嚴(yán)榮斌，玉桂成，陳劍成，吳 俊，龐永容，黃麗丹

(玉林市林業(yè)科學(xué)研究所,廣西 玉林 537501)

紫外線消毒和異噻唑啉酮?dú)⒍緦?duì)鐵皮石斛破損蒴果育苗效果的影響

嚴(yán)榮斌，玉桂成，陳劍成，吳 俊，龐永容，黃麗丹

(玉林市林業(yè)科學(xué)研究所,廣西 玉林 537501)

對(duì)鐵皮石斛正常蒴果和破損蒴果進(jìn)行常規(guī)消毒，破損蒴果紫外線0.5、1、1.5、2、3、10、24h消毒和紫外線1.0、1.5、2.0 h消毒、異噻唑啉酮10、15、20、30、40、50 mg·l-1濃度殺毒育苗試驗(yàn)，破損蒴果種子不經(jīng)紫外線消毒處理，直接在種子萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)，污染率為100 %；試驗(yàn)結(jié)果為，正常蒴果播種后20d萌發(fā)成原球莖，種子污染率為6.1 %，成活率為96.7 %；紫外線消毒時(shí)間0.5～24.0 h污染率為1.6%～97.2%，成活率為0～89.6%，隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)，成活率逐步下降；紫外線消毒0.5～24.0 h+異噻唑啉酮含量10～50 mg·l-1污染率為1.6%～97.2%，成活率為0～89.6%，隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)和異噻唑啉酮濃度升高，成活率逐步下降；異噻唑啉酮含量10 mg·l-1+紫外線消毒1.0 h成活率最高(89.6%)，是破損蒴果種子消毒較好條件，生產(chǎn)中也可選擇種子用紫外線燈消毒1～2h+異噻唑啉酮濃度15～40 mg·l-1作為抗菌劑。

鐵皮石斛；蒴果；紫外線消毒；異噻唑啉酮?dú)⒍?；育?/p>

鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)為蘭科多年生附生草本植物，具有重要的觀賞價(jià)值、藥用價(jià)值和食用價(jià)值[1]。目前，鐵皮石斛自然狀態(tài)下的無性分蘗繁殖和有性種子繁殖系數(shù)都很低，無法滿足工廠化育苗需求，只有通過組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行無性繁殖(如取根、莖、葉等器官組培繁殖)或是種子瓶播育苗，其中種子瓶播繁殖是目前工廠化育苗的最常用方式。鐵皮石斛種子瓶播育苗繁殖一般都是通過采收成熟的蒴果進(jìn)行表面消毒后，取出果內(nèi)無菌種子播種在萌芽培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)成原球莖，原球莖長(zhǎng)成1～3片小葉的小苗后，再通過移接到生根壯苗培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗和生根等步驟來組培擴(kuò)繁。鐵皮石斛種子播種時(shí)要求蒴果外表無破損才能進(jìn)行常規(guī)方法——液態(tài)消毒液消毒，而其為粉末狀且輕于水，破損后漂浮在消毒溶液上，按常規(guī)消毒方法無法從消毒液中取出大量種子、也無法完全清洗掉種子表面殘留的消毒液。本試驗(yàn)探討篩選能夠大量高效處理鐵皮石斛粉末狀種子的方法，達(dá)到即快速消毒鐵皮石斛種子且不影響種子瓶播后正常生長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

正常與破損的鐵皮石斛蒴果均為人工授粉所產(chǎn)，從廣西玉林市林科所鐵皮石斛大棚采集。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)種子紫外線消毒試驗(yàn)

設(shè)8個(gè)處理水平，即種子紫外線消毒時(shí)間設(shè)置為：0、0.5、1、1.5、2、3、10、24 h，對(duì)照2個(gè)，即CK1為完好蒴果常規(guī)消毒處理，接種在萌芽培養(yǎng)基；CK2為破損蒴果種子不采用紫外線消毒處理，直接接種到萌發(fā)培養(yǎng)基。每個(gè)處理3次重復(fù)。

紫外線燈消毒方法為將破損蒴果預(yù)處理、放入育苗容器，再將容器放置在實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)用的無菌操作臺(tái)上，打開紫外燈按試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間進(jìn)行消毒，風(fēng)速調(diào)至最低速檔位。把實(shí)驗(yàn)處理后的種子均勻撒播在萌發(fā)基質(zhì)上，瓶播育苗2～3周后，種子萌發(fā)成原球，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)成活率。

(2)含異噻唑啉酮成分的育苗基質(zhì)消毒試驗(yàn)

在種子紫外線消毒試驗(yàn)即試驗(yàn)一初步結(jié)論——單一使用紫外線消毒種子效果并不理想的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)試驗(yàn)二；試驗(yàn)二設(shè)2個(gè)因素，即種子紫外線消毒時(shí)間(因素1)和不同異噻唑啉酮濃度(因素2)，因素1設(shè)3個(gè)水平，即種子紫外線消毒中效果較好的3個(gè)消毒時(shí)間——1.0、1.5、2.0 h，因素2設(shè)6個(gè)處理水平 ，即異噻唑啉酮濃度為10、15、20、30、40、50 mg·l-1，對(duì)照為破損蒴果種子不采用紫外線消毒處理，接種含異噻唑啉酮萌發(fā)培養(yǎng)基；每個(gè)處理3次重復(fù)。

(3)不同消毒處理對(duì)種苗生長(zhǎng)的影響

待試驗(yàn)(1)和試驗(yàn)(2)所培育的幼苗生長(zhǎng)約3個(gè)月即原球莖已長(zhǎng)成合適移接的小苗時(shí)(CK2、CK3沒有育出幼苗)，轉(zhuǎn)移到專門的生根壯苗培養(yǎng)基[2]內(nèi)生長(zhǎng)，再經(jīng)過2個(gè)多月的生長(zhǎng)，測(cè)定其植株高度、根長(zhǎng)、根數(shù)等。

1.2.2 蒴果預(yù)處理

(1)破損蒴果

用棉花團(tuán)蘸取75%乙醇擦拭蒴果表面(避開蒴果開裂處)，待乙醇自然揮發(fā)后，打開蒴果，取粉末狀種子均勻地鋪開在育苗容器內(nèi)。

(2)正常蒴果

使用75 %乙醇消毒1分鐘洗凈再用0.1 %氯化汞消毒30 min后用無菌水洗凈五遍，剖開蒴果，取出粉狀種子接種不含抗菌成分的種子萌發(fā)培養(yǎng)基。

1.2.3 發(fā)芽培養(yǎng)條件 種子萌發(fā)培養(yǎng)基：MS+NAA0.5 mg·l-1+蔗糖30 g·l-1+瓊脂粉7.2 g·l-1；培養(yǎng)溫度控制在20～27℃，光照培養(yǎng)時(shí)間：12h·d-1，光照強(qiáng)度：1000～2000 lux。

1.2.4 污染率及種子發(fā)芽率調(diào)查 鐵皮石斛種子萌發(fā)后，經(jīng)過20天左右萌發(fā)生長(zhǎng)成原球莖，統(tǒng)計(jì)種子的成活率和污染率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒴果狀況對(duì)種子發(fā)芽的影響

試驗(yàn)結(jié)果為，正常蒴果播種后20 d萌發(fā)成原球莖，種子污染率為6.1%，成活率為96.7%；破損蒴果種子進(jìn)行常規(guī)消毒時(shí)，漂浮在消毒溶液表面，取出十分困難，故不宜采用常規(guī)消毒；破損蒴果種子不經(jīng)紫外線消毒處理，直接在種子萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)，污染率為100%。表明鐵皮石斛正常蒴果經(jīng)過常規(guī)消毒就可以在適宜培養(yǎng)條件下播種育苗，破損的蒴果采取常規(guī)方法不能消毒，且不經(jīng)紫外線消毒處理也不能正常進(jìn)行播種育苗。

2.2 紫外線消毒對(duì)破損種子發(fā)芽的影響

由表1可知，隨著紫外線消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，鐵皮石斛破損種子污染率逐步下降，同時(shí)，紫外線消毒時(shí)間為0.5 h時(shí)，成活率最高，為95.6%，之后隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)，成活率逐步下降，表明紫外線不僅對(duì)鐵皮石斛破損種子表面等處的致病微生物有毒殺作用，也會(huì)對(duì)種子的活力造成一定傷害。

表1 紫外線消毒時(shí)間效果

2.3基質(zhì)不同異噻唑啉酮濃度對(duì)破損種子發(fā)芽的影響

表2顯示，當(dāng)紫外線消毒時(shí)間為1.0～2.0 h、異噻唑啉酮濃度為10～50 mg·l-1時(shí)，破損的鐵皮石斛種子在萌發(fā)培養(yǎng)基上的污染率為0～23.1%，種子成活率為3.8%～89.6%，且當(dāng)紫外線消毒時(shí)間一定隨異噻唑啉酮濃度的增加，或當(dāng)異噻唑啉酮濃度一定隨紫外線消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率和成活率都逐步降低；只有采取紫外線消毒和異噻唑啉酮消毒結(jié)合的條件下，破損鐵皮石斛種子才能取得較好的育苗結(jié)果；異噻唑啉酮濃度為10 mg·l-1、紫外線消毒1.0h時(shí)，種子成活率最高，是破損鐵皮石斛種子的最適宜育苗環(huán)境。

表2 紫外線消毒的種子接種在含不同異噻唑啉酮含量的培養(yǎng)基效果

2.4 不同消毒方式對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)(1)和試驗(yàn)(2)所培育的幼苗經(jīng)2個(gè)月左右生長(zhǎng)，植株高度為3～5 cm左右，生根量為4～6根，根長(zhǎng)2～3 cm,不同處理之間差異不明顯，說明紫外線消毒和加入異噻唑啉酮對(duì)鐵皮石斛種子發(fā)育成原球莖的生長(zhǎng)沒有影響。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果為正常蒴果播種后20 d萌發(fā)成原球莖，種子污染率為6.1%，成活率為96.7%；破損蒴果種子不經(jīng)紫外線消毒處理，直接在種子萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)，污染率為100%。鐵皮石斛正常蒴果經(jīng)過常規(guī)消毒就可以在適宜培養(yǎng)條件下播種育苗，破損的蒴果采取常規(guī)方法不能消毒且不經(jīng)紫外線消毒處理也不能正常播種育苗。紫外線消毒0.5～24.0 h+異噻唑啉酮含量10～50 mg·l-1污染率為1.6%～97.2%，成活率為0～89.6%，隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)，成活率逐步下降；異噻唑啉酮含量10 mg·l-1、紫外線消毒1.0 h成活率最高(89.6%)，是破損蒴果種子消毒較好條件，生產(chǎn)中可以選擇種子用紫外線燈消毒1～2 h、異噻唑啉酮濃度15～40 mg·l-1作為抗菌劑，效果也不錯(cuò)。不同消毒處理培育的鐵皮石斛幼苗在植株高度和根系數(shù)量及長(zhǎng)度方面無顯著差異。

紫外線對(duì)細(xì)菌、病毒的去氧核糖核酸(DNA)及核醣核酸(RNA)具有強(qiáng)大破壞力，能使細(xì)菌、病毒喪失生存力及繁殖力進(jìn)而消滅細(xì)菌、病毒，達(dá)到消毒滅菌[3,4]。異噻唑啉酮通過斷開細(xì)菌蛋白質(zhì)的鍵而起殺生作用，對(duì)常見細(xì)菌、真菌、藻類等具有很強(qiáng)的抑制和殺滅作用[5]，具有高溫易降解，低毒、低殘留等特點(diǎn)[6]，紫外線消毒與異噻唑啉酮?dú)⒍緝烧呓Y(jié)合使用才能達(dá)到滿足生產(chǎn)要求。1個(gè)鐵皮石斛蒴果內(nèi)種子多達(dá)10萬以上，如果容器不夠大，可以分1～2次消毒，如果蒴果破損嚴(yán)重，可以省去酒精擦拭蒴果表面的步驟，并同時(shí)在一個(gè)容器中消毒幾顆破損嚴(yán)重的蒴果。

[1] 吉占和.中國(guó)植物志[M].北京.科學(xué)出版社,19995.

[2] 梁鈞淞,玉桂成,陳劍成，等.鐵皮石斛的雜交育種方法：中國(guó), CN102388797A[P].2012-03-28.

[3] 耿文奎,王樹聲.實(shí)用消毒技術(shù)[M].南寧：廣西科學(xué)出版社,1996.

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EffectofUVDisinfectionandIsothiazoloneinDendrobiumcandidumCapsuleonDamagedTissueCulture

YAN Rong-bin, YU Gui-chen, CHEN Jian-cheng,WU Jun, PANG Yong-rong, HUANG Li-dan

(YulinForestryResearchInstitute,Yulin,Shaanxi537501)

Before culture,Dendrobiumcandidumcapsules intact or broken were pre-treated for disinfection with ultraviolet light for 0.5h, 1h, 1.5h, 2.0h,3.0h, 10h, and 24h, or 1.0h,1.5h, and 2.0h, and with isothiazolone at 10,15,20,30,40 and 50 mg-1, respectively.The contrast is without pretreatment of ultraviolet light. The result showed that the seeds without pretreatment for culture, the infection rate were 100%. Normal seeds could germinate 20days after sowing, with infection rate at 6.1% and survival rate at 96.7%. For the seeds with UV treatment from 0.5 to 24h, infection rates ranged from 1.6% to 97.2% and survival rate from 0 to 89.6%, indicating a trend of lower survival rate with longer treatments. With UV treatments 0 to 24h plus use of isothiazolone concentrations ranging from 10 mg·l-1, infection rates ranged from 1.6% to 97.2% and survival rates from 0 to 89.6%, indicating a trend of lower survival rates with longer UV treatment and higher concentrations of isothiazolone. The optimum treatments for broken seeds ofDendrobiumcandidumwere isothiazolone at 10 mg·l-1and UV treatment for 1.0h, which could have a survival rate 89.6%.In practice, treatment of seeds can be UV for 1 to 2h plus isothiazolone at concentrations from 15 to 40 mg·l-1.

UV disinfection; isothiazolone;Dendrobiumcandidum; damaged; capsule; tissue culture

2017-04-19

嚴(yán)榮斌(1985-)，男，助理工程師，廣西梧州人，主要從事林木組織培養(yǎng)和林木遺傳育種研究。

Q813.1

A

1001-2117(2017)04-0001-03