邱銳唐成坤邵榮學全仁夫

1.浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學附屬廣興醫(yī)院 3.浙江中醫(yī)藥大學附屬江南醫(yī)院

獼猴骨髓間充質干細胞采集、分離培養(yǎng)及生物學特性研究

邱銳1唐成坤1邵榮學2全仁夫3

1.浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學附屬廣興醫(yī)院 3.浙江中醫(yī)藥大學附屬江南醫(yī)院

[目的]體外分離培養(yǎng)獼猴骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs),研究其生長增殖特性及其向成骨細胞的誘導分化能力。[方法]采用全骨髓貼壁法純化獼猴骨髓源BMSCs,觀察獼猴BMSCs的生長情況并運用MTT法繪制其生長曲線；對其進行流式細胞技術分析，鑒定 BMSCs的生物學特性；在體外應用成骨誘導培養(yǎng)液(含 0.1umol·L-1地塞米松、10mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、10%FBS、50umol·L-1抗壞血酸鈉、維生素C 50mg·L-1)定向誘導分化,對分化后的細胞進行ALP、Von Kossa染色以鑒定其向成骨誘導的潛能。[結果]獼猴BMSCs的生長曲線如下:細胞在開始培養(yǎng)時有2d左右的相對靜止期，3～6d增殖迅速，呈對數(shù)生長，7d后進入平臺期，細胞增殖明顯減緩。流式細胞儀檢測結果顯示：CD44和CD105的表達率分別為98.20%和95.01%，均呈強陽性，而CD34和CD45的表達率分別為1.38%和3.30%，呈陰性。未進行成骨誘導的第3代獼猴BMSCs，ALP染色呈陰性，未出現(xiàn)紅色顆粒，且不隨時間而改變；進行成骨誘導的第3代獼猴BMSCs，ALP染色呈陽性，第7d細胞中央出現(xiàn)散在分布的紅色顆粒，并且隨著誘導時間延長而增多顏色也逐漸加深，第14d鏡下紅色顆粒較前增多，且顏色也較前加深，其結果表明BMSCs在定向誘導分化為成骨細胞及骨細胞。未進行成骨誘導的第3代獼猴BMSCs，Von Kossa染色呈陰性，且不隨時間而改變；進行成骨誘導的第3代獼猴BMSCs在第7d Von Kossa染色后鏡下出現(xiàn)黑色沉積樣結節(jié)，呈散在分布、大小不一，提示有鈣樣基質產生，第14d Von Kossa染色后鏡下出現(xiàn)明顯增大的黑色結節(jié)樣物質，且數(shù)量增多、顏色加深。[結論]通過全骨髓貼壁分離法可以獲得純度較高的獼猴骨髓源BMSCs,體外培養(yǎng)具有較強的增殖能力,在成骨細胞誘導劑培養(yǎng)基里可以誘導其向成骨細胞方向分化，具有良好的成骨分化潛能，是組織工程骨中理想的種子細胞。

BMSCs；體外培養(yǎng)；細胞生物學特征；誘導分化；成骨細胞；組織工程

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是能夠自我增殖和具有多向分化潛能的細胞，由Friedenstein等[1]在1966年最先發(fā)現(xiàn)并對其進行闡述。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs具有良好的成骨分化潛能，其誘導分化技術較成熟，獲取較方便、易分離培養(yǎng)，及免疫原性低等生物學特性，是組織工程骨較為理想的種子細胞。種子細胞[2-3]是組織工程骨研究的重點內容，組織工程骨中理想的種子細胞應具備以下幾個特性：①來源廣泛，取材方便，并能適應于臨床應用需要；②細胞本身增殖性強，穩(wěn)定性好，傳代培養(yǎng)后依舊有良好的成骨潛能；③種子細胞必須能夠與生物支架材料有較好的相互作用，且能在材料上迅速增殖；④細胞的免疫原性低，種植于宿體內不引起排斥反應，對宿體的毒性作用和致瘤性小，能適應宿體。本實驗采用全骨髓貼壁法從成年獼猴骨髓中獲取BMSCs，對其體外分離、培養(yǎng)，研究BMSCs的生長增殖特性及鑒定其向成骨細胞誘導分化的能力。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物為4只年齡4～6歲健康獼猴，體質量4.5～7kg，雌雄不限，購于中國科學院昆明動物研究所[生產許可證號：SCXK(滇）K2013-0005、使用許可證號：SYXK(滇）K2013-0012]，實驗過程中按3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑及耗材 低糖DMEM培養(yǎng)基（hyclone，批號：A163310）；胎牛血清（Gibco，批號：1676593）；雙抗溶液 (100×，hyclone，批號：L16132):10000units/mL青霉素和10000units/mL鏈霉素溶液；胰蛋白酶（0.25%Trypsin+0.02%EDTA，hyclone，批號：20160907）；細胞凍存液：低糖DMEM培養(yǎng)基/FBS/DMSO（二甲基亞砜，Amresco，批號：16300）按照 7：2：1 的比例分裝，－20℃保存，使用前 4℃解凍；PBS（hyclone，批號：2016165）；維生素 C(Sigma，批號:16003)；地塞米松(Sigma，批號：16787):3.9mg加入100mL無水酒精，0.2μm 濾膜過濾，分裝；β-甘油磷酸鈉(Sigma，批號：16357)：9.18g加入30mL三蒸水，0.2μm濾膜過濾，分裝；茜素紅（上海基爾頓生物，批號：163223）：茜素紅1g、蒸餾水90mL、1%氫氧化銨10mL混合，調整ph為6.3；抗壞血酸鈉（Sigma，批號：16689）：0.4g加入10mL 三蒸水，0.2μm濾膜過濾，分裝；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒（上海基爾頓生物,批號:161020）；GENMED 細胞馮庫薩（Von Kossa）染色試劑盒（上?；鶢栴D生物，批號：1607235）；CD105,CD44,CD34,CD45抗體，CY3標記二抗（Abcam，貨號：1617145、1617253、1617365、1617396、1617876）；二甲苯（國藥，批號:130207）；抗原修復液（無錫菩禾，批號:20160812）；4%多聚甲醛（國藥，批號:2016062）；3%H2O2/PBS（無錫菩禾，批號：160083）；0.01%Triton-X（無錫菩禾）；噻唑藍（MTT，Sigma，批號：2016081）。

1.3 主要器材 自動CO2溫控細胞培養(yǎng)箱（5060/BB16，美國Heraeus公司）；超凈細胞培養(yǎng)工作臺（SWCF-2FD，上海博訊有限公司）；高速離心機（5810R，Eppendorf公司）；倒置相差顯微鏡（DMI3000B，Leica公司）；熒光顯微鏡（IX71，Leica公司）；自動溫控水浴箱（h1210，Leica公司）；超低溫冰箱（991，F(xiàn)orma Scientific公司）；液氮罐（7403，F(xiàn)orma Scientific公司）；25cm2一次性培養(yǎng)皿、6孔板、24孔板、96孔板、凍存管（J00600、353072、353047、352046、5001-1020，上海諾辰生物技術有限公司）；移液器（3111000840，Eppendorf公司）；流式細胞儀（FACSCalibur，Becton Dickinson公司）；酶標儀（MK3型，Thermo公司）；細胞培養(yǎng)箱（8000，Thermo公司）；搖床（TS-1000，Qilinbeier公司）；光學顯微鏡（XDS-1A，上海嚴豐精密儀器有限公司）。

1.4 獼猴骨髓標本的采集 在中國科學院昆明動物研究所手術室進行骨髓標本的采集，無菌環(huán)境下將獼猴進行肌肉注射鹽酸氯胺酮（5mg·kg-1）麻醉，麻醉成功后固定于手術臺上，常規(guī)局部備皮、消毒皮膚和鋪消毒洞巾。取一側獼猴髂后上棘后上方約0.5cm處為穿刺點，術者左手拇指、食指固定穿刺部位皮膚，右手持骨髓穿刺針垂直刺入，當穿刺針接觸到骨質后左右旋轉，慢慢鉆入骨質當阻力消失是即達到骨髓腔，拔出針芯，連接無菌肝素化注射器，用適當力度緩慢抽吸，抽取骨髓10mL，緩慢加入含有肝素6000U的50mL無菌離心管中。采集結束后再次插入針芯，旋轉拔出穿刺針，局部再次消毒，用消毒紗布蓋在針孔上，再以膠布加壓包扎。

1.5 獼猴BMSCs原代細胞分離培養(yǎng) 用含肝素的注射器在無菌條件下抽取骨髓10～15mL；將細胞懸液按1:1比例加入到Percoll密度梯度離心(2000r/min,25min)；離心后小心吸出富含有核細胞的界面層，然后加PBS洗滌1～2次，再次離心，去除上清，用1mL培養(yǎng)液重懸細胞，培養(yǎng)液為內含10%FBS[添加青霉素、鏈霉素、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸和NaHCO3]，將此混懸液混勻并接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3d換液1次。待原代細胞融合達培養(yǎng)皿底部80%～90%以上時進行傳代。

1.6 獼猴BMSCs傳代培養(yǎng) 先用吸管吸去培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)液，PBS洗滌3次后，再加入1mL含有0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液，輕輕晃動使消化液蓋滿瓶底，至大多數(shù)細胞從皿底壁脫落，將其移入37℃孵化箱孵育，20min后，加入含有FBS的培養(yǎng)基1mL終止消化，形成均一的單細胞懸液，接種到另一培養(yǎng)皿，置于5%CO2、37℃飽和濕度箱中培養(yǎng)，隔天換液。取第3代傳代細胞進行實驗。

1.7 細胞生長曲線測定 分別取第1、3、6、9代獼猴BMSCs，按5×102個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每代BMSCs每天取4個相重復孔，加入0.5%MTT溶液20μL，在5%CO2，37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h；4h后棄去培養(yǎng)基，加入100μL二甲基亞砜，均勻搖晃。將酶標儀上的波長設定為570nm，將細胞懸液置入酶標儀測量光密度（optical density，OD）值。用MTT 法連續(xù)測定10d，以細胞生長時間(d)為橫坐標、OD值為縱坐標繪制BMSCs生長曲線。

1.8 獼猴BMSCs的成骨誘導培養(yǎng)及成骨分化潛能鑒定

1.8.1 獼猴BMSCs的成骨誘導培養(yǎng) 觀察第3代BMSCs在培養(yǎng)皿上長達皿底80%～90%融合時，以1×105個/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，加入配制好的成骨誘導培養(yǎng)液（10%FBS，0.1μmol·L-1地塞米松、10mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、50mg·L-1維生素 C、50μmol·L-1抗壞血酸鈉)，置于5%CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

1.8.2 細胞ALP染色 將加與不加成骨誘導液的第3代BMSCs，于培養(yǎng)的第3d、第7d和第14d進行ALP染色：先加入ALP固定液固定3min，水洗；然后在濕盒中滴加配置好的ALP孵育液，孵育15～20min，水洗；最后蘇木素染色液復染5～8min；水洗后鏡檢拍照。

1.8.3 細胞Von Kossa染色 將加與不加成骨誘導液的第3代BMSCs，于培養(yǎng)的第3d、第7d和第14d進行Von Kossa染色，吸干培養(yǎng)基后用丙酮固定30s，三蒸水漂洗2次，自然晾干；每孔根據(jù)Von Kossa染色試劑盒說明加入2mL新配制的5%硝酸銀溶液，均勻混合后置于暗室內避光30～60min；將培養(yǎng)皿中液體吸干再用雙蒸水反復沖洗3次，用5%的硫代硫酸鈉孵育2～3min；雙蒸水流水沖洗2min后用核固紅孵育5min；雙蒸水流水沖洗2min后盡快用無水酒精脫水后觀察拍照。

1.8.4 獼猴BMSCs流式細胞儀分析 鏡下觀察正常生長的第3代獼猴BMSCs細胞，等到細胞幾乎完全融合于培養(yǎng)皿底時，去除培養(yǎng)基；以PBS洗滌細胞層，再以含0.25%胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液浸泡5min，使細胞脫落，制成單細胞懸液，置于流式管中；調整待檢測細胞密度為1×106個/mL，取 200uL，在4℃下離心（1000r/min）5min；去除上清液，用 1mLPBS洗滌兩次，將細胞重懸于100uL PBS，孵育2h后檢測：收集細胞，1000r/min離心5min，去上清加1mL1%BSA/PBS緩沖液重懸細胞，再次離心棄上清；加1%BSA/PBS緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度到1×106/mL，取500μL至1.5mLEP管中，1000r/min離心5min，去上清；每管各加入4%多聚甲醛0.1mL固定30min，加1%BSA/PBS緩沖液洗滌細胞，1000r/min離心5min，去上清，重復3次；一抗4℃孵育1h；加1%BSA/PBS緩沖液洗滌細胞，1000r/min離心5min，去上清，洗滌3次；加Antimouse-CY3熒光二抗，4℃孵育1h，洗滌3次，置于冰上；調整合適的細胞濃度，上樣，流式細胞儀檢測。

2 實驗結果

2.1 獼猴BMSCs細胞形態(tài)的觀察 獼猴BMSCs原代細胞接種48h后首次換液，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)部分細胞貼壁，貼壁細胞形態(tài)多樣，分布不均勻，常見為圓形、短棒形及梭形等，部分呈巢狀聚集生長，細胞向四周延展，培養(yǎng)液中可見少量的透亮圓形血細胞，第4d貼壁細胞數(shù)量較多（圖1-A）。第7～9d貼壁細胞迅速增殖，9d左右細胞基本長滿。第1傳代細胞48h后細胞基本貼滿培養(yǎng)皿底，細胞形態(tài)趨于一致（圖1-B），72h后細胞呈漩渦樣排列（圖1-C）。第2代細胞生長情況與第一代基本類似，細胞生長增殖速度較快，3～4d基本可貼滿培養(yǎng)皿底，細胞多呈梭形，形態(tài)變化不明顯（圖1-D）。前5代細胞生長情況基本類似，第2～5代細胞生長增殖速度較第1代快；第6～9代的細胞增殖速度較慢，細胞形態(tài)出現(xiàn)三角形、長柱形等不規(guī)則形狀，細胞體積也較前5代大，第7代之后的細胞內可見空泡出現(xiàn)細胞凋亡比例增大。

2.2 獼猴BMSCs生長曲線 運用MTT法測量OD值繪制第 1、3、6、9代獼猴BMSCs生長曲線。細胞在開始培養(yǎng)時有2d左右的相對靜止期，第3代和第6代 BMSCs貼壁 3～6d增殖迅速，7d后進入平臺期,細胞增殖明顯減緩；第1代細胞及第9代細胞 1～3d增殖速度較第3、6代細胞慢，但進入對數(shù)生長期后第1代細胞增殖加快，第7d進入平臺期后細胞數(shù)量與第3、6代無明顯差別，而第9代細胞對數(shù)期較其他傳代細胞縮短，平臺期細胞數(shù)量也明顯低于其他三代（P＜0.05）。見圖 2。

圖1 倒置顯微鏡下獼猴BMSCs形態(tài)（100×）Fig.1 Morphological observation of BMSCs（100×）

圖2 獼猴BMSCs各代生長曲線Fig.2 The growth curve of cells at different generations

2.3 ALP染色 未進行成骨誘導的第3代獼猴BMSCs，在第3d、第7d和第14d時進行ALP染色，鏡下均未見紅色顆粒，ALP染色呈陰性。進行成骨誘導后的第3代獼猴BMSCs在誘導3d時進行ALP染色，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞中開始出現(xiàn)散在分布的紅色顆粒，已出現(xiàn)ALP染色的陽性指征；第7d鏡下發(fā)現(xiàn)細胞中紅色明顯增多，顏色逐漸加深，細胞多呈梭形，細胞間排列緊密；第14d鏡下發(fā)現(xiàn)紅色顏色最深。見圖3。

圖 3 BMSCs ALP染色結果（100×）Fig.3 BMSCs alkaline phosphatase staining results（100×）

2.4 Von Kossa染色 未進行成骨誘導的第3代獼猴BMSCs，不管在第3d、第7d和第14d時進行Von Kossa染色，鏡下未見黑色的礦化物沉積，Von Kossa染色呈陰性。進行成骨誘導的第3代獼猴BMSCs在第3d進行Von Kossa染鏡下也無黑色礦化結節(jié)；第7d染色后鏡下出現(xiàn)密集的黑色沉積樣結節(jié)，散裝分布，大小不均一，提示有鈣樣基質產生；第14d染色后鏡下黑色結節(jié)樣物質明顯增大，數(shù)量增多，顏色加深。見圖4。

圖 4 BMSCs Von Kossa染色結果（200×）Fig.4 BMSCs Von Kossa staining results（200×）

2.5 流式細胞術鑒定 經(jīng)流式細胞術分析正常生長的第3代獼猴BMSCs表面標志表達情況，測得CD44表達率為98.20%，CD105表達率為95.01%，呈強陽性；而CD34表達率為1.38%、CD45表達率分別為3.30%，呈陰性，符合間充質干細胞的鑒定結果。見圖5。

3 分 析與討論

圖5 流式細胞術分析結果Fig.5 Flow cytometry analysis results

近年來,隨著現(xiàn)代干細胞工程研究的發(fā)展，研究者們已成功地分離了大鼠、小鼠、兔、狗和牛的骨髓BMSCs,而人BMSCs的研究則成為學者們研究的重點。但是,由于生物醫(yī)用材料準許運用于人體內必須經(jīng)過嚴格的動物實驗的原因,使得目前人BMSCs在體內研究方面受到一定限制。獼猴是在進化中接近于人的靈長類動物,將其運用于組織工程研究能夠模擬人體的內部環(huán)境,為組織工程最終運用于臨床打下堅實的基礎。但是獼猴因價格昂貴，其BMSCs的分離技術的研究相對較少。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs的分離技術和方法主要有以下4種[4-5]：免疫磁珠法、流式細胞儀分離法、密度梯度離心法和全骨髓貼壁法。然而應用流式細胞儀分離法或免疫磁珠法,對實驗條件要求高,骨髓需求量大，分離過程會影響細胞的活性，甚至導致細胞完全失去活性[6]；而使用percol1分離液梯度離心的方法是將BMSCs和造血干細胞分離開來,但是其分離液存在一定的細胞毒性對細胞的活性有影響[7]。所以本實驗采用的是全骨髓貼壁培養(yǎng)法，是利用了BMSCs能貼壁生長而造血系干細胞不能貼壁生長的特性，再通過多次更換細胞培養(yǎng)液的方法將懸浮的造血細胞去除從而獲得骨髓間充質干細胞并對其進行BMSCs原代細胞的分離、培養(yǎng)和純化[8]。

實驗中對全骨髓貼壁分離法分離所得的BMSCs進行形態(tài)學觀察，結果顯示：獼猴原代BMSCs培養(yǎng)48h時出現(xiàn)貼壁，第7～10d貼壁細胞基本鋪滿培養(yǎng)皿，成熟的BMSCs細胞多呈梭型，多呈漩渦樣或魚群樣分布，且呈聚集生長的趨勢。以1:3比例傳代細胞的生長方式基本一致，其增殖的速度明顯高于原代細胞，培養(yǎng)3～4d可基本貼滿培養(yǎng)皿底部。第6代以后的BMSCs在多次的傳代實驗中發(fā)現(xiàn)：細胞的生長增殖速度明顯減緩，且細胞形態(tài)出現(xiàn)三角形、多邊形及不規(guī)則形，若繼續(xù)傳代培養(yǎng)，細胞內部則出現(xiàn)空泡狀，考慮細胞開始老化、凋亡。對細胞貼壁生長的形態(tài)學觀察情況分析，表明其與BMSCs的特性相符[9-10]。

流式細胞儀檢測結果顯示，CD44的表達率為98.20%、CD105的表達率為95.01%，均呈強陽性，而CD34的表達率為為1.38%、CD45的表達率為3.30%，均呈陰性。研究證實CD44作為鑒定BMSCs的表面抗原已得到較多的共識[11]；而CD105也已被證明同時存在于BMSCs和血管內皮細胞中，是人類內皮細胞增殖的最理想指示劑[12]；另外研究表明CD45和CD34均存在于造血系細胞中[13]。本實驗中CD45和CD34在BMSCs的分離培養(yǎng)中呈陰性，基本排除了造血干細胞及白細胞等對BMSCs的分離和提純的干擾。因此，流式細胞儀檢測結果表明其符合BMSCs的生物學特性。

ALP是成骨細胞的一種外酶，它的表達活性是成骨細胞分化的一個明顯特征[14]，其活性的高低可反映細胞的成骨分化能力[15]，也是鑒定成骨細胞的分化標志[16]，在BMSCs的體外鈣化中ALP起著關鍵作用，如果ALP失去活性，鈣化也將停止[17]。實驗中對第3代獼猴骨髓BMSCs進行成骨誘導后的第3d進行ALP染色，發(fā)現(xiàn)細胞中央出現(xiàn)散在分布的紅色顆粒，并且隨著誘導時間延長而增多顏色也逐漸加深；第14d鏡下發(fā)現(xiàn)紅色較前增多，且顏色也較前加深，結果表明定向誘導BMSCs后分化為成骨細胞及骨細胞。有研究指出，ALP最先出現(xiàn)在BMSCs中央，其生長受到中央細胞密集接觸的抑制，當BMSCs誘導分化后ALP的mRNA表達增高，12d達到頂峰[18]，與本實驗結果一致。Von Kossa染色是鑒定鈣結節(jié)的經(jīng)典方法，而鈣結節(jié)的形成為成骨細胞特有，故其成為鑒定成骨分化和確定細胞外基質礦化的產用方法，是利用了硝酸銀與鈣鹽的化學發(fā)應形成銀鹽，在強光或紫外光下生成可見的金屬銀，鈣沉積陽性的細胞呈黑色，并呈現(xiàn)粉紅色的細胞質和紅色的核[19-20]。本實驗結果顯示，未進行成骨誘導的第3代獼猴BMSCs，Von Kossa染色呈陰性，且不隨時間而改變；進行成骨誘導的第3代獼猴BMSCs在第7d Von Kossa染色后鏡下出現(xiàn)黑色沉積樣結節(jié)，呈散在分布、大小不一，提示有鈣樣基質產生；第14d Von Kossa染色后鏡下出現(xiàn)的黑色沉積結節(jié)樣物質較前明顯增大、數(shù)量增多、顏色加深。根據(jù)上述兩種染色方法的結果發(fā)現(xiàn)ALP出現(xiàn)較早，可以認為其對BMSCs成骨分化的敏感度較高，對BMSCs的成骨分化進行早期鑒定提供依據(jù)，而Von Kossa染色對成骨細胞具有相對特異性，因此，可以推測獼猴BMSCs在成骨誘導液的誘導下可以向成骨細胞方向分化，具有良好的成骨分化潛能。

4 結論

本實驗證實了全骨髓貼壁分離法可以分離培養(yǎng)純度較高的獼猴骨髓BMSCs，通過體外分離、培養(yǎng),觀察了BMSCs細胞體外的生長傳代方式及其生物學特性,并通過對獼猴BMSCs進行ALP染色及Von Kossa染色顯示了其具有良好的成骨分化潛能，證實了獼猴骨髓BMSCs是組織工程骨中理想的種子細胞，為下一步運用該細胞與三維打印制備高分子（二氧化鋯/羥基磷灰石）多孔支架材料共培養(yǎng)構新型建組織工程人工骨修復骨缺損研究奠定基礎[21]。

[1] Fridenstein A,Piatetskii S,Petrakova KV.Osteogenesis in transplants of bone marrow cells[J].Arkh Anat Gistol Embriol,1969,56(3):3-11.

[2] 馮萬文,萊浙軍,李小民,等.細胞和軟骨細胞共培養(yǎng)種子細胞特征及體內成軟骨活性[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008,12(3):442-446.FENG Wanwen,LAI Zhejun,LI Xiaomin,et al.Characteristics of co-culture of autogenic bone marrow mesenchymal stem cells with chondrocytes as seed cells and in vivo chondrogenic activity[J].ournal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research,2008,12(3):442-446.

[3] Ozdal-Kurt F,Tu lu I,Vatansever HS，et al.The effect of autologous bone marrow stromal cells differentiated on scaffolds for canine tibial bone reconstruction[J].Biotech Histochem,2015,90(7):516-528.

[4] Beeravolu N,McKee C,Alamri A,et al.Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta[J].J Vis Exp,2017,3(122):1-13.

[5] 馬釗,胡向東,費琦,等.家兔骨髓基質干細胞離心法分離培養(yǎng)和鑒定[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志,2015,12(16):1330-1332.MA Zhao,HU Xiangdong,FEI Qi,et al.Study on isolation and cultivation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells through gradient centrifugation[J].Journal of Clinical and Experimental Medicine，2015,12(16):1330-1332.

[6] Ferrin I,Beloqui I,Zabaleta L,et al.Isolation,Culture,andExpansion ofMesenchymalStem Cells[J].Methods Mol Biol,2017,190(21):177-190.

[7] Martin D,Xu J,Porretta C, et al.Neurocytometry:Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain[J].ACS Chem Neurosci,2017,8(2):356-367.

[8] Goldberg A,Mitchell K,Soans J,et al.The use of mesenchymal stem cells for cartilage repair and regeneration:a systematic review[J].Orthop Surg Res,2017,12(1):39.

[9] 汪群力,裴國獻,曾憲利,等.成年恒河猴骨髓基質干細胞的體外培養(yǎng)[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2004,6(7):12-14.WANG Qunli,PEI Guoxian,ZENG Xianli,et al.Culture of the BMSCs of adult rhesus in vitro[J].Chinese Journal of Orthopaedic Trauma,2004,6(7):12-14.

[10]佟雁翔,馮衛(wèi),蘇依拉其木格,等.骨髓基質干細胞體外定向誘導后表面MHC抗原的表達[J].中國組織工程研究,2015,15(32):5108-5112.TONG Yanxiang,FENG Wei,SUyilaqimuge,etal.MHC antigen expression on the surface of bone marrow stromal stem cells after directional induction in vitro[J].Chinese JournalofTissue Engineering Research,2015,15(32):5108-5112.

[11]De SC,Meyer E,Gr VDW,et al.Markers of stemness in equine mesenchymal stem cells:a plea for uniformity[J].Theriogenology,2011,75(8):1431-1443.

[12]Kern S,Eichler h,Stoeve J,et al.Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow,umbilical cord blood,or adipose tissue[J].Stem cells,2006,24(5):1594-1301.

[13]FAN Wenshuai,LI Jinghuan,WANG Yiming,et al.CD105 promotes chondrogenesis of synovium-derived mesenchymal stem cells through Smad2 signaling[J].Biochemical and biophysical research communications,2016,474(2):152.

[14]Deans RJ,Moseley AB.Mesenchymal stem cells:biology and potential clinical uses[J].Exp hematol,2000,28(8):875-884.

[15]張英,袁月,孫富麗.成骨細胞胞內胞外堿性磷酸酶含量比較[J].中國醫(yī)科大學學報,2011,40(10):874-876,884.ZHANG Ying,YUAN Yue,SUN Fuli.Comparison between the Extracellular and Intracellular Alkaline Phosphatase Level of the Primary Cultured Osteoblast Cells[J].Journal of China Medical University,2011,40(10):874-876,884.

[16]宋擇眾.通過檢測堿性磷酸酶和骨鈣素2的表達水平定量分析組織工程骨成骨影響因素[D].濟南：山東大學,2015:25-32.SONG Zezhong.Quantitative analysis of factors influencing tissue-engineered bone formation by detecting the expression levels of alkaline phosphatatase and bone-carboxyglutamate protein 2[D].JiNan,Shan Dong University,2015:25-32.

[17]Kruppke B,Farack J,Wagner AS3,et al.Gelatine modified monetite as abone substitute material:An in vitro assessment of bonebiocompatibility[J].Acta Biomater,2016,1(32):275-285.

[18]Mechiche Alami S,Gangloff SC,Laurent-Maquin D,et al.Concise Review:In Vitro Formation of Bone-Like Nodules Sheds Light on the Application of Stem Cells for Bone Regeneration[J].Stem Cells Transl Med,2016,5(11):1587-1593.

[19]孫崇然,劉恩重.Von Kossa染色的方法改進[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報,2006,40(1):70-71.SUN Chongran,LIU Enzhong.Improved method of von Kossa staining[J].Journal of Harbin Medical University,2006,40(1):70-71.

[20]Bonewald LF,Harris SE,Rosser J,et al.Von Kossa staining alone is not sufficient t to confirm that mineralization in vitro represents bone formation[J].Calcified Tissue International,May 2003,72(5):537-547.

[21]邵榮學,全仁夫,王拓,等.復合骨髓間質干細胞和BMP-2的HA/ZrO2泡沫陶瓷修復獼猴腰椎椎體缺損[J].中華骨科雜志,2016,36(19):1243-1253.SHAO Rongxue,QUAN Renfu,WANG Tuo,et al.Novel porous gradient HA/ZrO2 engineering bone carrying gelatin/chitosan slow-release hydrogel loading BMP-2 and BMSCs repair vertebra defect in rhesus macaque[J].Chinese Journal of Orthopaedics,2016,36(19):1243-1253.

Studies on the Extraction,Isolation,Culture and Biological Characteristics of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells(BMSCs)from Macaca Mulatta

QIU Rui,TANG Chengkun,SHAO Rongxue,et al Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]BMSCs were cultured in vitro and cultured in vitro.To study the growth and proliferation characteristics of osteoblasts.[Methods]The growth status of BMSCs was studied by whole bone marrow adherence method.The growth curve of BMSCs was observed and the growth curve was drawn by MTT method.The biological characteristics of BMSCs were identified by flow cytometry;In vitro osteogenic induction culture medium(containing 0.1umol·L-1dexamethasone,10mmol/ β -glycerophosphate,10%FBS,50umol·L-1sodium ascorbate,vitamin C 50mg·L-1),the cells were subjected to ALP,Von Kossa staining assay to identify their potential for osteogenesis induction.[Results]The original BMSCs of Rhesus monkey bone marrow were adhered for 48 hours,and the adherent cells were basically covered with Petri dishes from 7th to 10th day.The mature BMSCs cells were mostly shuttle type,mostly swirling or fish-like distribution and aggregated trend;The growth curve of monkey BMSCs showed that the cells had a relatively stationary phase of about 2 days at the beginning of culture,3 to 6 days of rapid growth,logarithmic growth,7 days later into the plateau,cell proliferation was slown down.Flow cytometry results showed:CD44 and CD105 expression was 98.20%and 95.01%respectively,was strongly positive,while the expression rates of CD34 and CD45 were 1.38%and 3.30%respectively;ALP staining was performed on the third day after osteogenesis of bone marrow BMSCs in the third generation.It was found that the red particles scattered in the center of the cells appeared and gradually increased with the prolongation of induction time.The results showed that BMSCs induced differentiation of osteoblasts and osteoblasts in osteoblasts,and the results showed that BMSCs could differentiate into osteoblasts and osteoblasts;Osteoblast-induced third-generation monkeys BMSCs,Von Kossa staining was negative and did not change with time;Osteogenic induction of the third generation of rhesus monkey BMSCs on the 7th day after Von Kossa staining showed black deposition-like nodules,scattered in the distribution of different sizes,suggesting that calcium-like matrix production;On the 14th day,Von Kossa stained with microscopic increased black nodular samples,and the number increased,the color was deepened.[Conclusion]BMSCs derived from bone marrow adherence method have strong ability to proliferate in vitro and can induce osteoblast differentiation in osteoblast inducer medium,and have good osteogenic differentiation potential.Rhesus monkey bone marrow source BMSCs is the ideal cell seed for bone tissue engineering.

bone marrow mesenchymal stem cells；cultured in vitro；cell biological feature;induced differentiation；osteoblasts;tissue engineering

R282

A

1005-5509（2017）11-0847-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.11.001

浙江省重大科技專項（2014C13SA190012）

Fund project:Great sci-tech special program in Zhejiang Province（2014C13SA190012）

全仁夫，E-mail：spinequan@yahoo.com

2017-05-17）