呼海燕 劉彩宏

白藜蘆醇減輕LPS誘導的牙周膜細胞損傷并抑制TLR4/NF-κB活化

呼海燕 劉彩宏

目的探究白藜蘆醇(RES)對脂多糖(LPS)誘導的人牙周膜細胞(hPDLCs)損傷的保護作用。方法體外培養(yǎng)并鑒定hPDLCs，將培養(yǎng)的hPDLCs隨機分為5組：對照組、LPS(10 μg/ml)+RES(0、 30、 60、 90 μmol/L)組，MTT法檢測各組細胞增殖能力，ELISA檢測各組細胞分泌TNF-α/IL-6水平，PCR和Western blot檢測各組細胞TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表達。結(jié)果分離培養(yǎng)的hPDLCs抗波絲蛋白表達陽性，抗角蛋白表達陰性。與對照組比，LPS處理后細胞增殖能力明顯降低，細胞分泌TNF-α/IL-6水平和TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表達明顯增加； 30～90 μmol/L白藜蘆醇預處理后，細胞增殖能力增加(Plt;0.05)，細胞分泌TNF-α/IL-6水平、TLR4/NF-κB mRNA以及蛋白表達則下調(diào)(Plt;0.05)，均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。結(jié)論白藜蘆醇可抑制TLR4/NF-κB活化并減輕LPS誘導的牙周膜細胞損傷。

白藜蘆醇； LPS； 人牙周膜細胞(hPDLCs)； TLR4； NF-κB

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌的致病因子，它能誘導牙周膜細胞產(chǎn)生炎癥因子，進而導致牙周疾病的發(fā)生[1]。白藜蘆醇(resveratrol，RES)是一種天然抗氧化劑，具有抗腫瘤、抗炎等活性[2]，但其在牙周疾病免疫炎癥中的報道相對較少，因此，本研究選擇人牙周膜細胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs)進行體外分離培養(yǎng)，分別通過MTT、ELISA、PCR、Western blot等方法，檢測細胞增殖能力，炎性因子分泌和TLR4/NF-κB表達等變化，以探究RES對LPS誘導的hPDLCs損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Gemini)；兔抗人Toll樣受體4(Toll like receptors 4，TLR4)多克隆抗體，兔抗人NF-κB p65多克隆抗體(Sigma)；ELISA試劑盒(TNF-α，IL-6)、抗細胞波絲蛋白多克隆抗體、抗細胞角蛋白多克隆抗體、免疫組化染色試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)公司)；酶標儀(Bio-Rad)。

1.2 實驗方法

1.2.1 hPDLCs的原代培養(yǎng) 取延安大學附屬醫(yī)院口腔修復科10～15 歲因正畸需要拔除的10 顆健康牙齒，已征得患者本人和家屬的同意。牙離體之后，迅速用含有雙抗的磷酸緩沖溶液PBS沖洗，置于DMEM培養(yǎng)液(含雙抗、10% FBS)中，用雙抗液漂洗后，經(jīng)不含血清的完全培養(yǎng)液的潤濕，用手術(shù)刀刮取牙根中1/3的牙周膜。將牙周膜組織剪成1 mm×1 mm×1 mm，均勻鋪在25 ml的培養(yǎng)瓶中，加入DMEM 培養(yǎng)液，在37 ℃，5% CO2下培養(yǎng)4 h后翻瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液，取3～6 代細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 免疫細胞化學染色鑒定hPDLCs 取第3代hPDLCs爬片培養(yǎng)，當細胞覆蓋至60%左右時，用4%甲醛溶液固定，角蛋白與波形絲蛋白染色，光鏡下觀察。

1.2.3 繪制hPDLCs生長曲線 取第3 代對數(shù)生長期的hPDLCs，接種至96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后使其貼壁，在培養(yǎng)1～7 d之后分別檢測其細胞活性。每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，孵育4 h，吸去上清，加入100 μl DMSO，振蕩后，酶標儀檢測吸光度值(A490)，記錄結(jié)果，并繪制生長曲線。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖活性 取第3代對數(shù)生長期的hPDLCs，接種至96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，加入不同處理的培養(yǎng)基，各濃度設(shè)置5 個復孔，分為對照組、LPS組、LPS(10 μg/ml)+RES組(0、 30、 60、 90 μmol/L)，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h，棄上清液，加入100 μl DMSO，振蕩并檢測吸光度值(A490)。

1.2.5 ELISA檢測細胞TNF-α/IL-6分泌水平 取第4代對數(shù)生長期的hPDLCs，接種于24 孔培養(yǎng)板，按上述分組處理細胞，培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書檢測各組中TNF-α和IL-6的水平。

1.2.6 PCR檢測TLR4/NF-κB mRNA表達 取第4代對數(shù)生長期的hPDLCs，接種于6孔培養(yǎng)板，按上述分組處理細胞。培養(yǎng)24 h后，Trizol法提取細胞總RNA，并檢測其純度以及完整性。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，并進行PCR檢測，2%～3%瓊脂糖凝膠上電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.7 Western blot檢測TLR4/NF-κB蛋白表達 選取第4代對數(shù)生長期細胞，參照上述實驗處理細胞，24 h后，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TLR4 (1∶500)、NF-κB p65 (1∶400)、β-actin (1∶1 000)等一抗， 4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3 次，二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3 次，暗室曝光和壓片等步驟，檢測TLR4和NF-κB蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，Plt;0.05為差異為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 hPDLCs原代培養(yǎng)及鑒定

組織塊法培養(yǎng)5～8 d之后可見細胞游出，hPDLCs原代細胞呈現(xiàn)星形或長梭形，胞突細長，胞體豐滿，核為圓形或橢圓形，傳代培養(yǎng)后細胞生長迅速(圖 1A)。將第3 代hPDLCs細胞在96 孔板中培養(yǎng)1～7 d， MTT法檢測其在4～5 d細胞快速增殖，并在第7 天后速度開始減緩，其生長曲線呈“S”形(圖 1B)。免疫細胞化學染色鑒定表明，抗波絲蛋白染色呈陽性(圖1C)，抗角蛋白染色呈陰性(圖 1D)，證明細胞來源于中胚層，且無上皮來源細胞混雜。

2.2 RES抑制LPS誘導的hPDLCs活性降低

與對照組比較，LPS處理下，hPDLCs細胞活性明顯降低。而隨著RES濃度增加，細胞活性逐漸增強(Plt;0.05)(圖 2)。

A: 第4 代細胞形態(tài)(×200)； B: 生長曲線; C: 波絲蛋白表達(×100)； D: 角蛋白表達(×100)

圖 2 LPS和不同濃度RES對細胞增殖活性的影響

Fig 2 Proliferation of hPDLCs treated by LPS and RES(#:vscontrol,Plt;0.05; *vsLPS group,Plt;0.05)

2.3 RES抑制LPS誘導的hPDLCs TNF-α/IL-6分泌增加

ELISA結(jié)果顯示，LPS明顯促進細胞炎性因子TNF-α和IL-6分泌，而RES對hPDLCs細胞TNF-α/IL-6分泌具有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴效應(yīng)(Plt;0.05)(圖 3)。

圖 3 LPS和RES對細胞TNF-α/IL-6分泌水平的影響

Fig 3 TNF-α and IL-6 levels of hPDLCs treated by LPS and RES(#:vscontrol,Plt;0.05; *:vsLPS group,Plt;0.05)

圖 4 LPS和RES對細胞TLR4/NF-κB mRNA表達的影響

Fig 4 TLR4/NF-κB mRNA expression of hPDLCs treated by LPS and RES(#:vscontrol,Plt;0.05; *:vsLPS group,Plt;0.05)

2.4 RES抑制LPS誘導的hPDLCs中TLR4/NF-κB表達上調(diào)

PCR結(jié)果顯示，引物特異性良好。LPS作用下，細胞TLR4與NF-κB mRNA水平均明顯增加，而不同濃度RES預處理下，TLR4與NF-κB mRNA的水平均顯著降低(Plt;0.05)(圖 4～5)。

Western blot結(jié)果顯示，LPS作用下，細胞TLR4與NF-κB蛋白表達顯著升高(Plt;0.01)，而不同濃度RES預處理下，TLR4和NF-κB p65蛋白的表達均顯著下降，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性(Plt;0.05)。

圖 5 LPS和RES對細胞TLR4/NF-κB p65蛋白表達的影響

Fig 5 TLR4/NF-κB expression of hPDLCs treated by LPS and RES(#:vscontrol,Plt;0.05; *:vsLPS group,Plt;0.05)

3 討 論

LPS作為革蘭陰性厭氧菌中的一種致病物質(zhì)，對牙周組織細胞具有很強的毒性作用[3]，被認為是牙周炎癥的重要病因之一。研究表明，LPS對hPDLCs具有細胞毒性作用。本研究顯示，LPS作用下，hPDLCs活性明顯下降。

RES是一種多酚類化合物，作為腫瘤的化學預防劑，它也是預防和治療動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的活性物質(zhì)。近年來，國內(nèi)外關(guān)于白藜蘆醇在一些疾病中抗炎活性也有報道[4-5]。有研究顯示，RES(50 μmol/L)時能促進人軟骨細胞的增殖[4]。本研究表明，在LPS誘導損傷的hPDLCs中加入RES處理后，其細胞活性明顯增加，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

研究表明，TLR4是模式識別受體的一種，在機體免疫與炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能激活細胞內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)信號通路[6]。NF-κB作為TLR4信號通路的下游因子，調(diào)控著多種細胞因子的表達，在炎癥損傷和細胞再生方面均有重要作用[7]。TLR4下游因子NF-κB被激活之后，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6的釋放[8]。TNF-α是促進牙周炎發(fā)生的重要炎性因子，它能限制牙周組織的修復[9]。研究表明，在牙周膜細胞中，RES有效抑制了損傷細胞中炎性因子IL-1β，IL-6和TNF-α的表達[10]。本研究顯示，RES可明顯抑制LPS誘導的TNF-α與IL-6水平升高。

Murakami等[11]研究表明，RES有較強的抗自由基活性，并能抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的巨噬細胞中NF-κB的活化。臨床研究顯示，慢性牙周炎患者的牙齦組織中TLR4的表達高于健康人[12]，這提示我們TLR4/NF-κB通路可能與牙周炎癥密切相關(guān)。本研究亦證實，RES可顯著降低LPS誘導的hPDLCs TLR4/NF-κB mRNA和蛋白的表達。

綜上所述，本文通過LPS和不同濃度RES作用，檢測了hPDLCs增殖活性，炎性因子TNF-α/IL-6的分泌和TLR4/NF-κB的表達，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過抑制TLR4/NF-κB活化減輕LPS誘導的牙周膜細胞損傷。此外，牙周膜細胞炎癥因子的表達是受很多機制調(diào)控的，多條信號通路都可能參與其中，各信號通路之間還可能存在相互作用，本實驗結(jié)果提示，TLR4/NF-κB 信號通路參與了白藜蘆醇抑制脂多糖誘導的牙周膜細胞炎癥因子表達的過程，但其具體機制還需進一步研究。

[1] G?lz L, Memmert S, Rath-Deschner B, et al. Hypoxia andP.gingivalissynergistically induce HIF-1 and NF-κB activation in PDL cells and periodontal diseases[J]. Mediators Inflamm, 2015, 2015: 438085.

[2] 吳明珠, 郭俊明. 白藜蘆醇及其衍生物抗炎藥理作用研究進展[J]. 畜牧與飼料科學, 2011,32(12):74-75.

[3] Kato H, Taguchi Y, Tominaga K, et al. Porphyromonas gingivalis LPS inhibits osteoblastic differentiation and promotes pro-inflammatory cytokine production in human periodontal ligament stem cells[J]. Arch Oral Biol, 2014, 59(2):167-175.

[4] Andrade JM, Paraíso AF, de Oliveira MV， et al. Resveratrol attenuates hepatic steatosis in high-fat fed mice by decreasing lipogenesis and inflammation[J]. Nutrition, 2014, 30(7-8):915-919.

[5] Csaki C, Keshishzadeh N, Fischer K, et al. Regulation of inflammation signalling by resveratrol in human chondrocytesinvitro[J]. Biochem Pharmacol, 2008, 75(3):677-687.

[6] Tang L,Zhou XD,Wang Q, et al. Expression of TRAF6 and pro-inflammatory cytokines through activation of TLR2, TLR4, NOD1, and NOD2 in human periodontal ligament fibroblasts[J]. Arch Oral Biol, 2011, 56(10):1064-1072.

[7] Lisboa RA,Andrade MV, Cunha-Melo JR. Toll-like receptor activation and mechanical force stimulation promote the secretion of matrix metalloproteinases 1, 3 and 10 of human periodontal fibroblasts via p38, JNK and NF-kB[J]. Arch Oral Biol, 2013, 58(6):731-739.

[8] Chi XP, Ouyang XY, Wang YX. Hydrogen sulfide synergistically upregulates Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide-induced expression of IL-6 and IL-8 via NF-κB signalling in periodontal fibroblasts[J]. Arch Oral Biol, 2014, 59(9):954-961.

[9] Liu W, Konermann A, Guo T, et al. Canonical Wnt signaling differently modulates osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and from periodontal ligament under inflammatory conditions[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1840(3):1125-1134.

[10]Rizzo A, Bevilacqua N, Guida L, et al. Effect of resveratrol and modulation of cytokine production on human periodontal ligament cells[J]. Cytokine, 2012, 60(1):197-204.

[11]Murakami Y, Kawata A, Ito S, et al. The Radical Scavenging Activity and Cytotoxicity of Resveratrol, Orcinol and 4-Allylphenol and their Inhibitory Effects on Cox-2 Gene Expression and Nf-κb Activation in RAW264.7 Cells Stimulated with Porphyromonas gingivalis-fimbriae[J]. In Vivo, 2015, 29(3):341-349.

[12]Sun Y, Guo QM, Liu DL, et al.Invivoexpression of Toll-like receptor 2, Toll-like receptor 4, CSF2 and LY64 in Chinese chronic periodontitis patients[J]. Oral Dis, 2010, 16(4):343-350.

(收稿： 2016-06-04 修回： 2016-10-19)

ResveratrolattenuatesLPS-inducedcellinjuryandTLR4/NF-κBactivationinhumanperiodontalligamentcells

HUHaiyan,LIUCaihong.

716000,RepairDepartmentofStomatology,YananUniversityAffiliatedHosptial,China

Objective: To investigate the protective effect of resveratrol on lipopolysaccharide (LPS)-induced cell injury in human periodontal ligament cells(hPDLCs).MethodshPDLCs were cultured and identified. The cultured hPDLCs were divided into 5 groups: control group and LPS(10 μg/ml)+RES(0/30, 60 and 90 μmol/L respectively) groups. The cell proliferation was detected by MTT assay. The secretion of TNF-α and IL-6 of hPDLCs was detected by ELISA kit. The expression of TLR4/NF-κB mRNA and protein was determined by PCR and Western blot analyses, respectively.ResultsThe cultured cells were negative for cytokeratin and positive for vimentin staining. Compared with the control group, cell proliferation was decreased, the secretion of TNF-α/IL-6 levels and the expression of TLR4/NF-κB mRNA and protein were increased after treatment with LPS. Whereas, with 30-90 μmol/L resveratrol pretreatment, the proliferation ability of hPDLCs was enhanced(Plt;0.05), the secretion levels of TNF-α and IL-6 and the expression of TLR4/ NF-κB mRNA and protein were reduced(Plt;0.01) in a dose-dependent manner.ConclusionResveratrol may attenuate LPS-induced cell injury by inhibiting TLR4/NF-κB pathway in hPDLCs.

Resveratrol；LPS;Humanperiodontalligamentcells(hPDLCs);TLR4;NF-κB

716000， 延安大學附屬醫(yī)院口腔修復科

呼海燕 E-mail: shidasda@163.com

R781.4, R282.71

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.019