。

注：DHcbc 1601為處理組植株，ck為對照組植株。圖3 秋水仙素處理柴胡與空白組倒七葉葉片形態(tài)對照

對添加赤霉素后秋水仙素濃度、處理時間的兩因素進行方差分析(表4)，可以看出，處理濃度對柴胡幼苗存活率影響極顯著(plt;0.01)，處理時間及其兩者交互作用對柴胡幼苗存活率影響不顯著(pgt;0.05)；秋水仙素濃度、處理時間及其交互作用對柴胡幼苗變異率影響皆不顯著(pgt;0.05)；處理濃度對柴胡幼苗葉綠素含量影響極顯著(plt;0.01)處理時間對柴胡幼苗葉綠素含量影響不顯著(pgt;0.05)，其兩者的交互作用對柴胡幼苗葉綠素含量影響顯著(plt;0.05)。

表3 不同處理濃度和時間對柴胡幼苗的兩因素方差分析

偏差來源標準差存活率變異率葉綠素含量濃度52．1719．9039．84處理時間3．7320．758．39濃度×處理時間29．9930．287．04誤差18．6320．096．04總和74．7445．3641．02

注：加粗字體表示該因素差異顯著(plt;0.05)。下同。

以植株存活率與變異率為指標，添加赤霉素后秋水仙素溶液的最佳誘導濃度和時間為0.2%和3 h。在最優(yōu)誘導條件下，較未添加赤霉素的處理，存活率由91.67%降為58.33%，減少36.37%；變異率由66.67%降為50%，減少25%。結果表明，添加赤霉素未對秋水仙素誘導結果起促進作用。

表4 添加赤霉素后不同處理濃度和時間對柴胡幼苗的兩因素方差分析

偏差來源標準差存活率變異率葉綠素含量濃度75．3219．1819．90處理時間9．8620．7511．18濃度×處理時間21．0826．2911．33誤差29．0921．357．46總和62．2933．2740．39

以植株葉綠素含量為指標，未添加赤霉素的最優(yōu)處理組合為A5B1C1(條件為秋水仙素濃度0.5%，處理3 h)；添加赤霉素的最佳組合為A4B3C2(條件為秋水仙素濃度0.4%，處理5 h)。同在最適誘導條件下處理，植株葉片葉綠素含量較未添加赤霉素處理的含量增加20.80%。結果表明，添加赤霉素的秋水仙素溶液有助于提高柴胡葉片的葉綠素含量。

3 討論與結論

秋水仙堿的濃度和處理時間是影響染色體加倍的最重要的外在條件。用秋水仙堿處理時，植物種類不同，其濃度和處理時間的最佳組合不同[10]。由于秋水仙素對外植體有毒害作用，若處理不當，會造成材料在處理過程中死亡，影響成苗率，但不同作物、品種或器官對秋水仙素的敏感性不同[11]。研究表明，石斛蘭[12]、非洲菊[13]均隨秋水仙素處理濃度的增加或時間的延長，而受害程度加重，成活率降低。Martin B等的研究發(fā)現，赤霉素加入秋水仙素溶液可使玉米花藥誘導產生二倍體的比率由20%提升至52%[14]。本研究結果顯示，秋水仙素處理的幼苗的存活率的影響顯著不同，存活率隨秋水仙素處理濃度升高及時間延長而顯著降低。而赤霉素加入秋水仙素溶液對浸泡法誘導柴胡有一定的抑制作用。因此，柴胡多倍化材料創(chuàng)制過程中不宜添加赤霉素。

秋水仙素處理濃度和時間不僅影響存活率，也是誘導植物產生多倍體的關鍵。番茄幼苗莖尖在含8 mmol/L秋水仙素的液體培養(yǎng)基中處理96 h，其四倍體誘導率達11.11%[15]。本研究結果表明，不同秋水仙素處理時間和濃度對幼苗變異率影響顯著不同，變異率隨處理時間延長不斷上升，隨處理濃度升高先上升后降低。

葉綠素是植物進行光合作用的重要物質，其含量的多少對光合速率有直接影響，是反映植物葉片光合能力的一個重要指標，以說明某種措施或環(huán)境條件對植物產生的影響[16]。另有研究表明，葉片葉綠素含量增加，PBP羧化酶活性增強，凈光合速率提高，這不僅可以增大苗期地上部生長所需的有機營養(yǎng)，而且也可保證根系生長所需要的營養(yǎng)物質，因而苗期植株得以健壯生長，促進壯苗[17]。本研究結果表明，秋水仙素濃度的升高以及處理時間的延長，柴胡植株葉綠素含量皆呈逐步升高趨勢，添加赤霉素有利于植物葉片葉綠素含量的增加。

植物體細胞染色體加倍后，分化生成的多倍體植株，通常表現出巨大性，如莖變粗短、葉片變厚，有時比較粗糙或生皺紋、多毛，花朵、果實和種子變大，生育期延長，整個植株變成巨型，這些特征都可作為判別多倍體的根據[18]。柴胡的變異主要表現為莖稈變粗，節(jié)間距、株高變短(圖1，圖2)，葉片的形狀改變(卷曲、變寬、變厚，圖3)，這在正常的植株中是沒有的。本研究結果表明，不同秋水仙素處理時間和濃度對葉片葉綠素含量影響顯著，葉綠素含量均隨秋水仙素處理濃度升高及時間延長而顯著增加。

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The Influence of Colchicine on Growth ofBupleurumchinenseDC

LIUHongwei，TANGZhikang，YUMa，SHUXiaoyan，HOUDabin
(School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang Sichuan 621010,China)

[Objective]Identify the influence of colchicine on growth ofBupleurumchinenseDC by used of new commercial variety of Chuanbeichai No.1.[Method] the seedlings of Chuanbeichai No.1 were induced by treating the shoot tip meristem and soaking method (whole plant with colchicine).In addition,the effects of colchicine concentrations (0.1%-0.5%),treatment times(3-5 hour),and treatment period (one leaf and five leaf period stages) were also studied.[Results]The effect of colchicine treating on shoot tip meristem was insignificant toB.chinenseDC.The colchicine concentrations,treatment times and their interactions showed significant effects on survival rate,mutational rate, and chlorophyll content ofB.chinenseDC with soaking method.In addition,it also showed significant effects on the mutagenic effect and growth and development ofB.chinenseDC while adding gibberellin in colchicine.[Conclusion]The colchicine induction procedure is very important to creation of mutation inB.chinenseDC.

BupleurumchinenseDC; Chuanbeichai No.1; colchicine; ANOVA

2017-02-17

國家自然科學基金(81603223)；四川省“十三五”科技育種攻關項目(2016 NYZ 0036-4-2)。

劉宏偉(1988—)，男，學士，在讀碩士研究生，研究方向：藥用植物育種；E-mail：eric531959109@126.com。

侯大斌，男，博士，教授，研究方向：天然產物；E-mail:dbhou@126.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.05.001

S 567

A

1001-4705(2017)05-0001-05