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(長(zhǎng)江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 重慶 涪陵 408100)

涪陵胭脂蘿卜多倍體誘導(dǎo)研究

吳照云，陳發(fā)波，姚啟倫，方平，劉毅

(長(zhǎng)江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 重慶 涪陵 408100)

以不同濃度秋水仙素溶液處理胭脂蘿卜幼苗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，通過(guò)苗期和成株期對(duì)誘變植株和正常二倍體植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定,探討四倍體胭脂蘿卜的誘導(dǎo)方法與途徑。結(jié)果表明，5種濃度秋水仙素都能誘變出四倍體胭脂蘿卜，其中2 g/L秋水仙素誘變率最大，為33.3%。四倍體胭脂蘿卜平均葉片厚度、葉長(zhǎng)、株高、葉寬和開(kāi)展度較二倍體分別增加32.4%、39.6%、39.8%、24%和31.7%,四倍體胭脂蘿卜葉片單位視野內(nèi)的氣孔數(shù)目少于二倍體72.2%，但氣孔的橫徑和縱徑分別較二倍體大40.8%和30.7%。說(shuō)明葉片厚度、葉長(zhǎng)、株高、葉寬、開(kāi)展度、氣孔數(shù)目、氣孔的橫徑和縱徑等性狀可以作為四倍體鑒定的重要特征，特別是氣孔數(shù)目、氣孔的橫徑和縱徑可以作為快速鑒定四倍體與二倍體胭脂蘿卜的重要指標(biāo)。利用秋水仙素誘導(dǎo)是獲得四倍體胭脂蘿卜的有效途徑之一。

胭脂蘿卜； 同源多倍體； 秋水仙素； 誘導(dǎo)

胭脂蘿卜是十字花科(Brassicaceae)蘿卜屬(Raphanus)蘿卜種(RaphanussativusL.)下的一個(gè)栽培品種，主產(chǎn)重慶市涪陵區(qū)及周邊地區(qū)，是繼榨菜之后的第2個(gè)涪陵特產(chǎn)[1]。胭脂蘿卜含有大量天然色素——蘿卜紅，是提取天然色素的理想原料[2-4]。隨著人們生活水平的提高，對(duì)天然色素的需求越來(lái)越大。但目前所種植的胭脂蘿卜色素含量不高、產(chǎn)量低，種質(zhì)資源混雜、退化現(xiàn)象嚴(yán)重[5-7]，急需拓展胭脂蘿卜種質(zhì)資源。近年來(lái)，利用化學(xué)試劑誘導(dǎo)多倍體，是創(chuàng)制新的蘿卜種質(zhì)資源的有效途徑之一，已成功的運(yùn)用于蘿卜新品種的選育。戴忠良等[8]、張紅亮等[9-10]、Thanh等[11]、張蜀寧[12]和呂煒等[13]利用秋水仙素或氟樂(lè)靈處理蘿卜幼苗，均獲得了四倍體蘿卜，他們的研究均表明，四倍體蘿卜在根重、株高、葉片厚度、種子單粒徑、花粉粒大小、花器官大小和氣孔大小等方面均表現(xiàn)“巨大型”。但關(guān)于胭脂蘿卜四倍體誘導(dǎo)方面的研究報(bào)道相對(duì)較少。本研究利用不同濃度秋水仙素處理胭脂蘿卜幼苗，篩選適合于胭脂蘿卜多倍體誘導(dǎo)的秋水仙素濃度，探明四倍體胭脂蘿卜與二倍體植株在形態(tài)結(jié)構(gòu)和葉片氣孔等性狀上的差異，以期創(chuàng)制新的胭脂蘿卜種質(zhì)資源，為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)胭脂蘿卜品種的選育提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為“紅心1號(hào)”胭脂蘿卜，由重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用盆栽法，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每個(gè)濃度秋水仙素處理10盆胭脂蘿卜，每盆種植3株胭脂蘿卜。

1.2.2 四倍體的誘導(dǎo)

播種后，待幼苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，分別用1，1.5，2，2.5 g/L和3 g/L的秋水仙素溶液處理幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)，各濃度分別處理30盆，5盆胭脂蘿卜用蒸餾水處理作為對(duì)照。每天07：00-08:00時(shí)、18：00-19:00時(shí)各處理1次，連續(xù)處理5 d。

1.2.3 四倍體的鑒定

在胭脂蘿卜抽薹前，以蒸餾水處理的胭脂蘿卜為對(duì)照，對(duì)胭脂蘿卜葉片的皺縮程度、葉片厚度、葉長(zhǎng)、株高、葉寬、開(kāi)展度、氣孔密度、氣孔大小等性狀進(jìn)行觀察鑒定。氣孔鑒定的方法是分別取下植株中無(wú)病蟲(chóng)害的葉片，迅速放入冰中10～15 min，然后將部分葉片撕下放入FAA固定液(福爾馬林(38%甲醛)5 mL，冰醋酸5 mL，70%酒精90 mL)固定15 min，之后撕取下表皮，制作成臨時(shí)裝片，用尼康80 i研究級(jí)正置顯微鏡觀察、拍照、測(cè)量氣孔的橫徑和縱徑，記錄每張裝片5個(gè)視野內(nèi)的氣孔數(shù)，取10株獲取數(shù)據(jù)資料，最后取平均值作為該植株的氣孔數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度秋水仙素的誘導(dǎo)率

由表1可以看出，不同濃度秋水仙素都可以誘導(dǎo)出四倍體胭脂蘿卜，共種植450株胭脂蘿卜，鑒定出變異株91株，誘導(dǎo)率為20.2%。對(duì)不同處理間的誘導(dǎo)率進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知，不同濃度秋水仙素處理間誘導(dǎo)率存在極顯著差異，其中2 g/L秋水仙素誘導(dǎo)的變異率最高。從圖1可以看出，隨著秋水仙素濃度的增高，誘變的四倍體植株增多，當(dāng)秋水仙素濃度增加到一定濃度后，誘變的四倍體植株減少。

表1 不同濃度秋水仙素的誘導(dǎo)率

項(xiàng)目秋水仙素濃度(g/L)11．522．53 處理植株數(shù)(株)9090909090 變異數(shù)(株)1016302213 誘變率(%)11．117．833．324．414．4

表2 不同濃度秋水仙素誘導(dǎo)率方差分析

變異來(lái)源平方和自由度均方F值 區(qū)組間25．76212．8852．36?? 處理間474．894118．72482．68?? 誤差1．9780．25 總變異502．6214

注：“**”表示在0.01顯著水平。

圖1 不同濃度秋水仙素誘導(dǎo)率

2.2 四倍體胭脂蘿卜的主要形態(tài)特征

分別在苗期(圖2)和成株期(圖3)將誘變植株與二倍體植株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)誘變植株的葉片較卷曲，葉片的皺縮程度較大，根莖增粗，在葉長(zhǎng)、葉寬、株高、植株開(kāi)展度等性狀上與二倍體植株也有較大差異。從圖4可以看出，在成株期，相對(duì)于二倍體胭脂蘿卜植株，四倍體植株的葉厚度、葉長(zhǎng)、株高、葉寬、開(kāi)展度均高于二倍體，t檢驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，四倍體植株的葉厚、葉長(zhǎng)、株高、葉寬和開(kāi)展度均顯著高于二倍體。四倍體植株的平均葉片厚度、葉長(zhǎng)、株高、葉寬、開(kāi)展度較二倍體植株分別增加32.4%、 39.6%、39.8%、24%和31.7%。葉片厚度、葉長(zhǎng)、株高、葉寬和開(kāi)展度等性狀可以作為四倍體鑒定的重要特征。

圖5 四倍體植株(a)和二倍體植株(b)氣孔

圖2 苗期四倍體(a)與二倍體(b)胭脂蘿卜

圖3 成株期四倍體(a)和二倍體(b)胭脂蘿卜

表3 二倍體植株和四倍體植株性狀差異顯著性分析

性狀葉厚(cm)葉長(zhǎng)(cm)株高(cm)葉寬(cm)植物開(kāi)展度二倍體0．2521．2225．36．2435．5四倍體0．3735．15428．2252df1818181818t0．051．7341．7341．7341．7341．734︱t︱7．5?105．37?55．67?29．55?19．41?

注：*表示在0.05水平上顯著。下同。

圖4 二倍體植株和四倍體植株的性狀比較

2.3 四倍體胭脂蘿卜的氣孔特征

從圖5和圖6可以看出，二倍體胭脂蘿卜葉片單位視野內(nèi)的氣孔數(shù)明顯多于四倍體植株，但是四倍體植株氣孔的橫徑和縱徑都大于二倍體植株。四倍體植株單位視野內(nèi)的氣孔數(shù)目少于二倍體植株72.2%，但氣孔的橫徑和縱徑分別較二倍體植株大40.8%和30.7%。t檢驗(yàn)結(jié)果(表4)表明，二倍體胭脂蘿卜單位視野內(nèi)的氣孔數(shù)顯著多于四倍體植株，但是四倍體植株氣孔的橫徑和縱徑都顯著大于二倍體植株。

表4 二倍體植株和四倍體植株氣孔數(shù)目、氣孔橫徑、縱徑差異顯著性分析

氣孔數(shù)目(個(gè)/視野)氣孔橫徑(×10-3cm)氣孔縱徑(×10-3cm) 二倍體181．522．25 四倍體52．573．25 df181818 t0．051．7341．7341．734 ︱t︱12．26?26．25?57．8?

3 討 論

3.1 關(guān)于利用秋水仙素誘導(dǎo)四倍體胭脂蘿卜的探討

秋水仙素是誘導(dǎo)多倍體的有效試劑，目前已有較多科學(xué)家利用秋水仙素將二倍體植物成功誘導(dǎo)為四倍體。汪劍鳴研究表明，秋水仙素濃度越高, 白蘿卜的變異率越高[14]。張紅亮等采用不同質(zhì)量濃度的秋水仙素處理子葉期蘿卜莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，結(jié)果表明，經(jīng)2 g/L秋水仙素處理6次獲得同源四倍體的效果最佳, 四倍體誘導(dǎo)率達(dá)到4.5%[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著秋水仙素濃度(1～3 g/L)的增高，誘變的四倍體植株增多，當(dāng)秋水仙素濃度增加到一定濃度后，誘變的四倍體植株減少，主要原因是高濃度秋水仙素處理后的幼苗，植株生長(zhǎng)嚴(yán)重受到抑制，容易死亡。用2 g/L秋水仙素誘導(dǎo)四倍體胭脂蘿卜的效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)33.3%，這與汪劍鳴[14]和張紅亮等[9]的研究結(jié)果一致，認(rèn)為經(jīng)2 g/L秋水仙素處理獲得同源四倍體的誘導(dǎo)率最高。戴忠良等的研究結(jié)果表明，以0.2 g /L秋水仙素連續(xù)處理3 d的效果最好[8]，但0.2 g/L秋水仙素誘導(dǎo)率僅16%，低于本實(shí)驗(yàn)中胭脂蘿卜四倍體的誘導(dǎo)率。這可能與誘導(dǎo)的品種不同、處理的時(shí)間不同有關(guān)，也可能與四倍體鑒定的方法不同有關(guān)。

圖6 二倍體植株和四倍體植株氣孔數(shù)目、氣孔橫徑、縱徑的比較

3.2 四倍體胭脂蘿卜主要特征

已有研究均表明，四倍體蘿卜與二倍體蘿卜相比較，存在較大差異[8-14]，如四倍體蘿卜在保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)目、蘿卜花粉粒大小、花器官大小、葉片厚度、種子單粒徑、根重、株高、十葉厚、抗性、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、細(xì)胞間所吸收的二氧化碳濃度和蒸騰速率等方面均顯著大于二倍體蘿卜，其所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素C、可溶性糖和還原糖等也較二倍體多，四倍體蘿卜的氣孔大于二倍體，氣孔密度明顯小于二倍體蘿卜，但多倍體的育性降低[8-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四倍體胭脂蘿卜的平均葉片厚度、葉長(zhǎng)、株高、葉寬和開(kāi)展度較二倍體植株分別增加32.4%、 39.6%、39.8%、24%和31.7%，四倍體胭脂蘿卜葉片單位視野內(nèi)的氣孔數(shù)目少于二倍體植株72.2%，但氣孔的橫徑和縱徑分別比二倍體植株大40.8%和30.7%。說(shuō)明葉片厚度、葉長(zhǎng)、株高、葉寬、開(kāi)展度、氣孔數(shù)目、氣孔的橫徑和縱徑等性狀可以作為四倍體鑒定的重要特征，特別是氣孔數(shù)目、氣孔的橫徑和縱徑可以作為快速鑒定四倍體與二倍體胭脂蘿卜的重要指標(biāo)。

由于材料和時(shí)間有限，本研究沒(méi)有分析四倍體胭脂蘿卜的紅色素含量、品質(zhì)性狀、染色體數(shù)目和育性等，但獲得了四倍體胭脂蘿卜的種子，下一步實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步鑒定誘導(dǎo)突變體的特征。

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Study on Polyploid Induction of Red Radish Using Colchicinein Fuling District

WUZhaoyun,CHENFabo,YAOQilun,FANGPing,LIUYi

(Department of Life Sciences,Yangtze Normal University,Fuling Chongqing 408100,China)

Red radish with rich red radish pigment is an important commercial root vegetable,which is barely cultivated in Fuling district Chongqing city with low production and deficiency germplasm resources.It is very necessity to create new red radish germplasm resources.In this study,red radish was used to induct polyploid with 1 g/L,1.5 g/L,2 g/L,2.5 g/L,and 3 g/L colchicine on heart leaves in the seedlings time.The autotetraploid red radish was created by identifying the characteristics of morphology and cytology between polyploid and normal red radish.The results showed that autotetraploid red radish can be created using different concentrations of colchicine solution,while the autotetraploid red radish was well created with the induction rate as high as to 33.3% using 2 g/L colchicine.The leaf thickness,leaf length,plant height,leaf width,and plant expansion of autotetraploid red were 32.4%,39.6%,39.8%,24%,and 31.7% higher than diploid red radish,respectively.And the stomatal number of leaf per unit in autotetraploid was 72.2% less than the diploid,while the the hole diameter and the longitudinal diameter were 40.8% and 30.7% greater than the diploid,respectively.The results showed that leaf thickness,leaf length,plant height,leaf width,plant expansion,stomatal number of leaf,and the hole diameter and the longitudinal diamete of stomatal are importat traits that can be used in the identification of autotetraploid in red radish,especelly stomatal number of leaf,and the hole diameter and the longitudinal diamete of stomatal.It indicat that it is one of the effective ways to induce autotetraploid using colchicine in red radish.

red radish; autotetraploid; colchicine; induction

2016-11-17

重慶市科委基礎(chǔ)與前沿一般項(xiàng)目(cstc 2016 jcyjA 0136)。

吳照云(1994—)，男，重慶秀山人；學(xué)士，主要從事作物遺傳育種研究。

通迅作者：陳發(fā)波，副教授；E-mail:chenfabo963@126.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.038

S 637

A

1001-4705(2017)03-0038-04