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(1.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 合肥 230031； 2.貴州省中國科學(xué)院，天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室， 貴陽 550002；3.西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院， 陜西 西安 710048)

低溫脅迫對燕麥種子萌發(fā)期蛋白質(zhì)組影響的研究

王霞霞1，李龑2，李巖1，徐智明1，朱德建1，沈玲3

(1.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 合肥 230031； 2.貴州省中國科學(xué)院，天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室， 貴陽 550002；3.西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院， 陜西 西安 710048)

為探析燕麥種子萌發(fā)時蛋白質(zhì)的差異表達(dá)及其相關(guān)蛋白的生理功能，采用室內(nèi)生測法比較了不同溫度下種子萌發(fā)力和幼苗的生長能力，同時采用雙向電泳(2-DE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜的方法，比較低溫條件下(5 ℃)吸脹25 h和128 h(萌發(fā))與正常溫度下吸脹25 h(萌發(fā))時種子蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)。結(jié)果表明，隨著溫度的降低，燕麥種子的萌發(fā)活力降低。燕麥種子蛋白質(zhì)組在低溫脅迫下萌發(fā)時，有7個蛋白質(zhì)點發(fā)生了變化，其中5 ℃低溫吸脹25 h時，有3個蛋白質(zhì)點的表達(dá)量降低；5 ℃低溫吸脹萌發(fā)128 h時，有5個蛋白質(zhì)點表達(dá)發(fā)生了改變，其中3個蛋白質(zhì)點的表達(dá)量增加。經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定分析和Mascot搜索NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫，確定了4個蛋白質(zhì)，分別為燕麥蛋白、燕麥蛋白N 9和絲氨酸蛋白酶抑制劑等。這些蛋白質(zhì)的質(zhì)量變化與燕麥種子萌發(fā)時的低溫脅迫可能有關(guān)聯(lián)。

燕麥； 雙向電泳； 質(zhì)譜； 種子蛋白； 低溫脅迫

seed protein; low temperature stress

燕麥屬于冷涼區(qū)作物，多在早春和秋季播種，因此在早期生長中易遭遇低溫傷害。燕麥種子萌動發(fā)芽后遭遇低溫會使種子生長減緩甚至停止生長[1]。陳立君等研究認(rèn)為，隨著溫度的降低和低溫持續(xù)時間的延長，種子萌發(fā)率和出苗率均下降，且萌發(fā)和出苗時間延緩[2-3]。賈志國等還就遭遇低溫脅迫時種子的某些生理特性作了分析[2,4]。

蛋白質(zhì)差異表達(dá)是復(fù)雜的生命活動中生物體繁復(fù)的基因表達(dá)模式及多變的環(huán)境條件的綜合體現(xiàn)。因此，從蛋白質(zhì)組入手有助于更全面的了解低溫脅迫的傷害機(jī)制和植物的適應(yīng)機(jī)理。目前關(guān)于植物低溫脅迫的蛋白質(zhì)應(yīng)答研究比較多。周瑞蓮等研究發(fā)現(xiàn)，在一定的溫度范圍，成熟過程中大豆種子蛋白質(zhì)的累積與溫度的降低負(fù)相關(guān)[5]。孫勇等分析了香蕉幼葉低溫脅迫下的蛋白表達(dá)譜，得到了82個有顯著差異的蛋白點，差異蛋白分析表明，綠色組織通過改變光合作用、糖類及能量代謝相關(guān)酶的表達(dá)量來調(diào)節(jié)能量與碳代謝，保證養(yǎng)分供給，同時主要借助超氧化物歧化酶清除系統(tǒng)來提高抵御低溫的能力[6]。這與黃錦文等[7]研究較為相似。溝葉結(jié)縷草葉片中胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧的清除、蛋白質(zhì)防御等代謝途徑的相關(guān)蛋白在低溫適應(yīng)的過程中表達(dá)量有所增高[7]。Cui等[8]在低溫脅迫的水稻葉片上發(fā)現(xiàn)了60多個蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生了改變。這些研究為植物抗低溫環(huán)境下生理活動的分子機(jī)制的解析提供了基礎(chǔ)，但多集中于綠色組織。關(guān)于種子萌發(fā)時蛋白表達(dá)應(yīng)答低溫脅迫的報道較少。王霞霞等[9-10]對燕麥品種白燕2號種子的蛋白質(zhì)組和種子萌發(fā)時蛋白質(zhì)的差異表達(dá)作了分析，為了解燕麥籽粒的生理活動機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。在此基礎(chǔ)上，本試驗仍以燕麥品種白燕2號為試材，于智能氣候培養(yǎng)箱內(nèi)不同溫度下培養(yǎng)萌發(fā)，比較其萌發(fā)和早期幼苗的生長情況，選擇具有代表性的處理進(jìn)行萌發(fā)期種子蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異分析，從而構(gòu)建燕麥種子應(yīng)答低溫脅迫的蛋白質(zhì)差異表達(dá)圖譜，為探析燕麥種子萌發(fā)時應(yīng)答低溫脅迫的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

本試驗以栽培中較廣泛的燕麥品種白燕2號種子為試材。試驗共設(shè)4個恒溫處理和2個變溫處理：5，10，15，20 ℃，20 ℃(12 h)/12 ℃(12 h)、10 ℃(12 h)/2 ℃(12 h)，其中20 ℃處理為對照。

選用飽滿一致的種子，經(jīng)乙醇溶液(70%)消毒(5 min)后用蒸餾水清洗3次。按照20粒/皿將種子腹溝朝下均勻置于直徑12 cm墊2層濾紙的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿注入蒸餾水(10 mL)后于不同溫度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至種子萌發(fā)后立即移入20 ℃恒溫條件下培養(yǎng)生長。于萌發(fā)處理的第140小時測定幼苗的生長情況。每處理3次重復(fù)。

1.2 種子萌發(fā)力及早期幼苗生長的測定

以胚根突破種皮2 mm為準(zhǔn)，統(tǒng)計萌發(fā)進(jìn)程，同時參考文獻(xiàn)[11]測量不同處理萌發(fā)種子莖高、根長、莖鮮重/干重及根鮮重/干重，并計算萌發(fā)率、萌發(fā)2 d時的萌發(fā)指數(shù)、萌發(fā)初始時間、萌發(fā)完成時間及貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)運率等參數(shù)。

1.3 蛋白質(zhì)的分離與鑒定

1.3.1 蛋白樣品制備

不同處理萌發(fā)期種子40粒，液氮中研磨成粉末狀。種子粉末轉(zhuǎn)入離心管，按種子粉末60 mg配比1 mL雙向電泳裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L二硫蘇糖醇和0.5% IPG 緩沖液)混合，充分振蕩后于低溫4 ℃靜置10 h，離心15 min(10 000 r/min)。上清液即為蛋白質(zhì)樣品?？捡R斯亮藍(lán)法測定樣品液蛋白質(zhì)濃度后分裝于離心管并低溫(-80 ℃)凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 燕麥種子蛋白電泳分離和蛋白質(zhì)點的鑒定

[11]的方法，二維凝膠電泳分離燕麥種子蛋白質(zhì)，構(gòu)建蛋白質(zhì)二維圖譜。以蛋白點染色密度變化幅度高于2倍為標(biāo)準(zhǔn)選擇差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點。挖取差異表達(dá)蛋白點于離心管超純水沖洗后加入50%乙氰和25 mmol/L的碳酸氫銨溶液沖洗，再于純乙氰脫色過夜獲得白色不透明的膠粒。膠粒干燥后于胰蛋白酶溶液中酶解過夜(37 ℃)；注入1%三氟乙酸終止反應(yīng)后用ultraflex TOF-TOF質(zhì)譜儀(Bruker，Germany)分析肽質(zhì)量，并用Mascot搜索NCBI 非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對燕麥種子萌發(fā)的影響

由表1可知，隨著溫度的降低，燕麥種子萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)降低，萌發(fā)完成時間逐漸延長。5 ℃恒定低溫處理下燕麥種子萌發(fā)率僅為對照的71%。種子萌發(fā)的發(fā)生時間大大推遲，萌發(fā)持續(xù)時間延長至對照的4.8倍之多。而間歇性的2 ℃低溫處理的種子雖然也很大程度的延緩了萌發(fā)，但萌發(fā)率仍高達(dá)93.33%。

表1 溫度對萌發(fā)期燕麥種子活力的影響

溫度處理(℃)萌發(fā)初始時間(h)萌發(fā)完成時間(h)萌發(fā)率(%)萌發(fā)指數(shù)20(ck)19．00b32．00e100．00a22．83a1520．00b50．00d98．43a18．33b1048．00c70．00c95．00b12．17c5128．00a148．00a71．00c0．00d20(12h)/12(12h)18．00b29．00e94．80b18．50b10(12h)/2(12h)80．00a110．00b93．33b0．00d

注：字母表示plt;0.05。下同。

注：A為20 ℃吸脹25 h燕麥種子2-DE圖； B為5 ℃吸脹25 h燕麥種子2-DE圖；C為5 ℃吸脹128 h燕麥種子2-DE圖。圖1 不同溫度下萌發(fā)燕麥種子2-DE蛋白質(zhì)圖譜

由此可見，燕麥種子萌發(fā)時可忍耐短暫的極低溫度，而對長時間的低溫較敏感。因此，本試驗選擇5 ℃低溫處理的種子作為種子萌發(fā)期應(yīng)答低溫傷害研究的代表性處理。

2.2 低溫脅迫對燕麥早期幼苗生長的影響

低溫脅迫下萌發(fā)的種子在正常生長溫度下幼苗的生長情況見表2。由表2可知，低溫脅迫不僅抑制了種子的萌發(fā)進(jìn)程，還對后期幼苗的生長有影響。隨著溫度的降低，幼苗的根長、莖長、種子貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)運速率均降低。5 ℃低溫處理幼苗的根/莖生長分別為對照的2.27%、4.1%，其貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)運率僅為對照的1.5%。而間歇性的2 ℃低溫[10 ℃(12 h)/2 ℃(12 h)]處理的貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)運率為18.25%，是5 ℃恒定低溫處理的的24.27倍。

表2 不同溫度下處理萌發(fā)燕麥種子的幼苗生長

溫度處理(℃)根長(cm)莖長(cm)貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)運率(%)20(ck)8．8a4．9a49．72021a156．7b4．4a35．90811b104．1c2．6b31．98327c50．2e0．2c0．753025e20(12h)/12(12h)2．8d2．5b38．85174b10(12h)/2(12h)3．1d2．2b18．24633d

2.3 低溫脅迫對燕麥種子萌發(fā)蛋白質(zhì)組的影響

一般而言，適溫下燕麥種子20 ℃下吸脹萌發(fā)20 h左右種子即可進(jìn)入生長吸水期(第3階段)，胚根突破種皮，幼苗生長開始[10]。鑒于低溫會延緩種子萌發(fā)，因此溫度處理燕麥種子樣品按照時間和種子萌發(fā)進(jìn)程2個標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。結(jié)合本試驗中燕麥萌發(fā)初始時間分別為19 h(20 ℃)和128 h(5 ℃)，分別于萌發(fā)處理25，138 h進(jìn)入萌發(fā)盛期。因此，燕麥種子萌發(fā)應(yīng)答低溫脅迫的蛋白質(zhì)研究對照樣品采集20 ℃處理25 h(萌發(fā)盛期)的萌發(fā)種子；而低溫處理樣品采集則分別取5 ℃處理25 h未萌發(fā)種子和5 ℃處理138 h(萌發(fā)盛期)的萌發(fā)種子。

圖1為正常溫度(20 ℃)下已萌發(fā)(25 h)種子與5 ℃低溫下處理25 h和已萌發(fā)(138 h)種子蛋白質(zhì)組的2-DE凝膠圖譜。凝膠經(jīng)PDQuest 8.0.1軟件分析。與對照(20 ℃)條件下燕麥種子蛋白質(zhì)組相比，5 ℃低溫下吸脹25 h時有3個蛋白質(zhì)點的表達(dá)量發(fā)生了明顯的下調(diào)(蛋白點1、2、3)；至5 ℃138 h時有4個蛋白質(zhì)點表達(dá)發(fā)生了改變，其中3個蛋白質(zhì)點的表達(dá)量增加(蛋白點5、6、7)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，僅4個蛋白質(zhì)點得到有效鑒定，結(jié)果如表3所示。凝膠中分子質(zhì)量相似而等電點不同的2個蛋白點2和6經(jīng)質(zhì)譜鑒定為同一種蛋白——燕麥蛋白。

3 討 論

溫度是影響種子萌發(fā)的主要條件之一。本試驗對不同溫度處理的燕麥種子萌發(fā)情況做了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2～20 ℃范圍內(nèi)，燕麥種子均可萌發(fā)，但是隨著溫度的降低，萌發(fā)率和萌發(fā)勢降低。這一結(jié)果與杜堯東等[4]在番茄種子低溫脅迫下萌發(fā)的研究結(jié)論相似。同時，隨著萌發(fā)時溫度的降低，早期燕麥幼苗的根長、莖長、種子貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)運速率均降低。種子蛋白分析顯示：低溫使得燕麥種子的貯藏蛋白發(fā)生差異表達(dá)。雖然本試驗顯示燕麥種子萌發(fā)時甚至可耐間歇性2 ℃的低溫，但是10 ℃(12 h)/2 ℃(12 h)處理的貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)運率僅為18.25%，僅及10 ℃恒定低溫處理的57.07%。由此可見，低溫對種子貯藏蛋白的動員利用嚴(yán)重的影響著燕麥早期幼苗的建成。其緣由可能是低溫脅迫消耗了一定能量從而縮減了幼苗建成時的能量供給，也可能是低溫脅迫下差異表達(dá)的蛋白阻礙了幼苗的建成。

表3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

蛋白質(zhì)點登錄號蛋白質(zhì)名稱序列等電點分子質(zhì)量覆蓋率(%)得分表達(dá)1gi：6692103絲氨酸蛋白酶抑制劑3F22C12．22K．KIDFVADHPFLFLIR．E；K．DFVADHPFLFLIR．E；R．EEKTGTVLFVEMEDEGAMK．K；R．QGNDTSRNFSMHFYLPDEK．D5．21729118128下調(diào)2gi：358247775燕麥蛋白AveninproteinR．QAICQVTR．Q；R．QLAQIPEQLR．C；R．QFLVQQCSPVAAVPFLR．S7．702457816110下調(diào)6gi：327315253燕麥蛋白AveninproteinR．QFLVQQCSPVAEVPFLR．S；R．QLAQIPEQVR．C7．722611612137上調(diào)7gi：75107166燕麥蛋白N9AveninN9R．QAICQVAR．Q；R．QLAQIPEQLR．C；R．QFLVQQCSPVAVVPFLR．S7．442147919128上調(diào)

植物在抵御逆境侵害的過程中自身將會發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，并誘導(dǎo)某些基因特殊表達(dá)，進(jìn)而使蛋白質(zhì)的種類、數(shù)量或表達(dá)方式發(fā)生變化。目前，低溫脅迫蛋白質(zhì)組研究主要是以溝葉結(jié)縷草[7]、水稻[12-15]等植物綠色材料進(jìn)行的。Hashimoto[16]比較了2周齡水稻葉片，葉鞘、根系經(jīng)5 ℃低溫脅迫2 d的蛋白質(zhì)組的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：低溫脅迫會引起植物體內(nèi)產(chǎn)能代謝的活躍，從而使得與脅迫相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)，而與防御相關(guān)蛋白表達(dá)量下降；而且不同組織的蛋白質(zhì)組對低溫的響應(yīng)表達(dá)有差異。Renaut等[17]報道低溫脅迫下，楊樹幼苗葉片中的熱激蛋白、伴侶蛋白、脫水素和 LEA 等蛋白質(zhì)的表達(dá)量上調(diào)，而與能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)，甚至消失。Yang等[18]研究認(rèn)為，種子萌發(fā)中類似驅(qū)動蛋白通過調(diào)節(jié)需氧呼吸抵抗低溫脅迫?？梢?，植物對低溫逆境脅迫的應(yīng)答機(jī)理不僅受物種的影響，同時與作物組織器官、生育期等有關(guān)聯(lián)。

本試驗比較了5 ℃和20 ℃下萌發(fā)的燕麥種子的蛋白質(zhì)組的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：低溫脅迫下萌發(fā)時，燕麥種子中的燕麥蛋白、燕麥蛋白N 9和F 22 C 12.22等蛋白發(fā)生了差異表達(dá)。燕麥蛋白是燕麥種子萌發(fā)時動員利用的主要蛋白質(zhì)類型[9]。王霞霞[10]在萌發(fā)的燕麥種子中曾檢測到5個不同的燕麥蛋白。本試驗發(fā)現(xiàn)，短時間(25 h)低溫(5 ℃)處理不僅使得種子未能萌發(fā)，同時伴隨著燕麥蛋白(gi:358247775)表達(dá)被抑制。隨著低溫處理時間延長至128 h種子萌發(fā)時，燕麥籽實貯藏蛋白中燕麥蛋白(gi:327315253)和燕麥蛋白N 9(gi:75107166)的表達(dá)量上調(diào)。燕麥蛋白(gi:327315253)在未萌發(fā)的燕麥種子中表達(dá)量較高，正常溫度下萌發(fā)時其表達(dá)量有所降低[10]。然而本實驗發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫使得此蛋白在萌發(fā)的燕麥種子中表達(dá)量增加。多形態(tài)、多方式的燕麥蛋白表達(dá)可能是燕麥蛋白在其種子萌發(fā)和逆境脅迫雙重作用下發(fā)生了蛋白修飾、降解等過程所致的結(jié)果。

F 22 C 12.22表示絲氨酸蛋白酶抑制劑3，即serpin 3、SRP 3，是絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)的一種。蛋白酶抑制劑(protease inhibitor,PI)與蛋白酶(protease)普遍存在于動植物及微生物中。它們以相互影響的動態(tài)平衡來實現(xiàn)生物調(diào)控的目的。蛋白酶抑制劑多存在于植物的貯藏器官，尤其是種子和球莖，其含量常?？筛哌_(dá)總蛋白的1%～10%。植物葉片受機(jī)械損傷或化學(xué)處理也會大量積累蛋白酶抑制劑。目前已發(fā)現(xiàn)含有蛋白酶抑制劑的植物有90多種，多存在草本植物，包括豆科、禾本科、茄科等[20]。絲氨酸蛋白酶抑制劑多存在于種子、塊莖等器官。它對植物本身具有保護(hù)作用。例如，可使種子處于休眠狀態(tài)防止種子自身發(fā)生分解代謝。隨著種子的萌發(fā)，種子的絲氨酸蛋白酶抑制劑的含量降低[22]。本試驗發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫會抑制絲氨酸蛋白酶抑制劑在種子萌發(fā)中的表達(dá)。但是關(guān)于其在種子中涉及的相關(guān)生理功能還有待進(jìn)一步的探討。

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Analysis of Protein Changes During Oat Seed GerminationUnder Low Temperature Stress

WANGXiaxia1，LIYan2，LIYan1，XUZhiming1，ZHUDejian1，SHENLing3

(1.Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031，China；2.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences,Guiyang 550002,China;3.School of Environmental and Chemical Engineering,Xi’an Polytechnic University,Xi’an Shanxi 710048,China)

To analysis the differences of protein expression and its related physiological function of oat seed germination under salt stress,the seed germination rate and seedling growth were compared at different low temperature,and the changes of oat proteins were investigated during the seed germination at the low temperature.Two-dimensional gel electrophoresis was applied to analyze the changes of seeds proteins at 25 h after imbibition at 20 ℃,seeds proteins at 25 h and 138 h after imbibition at 5 ℃.The results showed:seed germination of oat and growth of seedlings were decreased.The changes of protein were detected and seven protein spots were altered.three protein spots were decreased at 25 h after imbibition at 5 ℃,and five spots were altered at 138 h after imbibition in 5 ℃.These spots were identified using MALDI-TOF mass spectrometery and searching NCBI database with Mascot software.Four proteins was identified including SRP 3,avenin protein and avenin N 9.Those differential proteins expression are linked with oat seed germination under low temperature stress.

AvenasativaL.; two-dimensional gel electrophoresis; mass spectrometery;

2016-10-13

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新項目(15 B 0411)。

王霞霞(1977-)，女，甘肅慶陽人；博士，主要從事作物生態(tài)生理的研究；E-mail:wangxiaxia1029@sina.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.028

S 512.6

A

1001-4705(2017)03-0028-05