， ， ， 坤華， 林軒，

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園a.廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.藥用植物保育實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530023)

·應(yīng)用技術(shù)·

藥用植物大戟組培快繁體系優(yōu)化研究

李翠，韋瑩，繆劍華，韋坤華，李林軒，張占江

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園a.廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.藥用植物保育實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530023)

[目的]采用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)解決大戟種苗短缺和種質(zhì)資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用問(wèn)題，為人工種植提供技術(shù)支持。[方法]對(duì)消毒劑和消毒時(shí)間進(jìn)行篩選，以大戟帶側(cè)芽莖段為外植體，以MS、B 5、N 6為基本培養(yǎng)基，采用正交試驗(yàn)比較植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 (6-BA、2,4-D、KT、NAA、IAA、IBA 、AC)對(duì)大戟愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化、繁殖系數(shù)和誘導(dǎo)生根的影響。[結(jié)果]外植體經(jīng)15 d誘導(dǎo)培養(yǎng)，形成愈傷組織，其誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為B 5+2,4-D 1.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到80%；不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ IAA 0.6 mg/L；最利于增殖的培養(yǎng)基為MS+KT 0.5+ 6-BA 1.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L，增殖倍數(shù)6～10；最佳的生根培養(yǎng)基為MS+IBA 2.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L，生根率93.1%。[結(jié)論]此途徑繁殖速度快、再生率高，有望為栽培大戟提供大量種苗，為大戟深入開(kāi)發(fā)利用研究提供依據(jù)。

藥用植物； 大戟； 組培快繁； 生根率

大戟屬(EuphorbiaLinn．)是大戟科(Euphorbiaceae)中最大的屬，《中國(guó)植物志》及《Flora of China)記載其約2 000 種，幾乎遍布全球，是特大屬之一，中國(guó)約有77種，大戟科植物大戟(EuphorbiapekinensisRupr.)，為多年生常綠草本，根圓柱狀，長(zhǎng)20～30 cm，花期5—8月，果期6—9月，廣布于全國(guó)(除臺(tái)灣、云南、西藏和新疆)，北方尤為普遍；生于山坡、灌叢、路旁、荒地、草叢、林緣和疏林內(nèi)，根入藥，具有較高的藥用價(jià)值(約100元/kg)，具有逐水通便，消腫散結(jié)，主治水腫，并有通經(jīng)之效，用于治療慢性腎炎，晚期血吸蟲(chóng)病腹水或其他肝硬變腹水等癥。大戟對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，近年來(lái)，大戟資源遭到了嚴(yán)重破壞，隨著市場(chǎng)需求量的不斷增加，野生大戟資源瀕臨枯竭，價(jià)格從幾元一公斤到現(xiàn)在的上百元一公斤，且常常有價(jià)無(wú)市，由于種子細(xì)小，生產(chǎn)上難以實(shí)現(xiàn)大面積栽培。采用生物技術(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)，可以有效快速地提高大戟種苗的繁殖速度和質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)大戟優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化育苗，以滿足生產(chǎn)上的需要。本研究通過(guò)誘導(dǎo)愈傷組織獲得叢生芽，得到的種苗健壯、成活率高，可在短期內(nèi)提供大量大戟的優(yōu)質(zhì)種苗，有效解決了大戟的規(guī)模化育苗問(wèn)題。>

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)大戟愈傷組織誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)編號(hào)培養(yǎng)基接種外植體數(shù)(個(gè))產(chǎn)生愈傷組織數(shù)(個(gè))愈傷組織誘導(dǎo)率(%)1MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.5mg/L4022552MS+2,4-D1.5mg/L+6-BA0.5mg/L4032803B5+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.5mg/L4025624B5+2,4-D1.5mg/L+6-BA0.5mg/L4029725N6+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.5mg/L4024606N6+2,4-D1.5mg/L+6-BA0.5mg/L402768

1 實(shí)驗(yàn)材料

2015年5月采集自廣西藥用植物園引種繁育圃，經(jīng)呂惠珍副主任技師鑒定該品種為京大戟，經(jīng)篩選后選擇無(wú)病蟲(chóng)害的優(yōu)良大戟植株為實(shí)驗(yàn)材料，選取其帶側(cè)芽莖段作為外植體。

2 外植體處理及培養(yǎng)條件

2.1 外植體處理

將帶側(cè)芽莖段表面洗凈去污，于超凈工作臺(tái)內(nèi)采用濃度為75%的酒精滅菌30～45 s，無(wú)菌水沖洗1～3次，放入0.1% HgCl2滅菌劑滅菌，并充分震蕩，再用無(wú)菌水沖洗2～5次，用無(wú)菌濾紙將莖段表層的水分吸干，剪去與滅菌劑接觸部分，然后按自然順序接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

2.2 培養(yǎng)條件

各個(gè)培養(yǎng)階段附加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，蔗糖 3%，瓊脂0．6%，pH值5.8～6，培養(yǎng)室平均光照強(qiáng)度2 000 lx左右，光照時(shí)間12 h/d，溫度(24±2)℃。

3 試 驗(yàn)

3.1 大戟愈傷組織的分化

基于MS、B 5、N 6培養(yǎng)基，添加不同濃度的2,4-D(0.5，1.0，1.5 mg/L)、6-BA(1.0，1.5，2.0 mg/L)，進(jìn)行大戟愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，每組接種10瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率等結(jié)果。

3.2叢生芽再生誘導(dǎo)

基于MS、B 5、N 6培養(yǎng)基，添加NAA、IAA、6-BA 3種不同類(lèi)型激素，并開(kāi)展正交設(shè)計(jì)NAA(0.5，1.0，1.5 mg/L)、KT (0.1，0.2，0.4 mg/L)、6-BA(1.0，1.5，2.0 mg/L)進(jìn)行大戟不定芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理10瓶，每瓶4塊愈傷組織，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽誘導(dǎo)率等結(jié)果。

3.3 叢生芽繁殖培養(yǎng)

在MS為基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上以6-BA、IAA為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素考察大戟叢生芽繁殖情況。6-BA(0.5，1.0，1.5 mg/L)、IAA (0.2，0.4，0.6 mg/L)2種激素設(shè)計(jì)6組試驗(yàn)對(duì)大戟叢生芽繁殖效果比較研究，每個(gè)處理10瓶，每瓶3個(gè)單芽，30 d統(tǒng)計(jì)叢生芽增殖結(jié)果。

芽增殖倍數(shù)=(20 d后芽數(shù)-接種時(shí)芽數(shù))/接種時(shí)芽數(shù)。

3.4 生根培養(yǎng)

為了尋找大戟無(wú)菌苗生根壯苗的最適合培養(yǎng)基，設(shè)置以下不同處理(表3)，以MS為基本培養(yǎng)基，IBA(1.0，2.0 mg/L)、AC(0.5，1.0，1.5 mg/L)2種添加物進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)大戟的繁殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，將生長(zhǎng)健壯，高2～3 cm的無(wú)根苗接種于4種不同處理的生根培養(yǎng)基上，每組試驗(yàn)接種10瓶，每瓶6個(gè)單芽，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)平均值和生根率等結(jié)果。

4 結(jié)果與分析

4.1 愈傷組織誘導(dǎo)情況

基于MS、B 5、N 6培養(yǎng)基，添加2,4-D(0.5，1.0，1.5 mg/L)、6-BA(1.0，1.5，2.0 mg/L)，進(jìn)行大戟不定芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，每組接種10瓶，每瓶接種4個(gè)外植體，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率等結(jié)果(圖1)。

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；

生根率(%)=產(chǎn)生不定根的叢苗數(shù)/接種叢苗總數(shù)×100%；

生根數(shù)平均值=總生根數(shù)/接種總數(shù)。

圖1 大戟愈傷組織

4.2 叢生芽再生誘導(dǎo)

將得到的試管苗叢生芽置于愈傷組織分化出芽培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)基，添加IAA、6-BA 2種不同類(lèi)型激素，并添加IAA(0.2，0.4，0.6 mg/L)、6-BA(0.5，1.0，1.5 mg/L)進(jìn)行對(duì)大戟不定芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，每組試驗(yàn)接種10瓶，每瓶4塊愈傷組織，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽誘導(dǎo)率等結(jié)果(圖2)。

圖2 愈傷組織誘導(dǎo)出芽

20～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L的瓊脂，培養(yǎng)基pH=5.8，觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L的6-BA和0.6 mg/L的IAA壯苗效果最好，株高達(dá)5.37 cm。

4.3 叢生芽繁殖培養(yǎng)

將外植體接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23～26 ℃，光照強(qiáng)度1 400～2 000 lx，光照時(shí)間為10～12 h/d的條件下培養(yǎng)30 d，側(cè)芽分化后獲得叢生芽，其中MS培養(yǎng)基中含0.1～0.4 mg/L的KT、1.0～2.0 mg/L的6-BA、1.0～2.0 mg/L的NAA、20～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中6-BA和NAA濃度增加，大戟叢生芽數(shù)均增加；在培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L的KT、2.0 mg/L的6-BA和1.5 mg/L的NAA，叢生芽效果最好(圖3)。

4.4 生根培養(yǎng)

將健壯植株置于MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23～26 ℃，光照強(qiáng)度1 400～2 000 lx，光照時(shí)間為10～12 h/d的條件下，培養(yǎng)40 d得到帶根的完整植株，其中MS生根培養(yǎng)基中含0.5～1.5 mg/L的IAA、1.0～2.0 mg/L的IBA、25～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中IAA濃度增加，組培苗的生根率也增加；培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L的IBA和1.0 mg/L的IAA生根效果最好，生根率達(dá)93.1%，平均根長(zhǎng)達(dá)到4.49 cm；

圖3 大戟叢生芽繁殖

圖4 大戟組培苗

表2 不同激素水平對(duì)大戟叢生芽壯苗效果的影響

試驗(yàn)編號(hào)6-BA(mg/L)IAA(mg/L)株高(cm)長(zhǎng)勢(shì)10.50.23.47生長(zhǎng)慢,弱黃綠色20.50.44.51生長(zhǎng)較慢,黃綠色30.50.64.88生長(zhǎng)較快,綠色41.00.24.27生長(zhǎng)較快,綠色51.00.44.92生長(zhǎng)快,翠綠色61.00.65.37生長(zhǎng)快,翠綠色71.50.24.68生長(zhǎng)較快,綠色81.50.44.90生長(zhǎng)較快,綠色91.50.65.13生長(zhǎng)較快,綠色

5 討 論

大戟屬植物(EuphorbiaL.)為大戟科植物中最大的屬。大部分為一年或多年生草本植物，全球有2 000余種，廣泛分布于世界各地，尤以非洲和南美洲最多，大戟屬植物在中國(guó)有80余種。作為一種具有悠久用藥歷史的傳統(tǒng)藥物，大戟屬植物在我國(guó)民間有著廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)。在藏藥系統(tǒng)中主要用于治療水腫、結(jié)核、疥瘡、無(wú)名腫毒等疾患。大戟屬植物良好的藥物活性，吸引了眾多的藥物化學(xué)家的關(guān)注。

表3 不同激素對(duì)大戟組織培養(yǎng)快速繁殖效果的影響

試驗(yàn)編號(hào)A(KT)(mg/L)B(6-BA)(mg/L)C(NAA)(mg/L)D(誤差項(xiàng))芽繁殖倍率10.11.00.513.3120.21.51.023.8930.42.01.534.2440.11.00.534.6850.21.51.015.1460.42.01.524.7570.11.00.524.9280.21.51.034.8190.42.01.514.56芽增殖倍率K110.9621.9124.2114.69A>B>CK215.1326.4123.1423.63A2B3C3K314.6922.5620.7922.719∑yi I=1=40.3R0.310.150.120.31CT=180.45

注：芽增殖倍數(shù)=(30 d后芽數(shù)-接種時(shí)芽數(shù))/接種時(shí)芽數(shù)。

表4 不同激素水平對(duì)大戟組培苗生根效果的影響

試驗(yàn)編號(hào)IBAAC生根率(%)平均根長(zhǎng)(cm)11.00.588.93.6621.01.089.54.0731.01.592.14.4142.00.591.33.9652.01.093.14.4962.01.592.74.37

圖5 大戟組培苗生根情況

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、分裂和發(fā)育，對(duì)組織培養(yǎng)起著重要的調(diào)節(jié)作用[9]。當(dāng)細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素的比值合適時(shí)，能誘導(dǎo)芽的形成和促進(jìn)芽的生長(zhǎng)。6-BA是組織培養(yǎng)研究中最常用的細(xì)胞分裂素，能促進(jìn)細(xì)胞分裂、側(cè)芽和植株的生長(zhǎng)等，萘乙酸NAA是一種廣譜型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo)形成不定根、增加坐果，防止落果等作用，吲哚乙酸IAA廣譜多用途，但因它在植物體內(nèi)外易降解而未成常用商品植物生長(zhǎng)素，能誘導(dǎo)形成不定根[10-11]。多種激素組合能更有效的促進(jìn)植物的相互作用的生長(zhǎng)，屬于協(xié)同效應(yīng)。因此在MS基本培養(yǎng)基內(nèi)同時(shí)加入6-BA、IAA對(duì)大戟生長(zhǎng)的具有較大的效果。

本研究中，大戟外植體經(jīng)15 d誘導(dǎo)培養(yǎng)，形成愈傷組織，其誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為B 5+2,4-D 1.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到80%；試驗(yàn)中得出大戟叢生芽繁殖的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+ KT 1.5+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L，大戟叢生芽的增殖率一般可達(dá)到6.5，且芽苗翠綠粗壯。試驗(yàn)中MS培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L的IBA和1.0 mg/L的IAA生根效果最好，生根率達(dá)93.1%，平均根長(zhǎng)達(dá)到4.49 cm,該研究方法生產(chǎn)的大戟種苗既可滿足人們對(duì)大戟的用途需求，又可保護(hù)珍稀瀕危種質(zhì)資源，同時(shí)還為豐富我國(guó)園林植物種類(lèi)提供保障。本研究結(jié)果為大戟的保護(hù)和可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用開(kāi)辟了一條新的途徑，為同屬其他物種的組織培養(yǎng)研究提供借鑒和參考。

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(本欄目責(zé)任編輯：申 曉)

Optimization Study of Tissue Culture Regeneration of Medicinal PlantsEuphorbiapekinensisRupr.

LICui,WEIYing,MIAOJianhua,WEIKunhua,LILinxuan,ZHANGZhanjiang

2016-10-20

廣西青年基金項(xiàng)目(2015 GXNSFBA 139104)；廣西中醫(yī)藥民族醫(yī)藥項(xiàng)目(GZBZ 14-15)；廣西壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究項(xiàng)目(MZY 2013052)。

李 翠(1982—)，女，黑龍江省依安縣人；碩士，助理研究員，主要從事藥用植物繁育與保存研究；E-mail:licuicui941@aliyun.com

張占江，副研究員，研究方向：藥用資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用；E-mail:zzj1811@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.04.131

S 567.23+9

A

1001-4705(2017)04-0131-04