馮新軍，咸漠，劉會洲，趙廣

中國科學(xué)院生物基材料重點實驗室，中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，青島 266101

生物法合成3-羥基丙酸的研究進(jìn)展

馮新軍，咸漠，劉會洲，趙廣

中國科學(xué)院生物基材料重點實驗室，中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，青島 266101

3-羥基丙酸是一種重要的平臺化合物，應(yīng)用廣泛。生物法是實現(xiàn)高效合成3-羥基丙酸的重要手段，近年來發(fā)展迅速。針對3-羥基丙酸的天然合成途徑、工程合成途徑，特別是利用葡萄糖、甘油等廉價底物合成3-羥基丙酸的代謝工程進(jìn)展進(jìn)行了綜述和比較。同時，對生物法合成3-羥基丙酸的主要問題進(jìn)行了討論，并提出了解決相關(guān)問題的建議。另外，根據(jù)現(xiàn)階段的研究進(jìn)展，對3-羥基丙酸的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進(jìn)行了展望。

3-羥基丙酸；微生物發(fā)酵；葡萄糖；甘油；丙二酸單酰輔酶A

3-羥基丙酸（3-HP）是一種三碳非手性有機(jī)酸，分子式C3H6O3，擁有一個羧基和一個β位的羥基，呈糖漿狀，易溶于水、乙醇和乙醚[1]。3-HP與乳酸是同分異構(gòu)體，由于羥基位置的不同，與乳酸相比，其化學(xué)性質(zhì)更加活潑，易于通過不同的化學(xué)反應(yīng)來合成多種化工產(chǎn)品。例如，通過氧化、還原、脫水、環(huán)化等反應(yīng)分別可以得到丙二酸、1，3-丙二醇、丙烯酸、丙內(nèi)酯等產(chǎn)物，所得到的產(chǎn)物可以進(jìn)一步用于合成附加值更高的產(chǎn)品（圖1）。其中，1，3-丙二醇可以用做抗凍劑或者保護(hù)劑以及新型聚酯-聚對苯二甲酸丙二醇酯（PTT）的單體[2]，丙烯酸可以作為單體用于合成樹脂、合成纖維等的制造[3]。另外，3-HP及其酯化衍生物可以用于生物可降解塑料聚3-羥基丙酸[4]、聚3-羥基丙酸-co-3-羥基丁酸[5]等的合成，在替代傳統(tǒng)石油基塑料方面前景廣闊。由于3-HP顯著的市場價值和應(yīng)用前景，美國能源部在2004年將3-HP列為12種最具開發(fā)潛力的平臺化合物之一[6]。

3-HP可以通過化學(xué)合成法和生物合成法獲得。傳統(tǒng)的化學(xué)合成法主要是以β-丙內(nèi)酯、丙烯酸、β-羥基丙腈等為原料[7-8]，普遍存在原材料價格昂貴、毒性較大等缺陷。1，3-丙二醇、3 -羥基丙醛、丙烯醇等也可以被氧化得到3-HP，但是催化效率和選擇性較低[9]，仍然不能滿足工業(yè)化應(yīng)用的要求。在資源與環(huán)境的雙重壓力下，新型可持續(xù)的3-HP合成工藝亟待開發(fā)。生物合成法可以利用廉價的生物質(zhì)資源進(jìn)行生產(chǎn)，具有反應(yīng)條件溫和、操作簡單、副產(chǎn)物較少、綠色環(huán)保、生產(chǎn)成本較低等優(yōu)點。生物法合成3-HP已經(jīng)引起越來越多的興趣，近年來發(fā)展迅速，取得了一系列進(jìn)展。本文將針對生物法合成3-HP的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對生物法合成過程中的主要問題及建議進(jìn)行討論。

圖1 3-羥基丙酸的工業(yè)化應(yīng)用

1 3-羥基丙酸的天然合成途徑

早在20世紀(jì)60年代，人們就發(fā)現(xiàn)了能夠產(chǎn)3-HP的野生菌株。1968年，Harada課題組首次發(fā)現(xiàn)漢遜氏酵母Hansenula miso可以1，3-丙二醇為底物，氧化得到3-HP[10]；隨后又發(fā)現(xiàn)鐮刀霉菌Fusarium merismoides可 將 丙 酸 轉(zhuǎn) 化 為3-HP[11]。1982年，Hasegawa發(fā)現(xiàn)了同樣利用丙酸合成3-HP的褶皺假絲酵母Candida rugosa，產(chǎn)率可以達(dá)到89%[12]。1994年，Takamizaw等[13]從空氣中分離到能夠利用丙烯酸合成3-HP的絲衣霉Byssochlamys sp.菌株。以上研究只是發(fā)現(xiàn)了3-HP合成現(xiàn)象，并沒有深入地研究和解析相關(guān)微生物中的3-HP代謝途徑。

1986年，Holo等[14]發(fā)現(xiàn)橙色綠屈撓菌Chloro fl exus aurantiacus OK-70 fl 能夠以CO2為唯一碳源進(jìn)行自養(yǎng)生長，但是這個菌中沒有已知的卡爾文固碳途徑的關(guān)鍵酶。通過進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)3-羥基丙酸是Chloro fl exus aurantiacus固碳途徑的中間代謝物質(zhì)，并首次提出了固定CO2的3-羥基丙酸循環(huán)途徑[15]。在此之后，科研工作者通過持續(xù)深入的研究，逐步闡明了3-羥基循環(huán)途徑的各個關(guān)鍵酶和反應(yīng)機(jī)制[16-19]，并最終證明3-羥基丙酸固碳途徑是一個雙循環(huán)偶聯(lián)途徑[20]。

圖2 C. aurantiacus的3-羥基丙酸雙循環(huán)固碳途徑

3-羥基丙酸雙循環(huán)固碳途徑（圖2）的起始物質(zhì)是乙酰輔酶A。在第一個循環(huán)中，乙酰輔酶A首先與碳酸氫根反應(yīng)生成丙二酸單酰輔酶A，丙二酸單酰輔酶A在還原酶的作用下生成3-HP，3-HP經(jīng)過一系列酶的催化反應(yīng)，最終轉(zhuǎn)化為L-蘋果酰輔酶A，蘋果酰輔酶A進(jìn)一步裂解為乙醛酸和乙酰輔酶A，完成第一個循環(huán)。第一個循環(huán)所產(chǎn)生的乙醛酸與丙酰輔酶A反應(yīng)生成β- 甲基蘋果酰輔酶A，從而進(jìn)入第二個循環(huán)。β-甲基蘋果酰輔酶A經(jīng)過四步催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為丙酮酸和乙酰輔酶A，乙酰輔酶A再次進(jìn)入第一個循環(huán)中，實現(xiàn)兩個循環(huán)的偶聯(lián)。作為一種新類型的自養(yǎng)固碳途徑，3-羥基循環(huán)途徑具有與其他固碳途徑不同的鮮明特點和優(yōu)勢[20-24]。①途徑中涉及19步反應(yīng)，但只需13種酶，其中包括幾個多功能酶，例如雙功能酶丙二酸單酰輔酶A還原酶（malonyl-coenzyme A reductase，MCR）和三功能酶丙酰輔酶A合酶（propionyl-CoA synthase，PCS），這在其他的自養(yǎng)途徑中并不常見。多功能酶的存在，可以減少代謝壓力，提高代謝效率。②途徑中的酶反應(yīng)對O2不敏感，可以在好氧條件下進(jìn)行，與其他固碳途徑需要在厭氧環(huán)境中進(jìn)行相比，更易于實際操作，更利于工業(yè)化生產(chǎn)。③途徑中乙酰輔酶A羧化酶和丙酰輔酶A羧化酶是以HCO3-為底物，一個循環(huán)可以固定兩分子CO2，固碳效率更高。與直接以CO2為底物的固碳途徑相比，以HCO3-為底物更利于在發(fā)酵體系中進(jìn)行，更利于細(xì)胞的利用。④整個代謝途徑可以合成3-HP和丁二酸兩種中間物質(zhì)，這兩種物質(zhì)都是高附加值平臺化學(xué)品，應(yīng)用潛力和市場價值巨大。

除了在C. aurantiacus中發(fā)現(xiàn)3-羥基丙酸循環(huán)途徑外，在嗜酸熱菌Acidianus brierleyi、硫化葉菌Metallosphaera sedula等古生菌中也發(fā)現(xiàn)了類似的途徑[25-26]。除了個別關(guān)鍵酶的不同，古生菌的3-羥基丙酸合成途徑與C. aurantiacus基本一致，可以稱為經(jīng)過修飾的3-羥基丙酸循環(huán)途徑。最新研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一些營養(yǎng)缺乏的水環(huán)境中生長的微生物，如綠爬菌Chloroherpeton thalassium、赤桿菌Erythrobacter sp. NAP-1、硝化球菌Nitrococcus mobilis、海洋變形菌Congregibacter litoralis等都是通過類似于3-羥基丙酸循環(huán)的生物途徑來利用溶解于水中的微量有機(jī)物和CO2獲得營養(yǎng)[27]。

2 3-羥基丙酸的代謝工程途徑

利用野生菌株中存在的天然途徑合成3-HP，由于效率低下，很難實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)。通過構(gòu)建代謝工程途徑，實現(xiàn)以廉價碳源為原料高效合成3-HP成為主要趨勢。近年來，利用代謝工程途徑合成3-HP的研究取得了重要進(jìn)展，使用的起始碳源主要是葡萄糖、甘油等。

2.1 以葡萄糖為底物的途徑

美國嘉吉公司（Cargill）在2002年申請的專利中首次提出了以葡萄糖為底物合成3-HP的微生物途徑[28]。在前期的基礎(chǔ)上，嘉吉公司繼續(xù)深入研究，并提出了7條以葡萄糖為碳源合成3-HP的路線，根據(jù)主要中間產(chǎn)物的不同，可以分為四種：乳酸途徑、丙酸途徑、β-丙氨酸途徑和丙二酸單酰輔酶A途徑。隨后，吉諾瑪?shù)倏ü荆℅enomatica）和OPX生物技術(shù)公司（OPX Biotechnologies）又提出了以草酰乙酸為主要中間產(chǎn)物的3-HP合成路線（圖3）。

2.1.1 丙酸途徑

丙酸途徑是由存在于Actinobacillus sp.的琥珀酸途徑衍生而來[29]。1分子的葡萄糖理論上可以生成2分子的丙酸，丙酸在一個多功能酶丙酰輔酶A合成酶的作用下逐步轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A、丙烯酰輔酶A和3-羥基丙酰輔酶A，3-羥基丙酰輔酶A再通過3-羥基丙酰輔酶A水解酶的作用轉(zhuǎn)化為3-HP。該途徑使用的丙酰輔酶A合成酶來源于橙色綠屈撓菌Chloro fl exus aurantiacus，該酶將丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙烯酰輔酶A時效率較低，甚至有學(xué)者推測該反應(yīng)的逆反應(yīng)更加趨于不可逆。整個以丙酸為中間物質(zhì)合成3-HP的途徑，在熱力學(xué)上是不可行的，該途徑的吉布斯自由能高達(dá)79.6kJ/mol。同時，需要消耗額外的ATP，容易造成氧化還原失衡，不利于在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。

2.1.2 乳酸途徑

由丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸后，乳酸可以經(jīng)過四步反應(yīng)，最終得到3-羥基丙酸[29]。乳酸可以在輔酶A轉(zhuǎn)移酶和乳酰輔酶A脫水酶的作用下轉(zhuǎn)化為丙烯酰輔酶A，后者經(jīng)3-羥基丙酰輔酶A脫水酶和3-羥基丙酰輔酶A水解酶的作用生成3-羥基丙酸。在這個合成途徑中，乳酸到乳酰輔酶A的轉(zhuǎn)化需要消耗大量的輔酶A，容易造成微生物代謝失調(diào)。而乳酰輔酶A脫水酶屬于嚴(yán)格厭氧酶類，對氧氣十分敏感，嚴(yán)重制約了后期發(fā)酵條件的選擇。另外，乳酸和3-HP的平衡常數(shù)Keq為0.4，整個反應(yīng)的吉布斯自由能較大，理論上難以轉(zhuǎn)化。同時，作為同分異構(gòu)體，乳酸和3-HP在下游的分離回收過程中也會出現(xiàn)較大困難。

圖3 以葡萄糖為碳源合成3-HP的代謝途徑

2.1.3 β-丙氨酸途徑

嘉吉公司開發(fā)了多條以β-丙氨酸為中間物質(zhì)的3-HP合成路線[29-30]。其中兩條途徑（β-Ⅰ和β-Ⅱ）在熱力學(xué)上不可行的，而另外一條途徑則是可行的（途徑β-Ⅲ的吉布斯自由能為-32.2kJ/mol）。后一條途徑比前兩條途徑的催化步驟更短，而且在整個反應(yīng)過程中會產(chǎn)生1mol的ATP。β-丙氨酸是微生物體內(nèi)廣泛存在的代謝產(chǎn)物，以其為中間體合成3-HP，可以拓寬原料來源。但是，β-丙氨酸本身的合成路線比較復(fù)雜，容易造成代謝負(fù)擔(dān)，依賴該途徑合成3-HP的效率在很長時間內(nèi)處于較低水平。直到近幾年，Borodina等[31]在針對β-Ⅲ途徑進(jìn)行了一系列優(yōu)化，并在釀酒酵母中進(jìn)行重構(gòu)，使3-HP的產(chǎn)量達(dá)到了13.7g/L。

2.1.4 草酰乙酸途徑

由丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）可以得到草酰乙酸，草酰乙酸在脫羧酶或脫氫酶的作用下可以轉(zhuǎn)化為丙二酸半醛、蘋果酸或者丙二酰輔酶A，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為3-HP[32-33]。以上3條以草酰乙酸為中間體的途徑，在熱力學(xué)上都是可行的，同時會產(chǎn)生1mol的ATP，具有一定優(yōu)勢。但是，轉(zhuǎn)化草酰乙酸需要的脫羧酶和脫氫酶都是新型生物酶，在自然界不存在。想要實現(xiàn)以上途徑的高效合成，需要結(jié)合酶工程等手段，提高關(guān)鍵酶的選擇性和轉(zhuǎn)化效率。

2.1.5 丙二酸單酰輔酶A途徑

丙二酸單 酰輔酶A途徑[29]，是已知的以葡萄糖為碳源合成3-羥基丙酸的最短途徑：來源于葡萄糖的乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）的作用下生成丙二酸單酰輔酶A，丙二酸單 酰輔酶A在丙二酸單 酰輔酶A還原酶（malonyl-CoA reductase，MCR）作用下轉(zhuǎn)化為3-HP（圖4）。由乙酰輔酶A到3-HP，只需要兩個酶的催化作用即可實現(xiàn)。同時，整個過程在熱力學(xué)上是可行的，且合成1mol的3-HP會生成1mol的ATP。鑒于丙二酸單酰輔酶A途徑擁有多種優(yōu)勢，針對該途徑的研究成為3-HP合成領(lǐng)域的研究熱點（表1），主要開展的內(nèi)容包括加強(qiáng)3-HP代謝流、增強(qiáng)輔因子和能量供應(yīng)以及提高關(guān)鍵酶性能等方面。

圖4 丙二酸單酰輔酶A途徑合成3-HP及其主要代謝支路

表1 利用丙二酸單酰輔酶A途徑合成3-HP情況

丙二酸單酰輔酶A途徑是以 乙酰輔酶A為主要中間體逐步轉(zhuǎn)化而來，乙酰輔酶A作為微生物體內(nèi)的主要代謝中間體，可以轉(zhuǎn)化為乙酸、乙醇等各種代謝物質(zhì)。原則上，抑制乙酰輔酶A到其他產(chǎn)物的合成途徑，可以提高3-HP產(chǎn)量。Rathnasingh等[34]敲除了磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶PTA和乙酸激酶ACK，沒能實現(xiàn)3-HP產(chǎn)量的明顯提高。相反， Kildegaard等[43]通過過表達(dá)丙酮酸脫羧酶PDC、醛脫氫酶ALDH和乙酰輔酶A合成酶 ACS來加強(qiáng)乙酰輔酶A合成，使得3-HP的產(chǎn)量提高了80%。Chen等[40]將以上兩種策略進(jìn)行了結(jié)合，在抑制乙醛酸循環(huán)的基礎(chǔ)上，過表達(dá)了ALDH和ACS，3-HP的產(chǎn)量提高到原來的3倍。筆者所在研究團(tuán)隊通過敲除全局調(diào)控因子基因arcA來調(diào)控細(xì)胞代謝，在抑制乙酸合成的同時使3-HP的產(chǎn)量提高到原來的2倍[48]。

輔因子和能量供應(yīng)是影響酶反應(yīng)的重要因素。在該途徑中，ACC需要生物素和ATP維持酶活性，而MCR需要NADPH提供電子。ACC的羧化能力依賴于自身的生物素酰化，可以通過在發(fā)酵過程中添加外源的生物素，或者通過引入外源的生物素酰化酶來增強(qiáng)ACC的酶活，從而達(dá)到提高3-HP的目的[45]。Li等[41]從釀酒酵母中篩選到與ATP合成有關(guān)的酶TPI1和編碼質(zhì)子-ATP酶亞基的酶PMP1，單獨表達(dá)后都能引起3-HP產(chǎn)量的提升，升高幅度可以高達(dá)120%。從丙二酸單酰輔酶A出發(fā)，每生成1mol的3-HP就需要2mol的NADPH，需要大量的還原力。通過過表達(dá)與NADPH合成有關(guān)的酶，如吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶PNT、甘油醛3-磷酸脫氫酶GAPDH等來加強(qiáng)NADPH的合成，可以使 3-HP 的產(chǎn)量得到提高[34，43]。

關(guān)鍵酶的催化作用對于生物合成途徑的效率起到至關(guān)重要的作用。丙二酸單酰輔酶A途徑中起主要作用的酶是乙酰輔酶A羧化酶ACC和丙二酸單酰輔酶A還原酶MCR。為了加強(qiáng)酶的催化作用，最常用的手段是在胞內(nèi)進(jìn)行過表達(dá)。然而，有關(guān)研究證明，在E. coli體內(nèi)過表達(dá)自身的ACC后，細(xì)胞活性會受到抑制，相關(guān)機(jī)制尚不清晰[49]。Cheng等[36]嘗試將來源于Corynebacterium glutamicum的ACC在E. coli中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)酵36h后3-HP的產(chǎn)量達(dá)到了10.08g/L。Shi等[39]以Saccharomyces cerevisiae為研究對象，通過對自身的ACC1進(jìn)行點突變，使其活性得到增強(qiáng)，從而促進(jìn)了3-HP的合成。

丙二酸單酰輔酶A途徑使用的丙二酸單酰輔酶A還原酶MCR來源于C. aurantiacus，后者屬于嗜熱自養(yǎng)型細(xì)菌，導(dǎo)致MCR在57℃時才能發(fā)揮最佳酶活。當(dāng)MCR在工程菌株中表達(dá)時，受培養(yǎng)溫度和環(huán)境條件變化的影響，其活性被嚴(yán)重抑制，成為3-HP合成的限速酶。筆者所在研究團(tuán)隊通過對MCR的功能區(qū)域進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)MCR的N端（MCR-N）和C端（MCR-C）是兩個不同的功能區(qū)域，分別發(fā)揮不同的催化作用。MCR-C先將丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酸半醛，丙二酸半醛再被MCR-N還原而得到3-HP。將MCR的兩個功能區(qū)域拆分后，其酶活得到提高；在工程菌株中表達(dá)后，3-HP的產(chǎn)量也得到大幅度提高[35]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MCR-C端表達(dá)量及酶活均低于MCR-N，推測兩個結(jié)構(gòu)域的不平衡是導(dǎo)致MCR整體酶活較低的原因。通過定向進(jìn)化提高M(jìn)CR-C的酶活、通過染色體整合控制MCR-N的酶活，結(jié)合發(fā)酵條件的優(yōu)化，在分批補(bǔ)料水平，得到了40.6g/L的3-HP，是已知利用該途徑合成3-HP的最高水平[37]。一些科研工作者也嘗試使用其他來源的酶來合成3-HP。例如將來源于Sulfolobus tokodaii的丙二酸單酰輔酶還原酶和來源于Metallosphaera sedula的丙二酸半醛還原酶在藍(lán)藻Synechococcus elongatus內(nèi)表達(dá)，3-HP的產(chǎn)量高于直接利用全長的MCR，但是仍然處于毫克水平[46]。

2.2 以甘油為底物的途徑

近年來，生物柴油產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，煉制過程中會產(chǎn)生大量的甘油副產(chǎn)物，導(dǎo)致甘油成為價格低廉的碳源。甘油是一種還原性物質(zhì)，與葡萄糖等碳源相比，在轉(zhuǎn)化為丙酮酸時可以產(chǎn)生更多的還原力。同時，甘油和3-HP同為三碳化合物，到3-HP的轉(zhuǎn)化途徑也更短。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多種微生物，如Klebsiella、Lactobacillus、Citrobacter、Clostridium等都可以在厭氧環(huán)境下利用甘油生產(chǎn)3-HP。

2.2.1 甘油到3-HP的兩種途徑

甘油到3-HP的轉(zhuǎn)化途徑主要有兩條（圖5）：輔酶A依賴型途徑和非輔酶A依賴型途徑。兩個途徑都需要先利用依賴維生素B12（VB12）的甘油脫水酶輔酶A將甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛（3-HPA），不同之處在于3-HPA后面的轉(zhuǎn)化。輔酶A依賴型途徑主要存 在 于Salmonella enterica、Lactobacillus reuteri和Klebsiella pneumoniae中，甘油被甘油脫水酶轉(zhuǎn)化為3-羥基丙醛后，在1，3-丙二醇氧化還原酶、丙醛脫氫酶、磷酸轉(zhuǎn)酰酶、丙酸激酶的逐步催化下，最終生成3-HP，途徑復(fù)雜。輔酶A依賴型途徑被發(fā)現(xiàn)以來，研究較少。與輔酶A依賴型途徑相比，非輔酶A依賴型途徑可以利用不同來源的醛脫氫酶，只需要一步催化就可以實現(xiàn)3-HPA到3-HP的轉(zhuǎn)化，整個代謝過程不需要額外提供輔酶A。正是因為非輔酶A依賴型途徑的簡單高效，科研工作者們在E. coli、K. pneumoniae和其他一些菌株中利用該途徑進(jìn)行了一系列研究。

圖5 甘油到3-羥基丙酸的代謝途徑及主要支路

2.2.2 不同菌株利用甘油合成3-HP

（1）以E. coli為宿主合成3-HP

E. coli具有清楚的遺傳背景，所需營養(yǎng)條件簡單，已經(jīng)被廣泛用于各種高附加值化學(xué)品的合成。在合成3-羥基丙酸的問題上，E. coli存在一些劣勢，其本身沒有轉(zhuǎn)化甘油合成3-羥基丙醛的途徑，且不能合成甘油脫水酶的輔酶維生素B12（VB12）。所以，以E. coli為宿主利用甘油合成3-HP的研究（表2）主要集中在甘油脫水酶以及其激活因子的篩選方面，要實現(xiàn)3-HP合成的高產(chǎn)高效，同時需要抑制副產(chǎn)物的合成、對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化等。

以E. coli為宿主利用甘油合成3-HP的研究，主要來自于韓國釜山大學(xué)、首爾大學(xué)等機(jī)構(gòu)，已經(jīng)取得比較好的進(jìn)展。釜山大學(xué)Park課題組將來源于K. pneumoniae的甘油脫水酶D haB和E. coli的醛脫氫酶AldH在E. coli BL21中進(jìn)行表達(dá)，通過對pH、基質(zhì)濃度、誘導(dǎo)劑濃度、溶氧等條件的優(yōu)化，使3-HP的濃度達(dá)到31g/L[50]。將宿主更換為E . coli BL21（DE3），同時過表達(dá)K. pneumoniae的甘油脫水酶DhaB123及其激活因子GdrAB以及Azospirillum brasilense的醛脫氫酶KGSADH，3-HP的產(chǎn)量提高到38.7g/L[51]。通過比較9種不同的E. coli宿主細(xì)胞對3-HP的耐受性，篩選出E. coli W具有最佳性能并用于3-HP的生產(chǎn)，好氧條件下的產(chǎn)量可以達(dá)到41.5g/L[52]。首爾大學(xué)以E. coli star（DE3）為宿主，同時過表達(dá)L. brevis的甘油脫水酶DhaB、DhaR和Pseudomonas aeruginosa的醛脫氫酶AldH，并敲除副產(chǎn)物途徑基因glpK和yqhD，好氧分批補(bǔ)料發(fā)酵可以得到57.3g/L的3-HP，轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.88g/g[53]。三星高等研究院對來源于C. necator的醛脫氫酶GabD4進(jìn)行了點突變，將突變后的GabD4 _E209Q/E269Q與甘油脫水酶DhaB同時引入E. coli W3110，并對乙酸、乙醇合成關(guān)鍵酶基因ackA、pta、yqhD進(jìn)行敲除，在通氣為1vvM條件下，3-HP產(chǎn)量達(dá)到71.9g/L[54]，這是以E. coli為宿主利用甘油合成3-HP的最高產(chǎn)量。

（2）以K. pneumoniae為宿主合成3-HP

表2 以E. coli為宿主利用甘油合成3-HP主要情況

K. pneumoniae能夠以甘油為唯一碳源進(jìn)行生長代謝，與E. coli相比，具有更強(qiáng)的甘油同化能力，且其自身可以在厭氧或微氧條件下合成VB12，降低了生產(chǎn)成本（表3）。K. pneumoniae對甘油的代謝（圖5），主要分為氧化途徑和還原途徑。在還原途徑中，甘油先是被甘油脫水酶作用生成3-HPA，一部分3-HPA繼續(xù)被還原轉(zhuǎn)化為1，3-PDO，伴隨NAD+生成；還有一部分3-HPA則被氧化為3-HP，氧化3-HPA生成3-HP的酶是醛脫氫酶，這一過程伴隨NAD+的消耗。NAD+轉(zhuǎn)化的NADH可以被重新氧化為NAD+用于3-HP的合成，但是，氧氣存在時會影響VB12的合成，甘油脫水酶的活性也會被抑制，這種競爭關(guān)系成為3-HP合成的一個重要限制因素。

表3 K. pneumoniae與E. coli利用甘油合成3-HP的比較分析

以K. pneumoniae為宿主利用甘油合成3-HP的研究（表4），主要集中在不同關(guān)鍵酶的篩選、副產(chǎn)物合成基因的敲除、溶氧等條件對產(chǎn)物合成的影響等方面，且通常是對這幾個關(guān)鍵因素進(jìn)行組合優(yōu)化。韓國釜山大學(xué)的Sunghoon Park課題組通過在K. pneumoniae內(nèi)過表達(dá)自身的醛脫氫酶基因puuC、甘油脫水酶基因dhaB123及其激活因子gdrAB，同時敲除1，3-PDO氧化還原酶dhaT和yqhD，在5L發(fā)酵罐中維持溶氧在5%，通過分批補(bǔ)料發(fā)酵48h，最終得到了28g/L的3-HP[64]。華東理工大學(xué)的葉勤課題組對來源于Lactobacillus collinoides、Zymomonas mobilis、E. coli 和K. penumoniae的14種醛脫氫酶進(jìn)行比較，最終確定在K. pneumoniae內(nèi)過表達(dá)E.coli的脫氫酶AldH后3-HP的產(chǎn)量最高。經(jīng)過對溶氧的進(jìn)一步優(yōu)化，利用5L發(fā)酵罐，在通氣為1.5vvM的微氧條件下，3-HP的產(chǎn)量顯著提升，可以達(dá)到48.9g/L[65]。北京化工大學(xué)的田平芳課題組針對K.pneumoniae利用甘油合成3-HP進(jìn)行了大量研究，該課題組考察了來源于Bacillus subtilis、Pseudomonas sp. AIU 362和K. pneumoniae的醛脫氫酶對3-HP合成的影響，過表達(dá)Pseudomonas sp.的醛脫氫酶DhaS后，發(fā)酵24h可以得到18.5g/L的3-HP[66]。田平芳課題組還研究了不同啟動子對醛脫氫酶效率的影響，在使用IPTG誘導(dǎo)的tac啟動子的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步敲除了乳酸合成關(guān)鍵基因ldh1、ldh2和乙酸合成關(guān)鍵基因pta，結(jié)合發(fā)酵條件的優(yōu)化，發(fā)酵72h可以得到83.8 g/L的3-HP[67]。該產(chǎn)量是迄今公開報道的最高產(chǎn)量，對于3-HP的工業(yè)化發(fā)展具有重要意義。

表4 以K. pneumoniae為宿主利用甘油合成3-HP主要情況

（3）以其他菌株為宿主

除了K. pneumoniae和E.coli，其他一些微生物也被證明可以用來合成3-HP。如L. reuteri可以將甘油轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇，并通過CoA依賴型途徑合成3-HP，且可以合成VB12[85]。而S. blattae能夠?qū)⒏视娃D(zhuǎn)化為3-HPA，不需要額外添加VB12，但缺少醛脫氫酶，工程S. blattae菌株已經(jīng)被用于合成3-HP的聚合物[86]。Clostridium既可以利用純甘油，也可以利用粗甘油，含有依賴VB12的甘油脫水酶GDHt，而且GDHt對氧氣高度敏感，只有在完全厭氧條件下才能發(fā)揮作用。Paracoccus denitri fi cans可以在好氧條件下合成VB12，具有高效的NAD+再生途徑，引入K.pneumoniae的dhaB、gdrAB基因后可以得到3.4g/L的3-HP；加入CoCl2后，3-HP產(chǎn)量提高到4.3g/L；進(jìn)一步表達(dá)K. pneumoniae的puuC后，3-HP產(chǎn)量可以達(dá)到4.93g/L[87]。這些微生物都被證明可以利用甘油，其中一些甚至可以在好氧條件下合成VB12，具有一定優(yōu)勢。但是，遺傳背景尚不清晰，遺傳操作工具缺乏，現(xiàn)有3-HP的合成產(chǎn)量較低。

3 主要問題及建議

3.1 3-HPA及3-HP的毒性

以甘油為碳源能合成3-HP，首先要轉(zhuǎn)化為3-HPA，如果轉(zhuǎn)化不及時，會很容易導(dǎo)致3-HPA的積累。醛基基團(tuán)抑制DNA的復(fù)制，對細(xì)胞具有較大毒性，胞外的3-HPA濃度達(dá)到480mmol/L時，就會抑制細(xì)胞的生長[88]。有機(jī)酸可以通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，積累到一定程度后會引起細(xì)胞質(zhì)酸化，影響嘌呤堿基的合成、引起關(guān)鍵酶的變性，從而影響細(xì)胞活性[89]。3-HP和其它有機(jī)酸一樣，也會對細(xì)胞生長和代謝造成抑制。

可以從以下幾個方面消除或緩解產(chǎn)物的毒性。首先，可以從細(xì)胞的耐受性出發(fā)。通過兩階段培養(yǎng)方法，使用L. reuteri靜息細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)可以耐受更高濃度的3-HPA[90]。已經(jīng)有很多關(guān)于酸的耐受性方面的研究。例如，有研究發(fā)現(xiàn)在E. coli內(nèi)存在一個21個氨基酸的短肽sORF可以使細(xì)胞對3-HP的耐受性提高133%[91]。筆者所在團(tuán)隊通過差異蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了46個與3-HP耐受性相關(guān)的蛋白，將其中一些蛋白進(jìn)行過表達(dá)后，可以使3-HP的產(chǎn)量提高1倍以上[92]。其次，可以從代謝途徑的平衡出發(fā)。3-HPA的積累很大程度上是由于甘油脫水酶和醛脫氫酶的活性不平衡引起的，在一定程度上降低甘油脫水酶的活性，同時提高醛脫氫酶的活性，提高3-HPA到3-HP的轉(zhuǎn)化效率，也許會有助于緩解3-HPA的積累。另外，有學(xué)者提出可以利用氨基脲包埋3 -HPA的方法來緩解對細(xì)胞的毒性[93]。

3.2 氧化還原平衡

氧化還原平衡關(guān)系到細(xì)胞代謝的各個方面。在甘油合成3-HP的代謝途徑中，NAD+的再生系統(tǒng)需要氧氣供應(yīng)，而氧氣會抑制VB12的合成，如何調(diào)節(jié)氧氣供應(yīng)是一大難題。有學(xué)者從還原性物質(zhì)的添加出發(fā)，利用硝酸鹽和亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化來激活NAD+再生，從而提高了3-HP的產(chǎn)量[69]。另外，通過過表達(dá)NADH氧化酶/脫氫酶來加強(qiáng)NADH到NAD+的轉(zhuǎn)化，也是一種潛在的方法。但是，需要注意的是，NADH氧化酶/脫氫酶會受到胞內(nèi)ATP水平的影響。所以，在利用NADH氧化酶/脫氫酶來調(diào)控胞內(nèi)氧化還原平衡時，要同時調(diào)控胞內(nèi)ATP合成酶的活性。

3.3 VB12的供應(yīng)

VB12對于維持甘油脫水酶的活性至關(guān)重要，需要持續(xù)供應(yīng)。K. pneumoniae等細(xì)胞內(nèi)存在VB12的合成途徑，但對氧氣十分敏感，而氧氣是NAD+再生系統(tǒng)的必要元素。在具體發(fā)酵過程中，需要對發(fā)酵條件特別是溶氧進(jìn)行優(yōu)化，但是，單純的優(yōu)化需要耗費大量的人力和時間，獲得的效果也不盡如人意。P. denitri fi cans被發(fā)現(xiàn)可以在好氧條件下合成VB12，但該菌不存在3-HP合成途徑且遺傳背景不清晰，難以通過基因工程的方法實現(xiàn)3-HP的高效合成。有學(xué)者嘗試將P. denitrificans的VB12合成途徑在E. coli中進(jìn)行表達(dá)，但整個途徑需要25個酶，步驟繁瑣，難以調(diào)控，代謝壓力較大，產(chǎn)量較低[94]。

4 總結(jié)與展望

近幾年來，3-HP的生物合成研究發(fā)展迅速。在原料上，主要是以廉價的葡萄糖和甘油為碳源進(jìn)行發(fā)酵，甘油的價格隨著生物柴油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有望進(jìn)一步降低。隨著高效的生物質(zhì)預(yù)處理技術(shù)的發(fā)展，生物質(zhì)資源有望用于包括3-HP在內(nèi)的化學(xué)品的合成，可以進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。3-HP的生物合成途徑中，以葡萄糖為碳源的丙二酸單酰輔酶A途徑和以甘油為碳源的非CoA依賴型途徑最具前景。在具體的生產(chǎn)過程中，需要針對產(chǎn)物的耐受性、VB12的生物合成、氧化還原平衡、發(fā)酵條件以及副產(chǎn)物合成調(diào)控等方面展開深入研究，進(jìn)一步提高3-HP合成效率。同時，3-HP的高效分離技術(shù)也有待開發(fā)。大宗化學(xué)品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)對產(chǎn)量的要求是100g/L[95]，利用非CoA依賴型途徑合成3-HP的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到了83.8g/L，其產(chǎn)業(yè)化的實現(xiàn)已經(jīng)近在眼前。

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Recent Advances in Biosynthesis of 3-Hydroxypropionate

FENG Xinjun，XIAN Mo，LIU Huizhou，ZHAO Guang
CAS Key Laboratory of Biobased Materials, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266101, China

3-Hydroxypropionate（3-HP）is a valuable platform chemical with widespread application. Biosynthesis is an important method to achieve 3-HP production with high ef fi ciency, which has developed rapidly in recent years. This article provides an overview and the current status on biological production of 3-HP by different natural and recombinant pathways, especially the recent advances utilizing cheap carbon source as glucose and glycerol. The main present problems,some suggestions and future prospects of 3-HP industrialization are also discussed.

3-hydroxypropionate; microbial fermentation; glucose; glycerol; malonyl-CoA

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.06.005

趙廣，博士，中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所研究員，入選中科院“百人計劃”，獲國家自然基金委優(yōu)秀青年科學(xué)基金、山東省自然科學(xué)杰出青年基金資助。目前主要從事生物基材料和化學(xué)品研究，利用生物質(zhì)資源生產(chǎn)重要化學(xué)品，如異戊二烯、3-羥基丙酸及其聚酯等。E-mail：zhaoguang@qibebt.ac.cn

馮新軍，博士，助理研究員。主要研究方向為微生物工程，已發(fā)表SCI等文章10余篇，申請發(fā)明專利10余項。E-mail：fengxj@qibebt.ac.cn