，

(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院， 江西 宜春 336000)

梔子的psbA-trnH序列分析與鑒別

張兵鋒，周秀玲

(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院， 江西 宜春 336000)

對(duì)梔子的psbA-trnH片段進(jìn)行PCR擴(kuò)展、測(cè)序，利用MEGA 6.0進(jìn)行序列分析，計(jì)算樣本的遺傳距離(Pair-wise distance法)和發(fā)育系統(tǒng)樹(neighbor-joining 法)。結(jié)果表明，10種梔子屬的psbA-trnH序列長度為250～297 bp ，A+T平均含量74%，變異位點(diǎn)占24.76%；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)占6.43%。Pair-wise distance(PW)法計(jì)算遺傳距離，平均遺傳距離為0.058；鄰接法(NJ)對(duì)梔子屬種間的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行聚類分析，成功鑒別供試樣本。psbA-trnH 片段可作為梔子屬物種分子鑒別的候選序列。

梔子； psbA-trnH； 分子鑒定； DNA條形碼

中藥梔子為茜草科(Rubiaceae)梔子屬(Gardenia)梔子的果實(shí)，其性苦寒，歸心、三焦、肺經(jīng)，無毒，具清熱瀉火之功效[1]。藥理學(xué)研究表明，梔子具有保肝利膽、解熱鎮(zhèn)靜的功能，臨床上多用于止痛、冠心病、扭挫傷等[2]。梔子主要分布在長江以南的地區(qū)，江西為梔子道地性藥材的主產(chǎn)區(qū)。目前在市場(chǎng)上流通的梔子品種較多，混雜嚴(yán)重，并且質(zhì)量參差不齊；梔子連續(xù)幾年價(jià)格走低，農(nóng)戶不愿種植；而梔子野生資源破壞嚴(yán)重。因此，為了藥材梔子可持續(xù)化發(fā)展和合理利用，有必要對(duì)梔子種源的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析、鑒定，并以此為依據(jù)加強(qiáng)優(yōu)質(zhì)梔子的選育。

在分子生藥學(xué)研究深入的背景下，DNA條形碼技術(shù)已成為植物藥物種鑒定和分類的重要方法，并廣泛應(yīng)用于中藥材的基源鑒定，為藥材的真?zhèn)涡?、道地性甑別提供了一種穩(wěn)定、便捷的方法，成為中藥材鑒定方面的研究熱點(diǎn)[3]。DNA條形碼技術(shù)是采用物種質(zhì)體基因或核基因組中一段短小的、通識(shí)性的DNA序列來建立直觀快速準(zhǔn)確的物種鑒定，通過辨別物種間的差異，建立生物身份識(shí)別系統(tǒng)[4-5]。一般用來源于質(zhì)體的trnK-rps 16、psbA-trnH、rp 136-rps 8等和來源于核基因的ITS/ITS 2序列，作為DNA條形碼的候選基因序列；在物種鑒定中，單個(gè)序列即可成功鑒定物種[6-7]，亦可序列片段組合進(jìn)行物種鑒定[8]。候選序列中psbA-trnH序列是psbA基因(編碼光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的D 1 蛋白)與trnH基因(編碼tRNA組氨酸)的間隔序列，被列為被子植物中變異位點(diǎn)最多的序列之一[9]，可用于種間鑒別。本實(shí)驗(yàn)擬采用psbA-trnH序列對(duì)江西梔子樣本栽培黃梔子、重瓣梔子、雀舌梔子和NCBI GENBACK中梔子樣本進(jìn)行序列分析比較，為江西省道地藥材梔子的DNA條形碼鑒別提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 樣品材料

實(shí)驗(yàn)材料于2014年11月采于江西省宜春市，栽培黃梔子、重瓣梔子、雀舌梔子植株來源于NCBI GENBACK中梔子屬植物，如表1所示。采回的嫩葉樣本保存于宜春學(xué)院江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

表1 梔子樣品及源于NCBIGENBACK庫的梔子屬物種psbA-trnH序列信息

序號(hào)代碼/ACCESSION名稱來源地1LZ栽培梔子江西宜春2GZ重瓣梔子江西宜春3QZ雀舌梔子江西宜春4JX312208GardeniasaxatilisThailand5JX312210GardeniasootepensisThailand6JX312211GardeniaobtusifoliaThailand7JX312213GardeniathailandicaThailand8JX312214GardeniacollinsaeThailand9JX312217GardeniataitensisThailand10JX312218GardeniajasminoidesThailand

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

DNA提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)、DNA回收試劑盒(TIANGEN Midi Purefication Kit)、氯仿、乙醇(分析純)、Taq酶購于大連寶生物公司，引物由上海生物(工程)有限公司合成。

1.2.2 主要儀器

超低溫冰箱(7010702，Thermo)、水浴鍋(HH-4)、離心機(jī)(Eppendorf-G 5415 R)、PCR擴(kuò)增儀(BIO RAD T 100 Thermal Cycler)、雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀(DYY-6 C)、凝膠蛋白檢測(cè)系統(tǒng)(Gel Doc XB)等。

2 方 法

2.1 梔子樣本DNA提取

采用植物基因組DNA提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)來提取梔子樣品的總DNA(具體操作依據(jù)說明書進(jìn)行)，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA樣本的純度和相對(duì)濃度，合格樣本于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 梔子樣本DNA條形碼的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化

2.2.1 PCR方法步驟

本實(shí)驗(yàn)采用psbA-trnH序列的引物為psbA-trnH p 1:5’-gttatgcatgaacgtaatgct c-3’，psbA-trnH p 2:5’-cgcgcatggtggattcacaaatc-3’[10]。PCR反應(yīng)體系：10×buffer：2μL； MgCl2(25 mmol/L)：2μL；dNTPmix(2 mmol/L)：2μL；Primer-F：1μL；Primer-R：1μL；模板溶液：1μL；Taq酶：0.9μL； ddH2O：10.1μL，總反應(yīng)體積20μL，每個(gè)反應(yīng)2管。PCR反應(yīng)程序94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35次循環(huán)，72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束4 ℃保存。

2.2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化

PCR產(chǎn)物用TIANGEN的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN Midi Purefication Kit)進(jìn)行純化。

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列的測(cè)定

將純化回收后的產(chǎn)物委托上海生物(工程)有限公司測(cè)序。

2.4 序列數(shù)據(jù)的處理

經(jīng)過上海生工測(cè)序的純化產(chǎn)物DNA序列用Snapgene Viewer軟件打開，拷貝的序列使用軟件MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis) 6.0進(jìn)行序列分析，采用Pair-wise distance(PW)法計(jì)算遺傳距離，鄰接法(neighbor joining method)構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹；系統(tǒng)樹的分支置信度采用自舉檢驗(yàn)法(bootstrap test)檢驗(yàn)[11]。

3 結(jié)果與分析

3.1 梔子屬樣本總DNA提取及檢測(cè)

采用TIANGEN的植物基因組DNA提取試劑盒提取梔子的總DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的栽培梔子、重瓣梔子、雀舌梔子3個(gè)樣本的總DNA，結(jié)果如圖1所示，DNA條帶都比較清晰，樣本總DNA提取質(zhì)量較好，可用于引物片段的PCR擴(kuò)增。

3.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

采用psbA-trnH序列通用引物對(duì)樣本梔子總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，psbA-trnH 對(duì)GZ、LZ、QZ的rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)總體條帶都比較完整明亮，樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的分子量在250 bp左右，可作為后面測(cè)序的實(shí)驗(yàn)材料。

表2 10個(gè)梔子屬植物psbA-trnH序列長度和堿基含量

代碼/ACCESSION物種長度(bp)A(bp)T(bp)C(bp)G(bp)A+T(%)G+C(%)LZ栽培梔子28010810122497525GZ重瓣梔子2791089426517228QZ雀舌梔子2741119520487525JX312208Gardeniasaxatilis2521018818457525JX312210Gardeniasootepensis256919821467426JX312211Gardeniaobtusifolia2508510721377723JX312213Gardeniathailandica2971119836527030JX312214Gardeniacollinsae261999220507327JX312217Gardeniataitensis261959423497228JX312218Gardeniajasminoides2721059522507426平均值268．2101．496．222．947．77426

圖1 梔子總DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

3.3 psbA-trnH序列特征分析

10個(gè)梔子屬樣本的psbA-trnH序列通過MEGA 6.0軟件進(jìn)行分析，以Gardeniajasminoides的psbA-trnH(JX 312218)的起始位置序列的5’-GAC GTT AGC CTT ATT GTA TAA GAG T-3’，共25 bp確定所有樣本的起始點(diǎn)。psbA-trnH序列分析結(jié)果(表2)表明，10個(gè)梔子屬植物psbA-trnH序列長度在250～297 bp的范圍內(nèi)，其中A平均101.4 bp，T 96.2 bp，C 22.9 bp，G 47.7 bp；A+C占比平均74%，G+C平均占比26%，可見梔子屬樣本的psbA-trnH序列中A+T的含量遠(yuǎn)高于G+C。如梔子屬psbA-trnH 序列特征所顯示，psbA-trnH 序列變異比較大的因素可能是低能量堿基所占份額大、無功能、自然選擇壓力小。通過MEGA 6.0排序后的間并序列長度為311 bp，變異位點(diǎn)如圖3所示，共77個(gè)，占位點(diǎn)數(shù)24.76%；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)20個(gè)，占位點(diǎn)數(shù)6.43%。

圖2 psbA-trnH片段瓊脂糖凝膠電泳圖

3.4 psbA-trnH序列遺傳特征分析

采用Pair-wise distance(PW)法對(duì)10個(gè)梔子屬樣本的psbA-trnH序列計(jì)算遺傳距離，結(jié)果如表3所示。10個(gè)梔子屬樣本的遺傳距離波動(dòng)在0.000～0.206，平均遺傳距離為0.058。栽培梔子(LZ)與Gardeniathailandica(JX 312213)遺傳距離為0.000，該結(jié)果與中藥茜草遺傳距離一致[18]，但通過變異位點(diǎn)分析(圖3)，兩者存在19個(gè)變異位點(diǎn)，在DNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)上可區(qū)分出兩物種遺傳差異，可見采用psbA-trnH序列片段一級(jí)結(jié)構(gòu)能對(duì)梔子屬物種做出細(xì)微鑒別；栽培梔子(LZ)、重瓣梔子(GZ)、雀舌梔子(QZ)這3個(gè)江西省品種與Gardeniasaxatilis(JX 312208)的遺傳距離較大，平均為0.156，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

注：Identical=. Missing=? Indel=-。圖3 10個(gè)梔子屬植物psbA-trnH序列變異位點(diǎn)

圖4 基于psbA-trnH序列的10個(gè)梔子屬種間種系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 10個(gè)梔子屬植物psbA-trnH序列的遺傳距離

序號(hào)12345678910120．02430．0240．01940．0790．0690．06450．0290．0390．0480．07960．1520．1590．1580．2060．14170．0000．0240．0240．0790．0290．15280．0140．0290．0290．0630．0430．1520．01490．0050．0290．0290．0840．0330．1470．0050．019100．0050．0190．0190．0740．0340．1460．0050．0090．009

注：1為栽培梔子(LZ)，2為重瓣梔子(GZ)，3為雀舌梔子(QZ)，4為Gardeniasaxatilis(JX 312208)，5為Gardeniasootepensis(JX 312210)，6為Gardeniaobtusifolia(JX 312211)，7為Gardeniathailandica(JX 312213)，8為Gardeniacollinsae(JX 312214)，9為Gardeniataitensis(JX 312217)，10為Gardeniajasminoides(JX 312218)。

采用UPGMA法對(duì)10個(gè)梔子屬樣本的psbA-trnH序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。從圖4可見，栽培梔子(LZ)、Gardeniathailandica(JX 312213)、Gardeniataitensis(JX 312217)、Gardeniajasminoides(JX 312218)4個(gè)物種親緣關(guān)系比較近，聚為一支；重瓣梔子(GZ)、雀舌梔子(QZ)的遺傳關(guān)系更近，聚為一支；在10個(gè)樣本中，Gardeniaobtusifolia(JX 312211)的親緣關(guān)系與其他種較遠(yuǎn)?？梢姡琾sbA-trnH序列可用于梔子屬植物的分子鑒定。

4 討 論

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展以及中藥質(zhì)量安全的要求，在中藥鑒定研究中， DNA條形碼技術(shù)的引入大大促進(jìn)了中藥植物鑒定的發(fā)展，并有多種藥用植物應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)來鑒別其真?zhèn)纹泛偷赖匦訹12]。目前，有多條DNA條形碼候選序列成功地用于物種鑒別和系統(tǒng)分類，如rDNA ITS序列片段成功鑒別廣東紫珠[13]、盤龍參[14]、鉤藤[15]、黃草石斛[11]等物種，ITS 2條形碼成功用于豆蔻屬物種的系統(tǒng)分類[16]，rbcL序列片段在五味子[17]鑒定上取得了很好的成果。

為更好掌握梔子的遺傳相似性，便于指導(dǎo)藥材梔子的選育，本實(shí)驗(yàn)首先采用了rDNA ITS、matK、rbcL3個(gè)序列的DNA條形碼通用引物對(duì)3個(gè)梔子樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，matK、rbcL 2個(gè)片段PCR擴(kuò)增未成功，rDNA ITS擴(kuò)增成功并測(cè)序；matK序列因?yàn)橐锾禺愋圆?，一般認(rèn)為是PCR擴(kuò)增成功率不高的DNA片段[9]，本實(shí)驗(yàn)matK序列通用引物進(jìn)行樣本PCR擴(kuò)增，3個(gè)樣本均未擴(kuò)增成功；而擴(kuò)增成功的rDNA ITS序列測(cè)序分析結(jié)果表明，重瓣梔子(GZ)、雀舌梔子(QZ)、栽培梔子(LZ)在rDNA ITS片段上序列高度一致，不能區(qū)分來源于江西宜春地區(qū)的3種梔子。

psbA基因是編碼光合作用系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的D 1蛋白，trnH是編碼tRNA組氨酸基因，兩基因之間的序列稱為psbA-trnH 間隔序列，其存在于葉綠體上，屬于母性遺傳。此段序列僅起到鏈接2個(gè)基因的作用，其所受到的選擇壓力小，存在相對(duì)較多的變異位點(diǎn)，進(jìn)化速率快，兩端DNA序列保守便于設(shè)計(jì)通用引物[18]，是被普遍看好的DNA條形碼序列，尤其是對(duì)有花植物[8]，對(duì)物種的識(shí)別能力可高達(dá)90%[19]。本實(shí)驗(yàn)采用psbA-trnH序列的通用引物對(duì)3個(gè)梔子樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均成功，并測(cè)序。序列分析結(jié)果表明，梔子屬物種的psbA-trnH序列片段上，G+C含量遠(yuǎn)低于A+T 含量(74%)，這一結(jié)果與楓斗類石斛[11]、茜草[20]的psbA-trnH序列特征變化一致；對(duì)10個(gè)梔子屬物種的psbA-trnH序列進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，該片段可作為梔子屬物種鑒別的DNA 分子標(biāo)記。

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Analysis and Identification of psbA-trnH Sequence of Gardenia Species

ZHANGBingfeng，ZHOUXiuling

(College of Chemistry and Biotechnology，Yichun University，Yichun Jiangxi 336000，China)

The study aimed to investigate the variation of psbA-trnH intergenic region sequences in Gardenia species.The DNA sequences of psbA-trnH were amplified,sequenced,and then analyzed by the software MEGA 6.0.The Genetic distances were calculated through using Pair-wise distance method,and molecular authentication analysis was constructed by Neighbor-joining (NJ) method.The results showed that the total lengths of psbA-trnH were 250-297 bp,the content of A+T was 74%,higher than that of G+C.The percentage of variation sites was 24.76% and parsimony informative sites up to 6.43%;the average genetic distances was 0.058;the phylogenetic tree demonstrated that all samples ofGardeniaspecies were identificated.Therefore,the psbA-trnH sequence was an efficient region for molecular identification ofGardeniaspecies.

Gardeniaspecies; psbA-trnH； molecular authentication; DNA barcoding

2016-10-22

教育部生物工程特色專業(yè)建設(shè)；江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目。

張兵鋒(1979—)，男，河南上蔡人；博士，主要從事藥學(xué)研究；E-mail：jiaminligz@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.033

S 567.1+9

A

1001-4705(2017)03-0033-05