劉洋 王國(guó)芳 岳二麗 郭留云

羅格列酮對(duì)牙周炎大鼠牙齦脂聯(lián)素受體表達(dá)的影響

劉洋 王國(guó)芳 岳二麗 郭留云

目的探討羅格列酮(ROS)對(duì)牙周炎大鼠牙齦脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)mRNA、脂聯(lián)素受體2(AdipoR2)mRNA和TNF-α等炎癥因子表達(dá)的影響及在牙周炎中對(duì)牙槽骨保護(hù)的潛能。方法50 只SD大鼠隨機(jī)分為5 組(n=10),大鼠不干預(yù)處理作為空白對(duì)照，40 只大鼠用于制作牙周炎模型后分別用蒸餾水(牙周炎組)、1、3、10 mg/kg ROS(低、中、高劑量組)灌胃1 次/d，持續(xù)4 周。 然后取樣，RT-PCR測(cè)定牙齦組織AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達(dá)水平，ELISA測(cè)牙齦組織TNF-α、MMP-9和血漿脂聯(lián)素濃度，標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)碼攝影測(cè)量秞牙骨質(zhì)界到牙槽骨嵴頂(CEJ-A)距離。結(jié)果牙周炎組和空白對(duì)照組相比，牙齦組織AdipoR1和AdipoR2 的mRNA表達(dá)水平顯著降低(Plt;0.01)，血漿脂聯(lián)素水平無(wú)差異(Pgt;0.05)，TNF-α和MMP-9濃度顯著上升(Plt;0.01)。和牙周炎組相比，低、中、高劑量治療組牙齦組織AdipoR1 mRNA表達(dá)均升高(Plt;0.05)，TNF-α濃度顯著降低(Plt;0.01)；中、高劑量治療組牙齦組織AdipoR2 mRNA表達(dá)顯著升高(Plt;0.01)，MMP-9濃度顯著降低(Plt;0.01)，血漿脂聯(lián)素濃度升高(Plt;0.05)，牙槽骨吸收量顯著降低(Plt;0.01)。結(jié)論ROS可能通過(guò)上調(diào)牙齦組織中AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達(dá)水平，降低TNF-α、MMP-9濃度，緩解牙周組織炎癥，降低牙槽骨吸收。

牙周炎； 脂聯(lián)素受體； 羅格列酮； 腫瘤壞死因子α； 基質(zhì)金屬蛋白酶9

炎癥因子在牙周炎中扮演了重要的角色，牙周組織破壞主要是由組織破壞性的酶(MMPs)和炎癥介質(zhì)(PG，IL)造成的[1]。IL-1β和TNF-α等初級(jí)炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)趨化因子和前列腺素等二級(jí)介質(zhì)的合成，導(dǎo)致炎癥加重、連接組織破壞和破骨細(xì)胞性骨吸收[2]。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子，作為一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子在多種生理病理過(guò)程中起重要作用，例如抗炎、增加胰島素敏感性、保護(hù)心血管。對(duì)器官有多重保護(hù)效應(yīng)，抑制細(xì)胞分泌早期炎癥因子TNF-α[3]。脂聯(lián)素與其受體結(jié)合發(fā)揮其生理作用，脂聯(lián)素受體(AdipoRs)主要有2 種:AdipoR1和AdipoR2，兩者幾乎在所有的組織器官中均有表達(dá)。Yamaguchi等[4]認(rèn)為脂聯(lián)素功能的降低可能加重牙周病的發(fā)展。PPAR-γ是II型核受體超家族成員，羅格列酮(ROS)是高效的PPAR-γ受體激動(dòng)劑，有調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的功能，可控制炎癥水平，尤其是炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[5]，目前已在臨床上被用于治療哮喘等一些炎癥性疾病。本實(shí)驗(yàn)研究ROS干預(yù)下牙周炎大鼠牙齦組織中AdipoR1和AdipoR2的mRNA表達(dá)水平改變，探討其對(duì)牙周炎牙齦組織脂聯(lián)素抵抗的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 4 周齡190～230 g雄性SD大鼠50 只(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分5 組，每組10 只：①空白對(duì)照組，不建立牙周炎模型，蒸餾水灌胃;②牙周炎組，建立牙周炎模型，蒸餾水灌胃;③低劑量治療組，建立牙周炎模型，1 mg/kg ROS灌胃;④中劑量治療組，建立牙周炎模型， 3 mg/kg ROS灌胃；⑤高劑量治療組，建立牙周炎模型，10 mg/kg ROS灌胃。

1.1.2 主要試劑以及儀器 ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))；SuperRT cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Drop PCR mix(康為，北京)；ELISA試劑盒(西唐，上海)；羅格列酮鈉片(太極集團(tuán)，重慶)。

1.2 方法

1.2.1 建立牙周炎模型 0.2 mm正畸鋼絲置于大鼠左上頜第二磨牙的釉牙骨質(zhì)界(CEJ)處，牙周炎建模參考了葛超等[6]的方法。

1.2.2 羅格列酮干預(yù) 羅格列酮鈉片溶于蒸餾水，結(jié)扎前1 h對(duì)各組使用不同濃度的ROS溶液或等量蒸餾水灌胃，以后每天1 次持續(xù)4 周。全麻下腹主靜脈取血，離心獲得血漿。處死后取左上頜第二磨牙牙齦組織，上頜骨于10%中性甲醛溶液保存。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè) Trizol提取牙齦組織總RNA,SuperRT cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，引物序列如下：AdipoR1(398 bp)(5′-AACT GGACTATTCAGGGA-3′)和(5′-TGGTTCCAGTCTCATCAG-3′)，AdipoR2(233 bp)(5′-ACCCACAACCTTCCTTCATC-3′)和(5′-GCTAGCC ATGAGCATTAGCC-3′)，GAPDH(307 bp)，(5-TGAACGGGAAG CTCACTGG-3′)和(5′-CCACCACCCTGTTG CTGTA-3′)。95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32 個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。電泳，凝膠成像儀拍照，目的基因與GAPDH灰度積分比值表示基因表達(dá)水平。

1.2.4 ELISA檢測(cè) 稱取牙齦組織，按比例加入PBS制備勻漿，離心取上清。ELISA測(cè)定牙齦組織勻漿TNF-α、MMP-9和血漿脂聯(lián)素濃度，方法按照說(shuō)明書。

1.2.5 牙槽骨吸收分析 標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)碼攝影(standard digital photographs)測(cè)量牙槽骨吸收。步驟參考Cavagni等[7]的方法。Photoshop CS6軟件測(cè)量上頜第二磨牙頰腭側(cè)各5 個(gè)位點(diǎn)的CEJ-A(近中根2 個(gè)，根分叉1 個(gè)，遠(yuǎn)中根2 個(gè))，計(jì)算均值，結(jié)果以mm表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

和空白對(duì)照組相比，牙周炎組牙齦組織中AdiopoR1 mRNA和AdipoR2的mRNA表達(dá)水平下降(Plt;0.01)。和牙周炎組相比,低、中、高劑量治療組牙齦組織AdipoR1 mRNA表達(dá)水升高(Plt;0.05),中、高劑量治療組AdipoR2 mRNA表達(dá)水平升高(Plt;0.01)(圖 1)。

2.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

和空白對(duì)照相比，牙周炎組TNF-α和MMP-9濃度升高(Plt;0.01)，血清脂聯(lián)素水平無(wú)差異(Pgt;0.05)。和牙周炎組相比，低、中、高治療組牙齦組織中TNF-α濃度下降(Plt;0.01)；中、高劑量治療組牙齦組織MMP-9濃度下降(Plt;0.01)，血漿脂聯(lián)素濃度上升(Plt;0.05)(圖 2)。

2.3 牙槽骨吸收測(cè)定

和空白對(duì)照組相比，牙周炎組頰、腭側(cè)牙槽骨吸收顯著增加(Plt;0.01)。和牙周炎組相比，中、高劑量治療組頰、腭側(cè)牙槽骨吸收顯著降低(Plt;0.01)(圖 3)。

3 討 論

脂聯(lián)素通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞功能和粒-單系組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制炎癥介質(zhì)的釋放[8]，抑制IL-6等前炎性細(xì)胞因子的同時(shí)誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子IL-10分泌[9-10]，Iwayama等[11]發(fā)現(xiàn)IL-1β存在的情況下，脂聯(lián)素可抑制牙齦成纖維細(xì)胞分泌IL-6和IL-8，脂聯(lián)素在牙周炎炎癥控制方面可能起到了一定的作用。

圖 1 AdipoRs mRNA表達(dá)水平(與空白對(duì)照組相比，**：Plt;0.01；與牙周炎組相比， *：Plt;0.05，#：Plt;0.01)

圖 2 牙齦組織TNF-α,MMP-9和血漿脂聯(lián)素濃度(與空白對(duì)照組相比，**：Plt;0.01；與牙周炎組相比，#：Plt;0.05，##：Plt;0.01)

Fig 2 Concentration of gingival TNF-α,MMP-9 and plasma adiponectin(vscontrol,**：Plt;0.01;vsperiodontitis group,#:Plt;0.05, ##:Plt;0.01)

圖 3 頰腭側(cè)牙槽骨喪失測(cè)量(紅線: 測(cè)量位點(diǎn)牙槽骨吸收水平)

炎癥介質(zhì)和脂聯(lián)素信號(hào)通路之間有交聯(lián)，高濃度的TNF-α可降低人牙齦成纖維細(xì)AdipoR1 mRNA的表達(dá)[4]，本研究發(fā)現(xiàn)牙周炎可導(dǎo)致大鼠牙齦組織AdipoR1和AdipoR2 的mRNA表達(dá)下調(diào)，牙齦組織TNF-α濃度升高，推測(cè)牙周炎中牙齦組織TNF-α濃度增高可能是AdipoRs mRNA表達(dá)水平下調(diào)的原因。脂聯(lián)素通過(guò)與受體結(jié)合發(fā)揮抗炎作用，AdipoRs表達(dá)水平降低可能是牙周疾病加重的原因之一，AdipoRs基因表達(dá)水平降低導(dǎo)致脂聯(lián)素結(jié)合減少，生理學(xué)效應(yīng)降低，靶組織對(duì)脂聯(lián)素敏感性降低，這種現(xiàn)象叫脂聯(lián)素抵抗。本研究中，牙周炎大鼠血漿脂聯(lián)素和正常大鼠相比無(wú)差別，牙齦組織AdipoRs mRNA表達(dá)下調(diào)，提示單獨(dú)牙周炎不能改變循環(huán)脂聯(lián)素濃度，受體表達(dá)水平降低引發(fā)脂聯(lián)素抵抗可能是牙周炎中脂聯(lián)素功能下降的關(guān)鍵。

Iwaki等[12]提出人脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子包含了PPAR-γ反應(yīng)元件(PPRE)，PPAR-γ可提高脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子活性，PPAR-γ激動(dòng)劑可以激活脂聯(lián)素啟動(dòng)子增加脂聯(lián)素mRNA表達(dá)，在本研究中，ROS干預(yù)上調(diào)了牙周炎大鼠血漿脂聯(lián)素濃度和牙齦組織AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達(dá)，提示ROS可通過(guò)上調(diào)循環(huán)脂聯(lián)素水平及AdipoRs的表達(dá)緩解牙周炎中牙周組織的脂聯(lián)素抵抗。 Sun等[13]認(rèn)為PPAR-γ并不能直接與AdipoR2基因啟動(dòng)子上的PPAR反應(yīng)元件結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄，Liu等[14]發(fā)現(xiàn)肝臟和脂肪組織中脂聯(lián)素受體的表達(dá)和血漿TNF-α呈負(fù)相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)牙齦組織中TNF-α濃度升高，推測(cè)羅格列酮可能通過(guò)降低牙齦組織中TNF-α濃度間接調(diào)節(jié)脂聯(lián)素受體水平，但PPAR-γ激動(dòng)劑對(duì)組織中脂聯(lián)素受體mRNA表達(dá)上調(diào)的具體原因仍然需要更深層的研究。

ROS對(duì)牙周組織有保護(hù)作用，這可能和羅格列酮直接或間接通過(guò)降低TNF-α上調(diào)牙齦組織AdipoR1和AdipoR2的mRNA表達(dá)水平，提升循環(huán)脂聯(lián)素濃度，緩解牙周炎中存在的脂聯(lián)素抵抗，降低牙齦組織中MMP-9有關(guān)。羅格列酮有潛力作為傳統(tǒng)牙周炎療法的補(bǔ)充，但仍然需要進(jìn)一步的臨床對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)確定羅格列酮能否對(duì)牙周炎產(chǎn)生臨床治療效果。

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(收稿： 2016-10-09 修回： 2016-11-14)

Theeffectsofrosiglitazoneontheexpressionofadiponectinreceptoringingivaltissueofratswithexperimentalperiodontitis

LIUYang，WANGGuofang，YUEErli，GUOLiuyun.

450000,DepartmentofPeriodontology，Schoolofstomatology，ZhengzhouUniversity，China

Objective： To evaluate the effects of rosiglitazone(ROS) on the expression of adiponectin receptors(AdipoR1 and AdipoR2) mRNA in gingival tissue and inflammatory factors, and on the potential of bone loss in the rats with experimental periodontitis.Methods10 male Sprague-Dawley rats without treatment were used as the controls；40 were used for the creation of periodontis models and then treated by rosiglitazone at 0(periodontitis control),1，3，10 mg/kg(low, median and high dose groups) respectively 1/d for 4 weeks. RT-PCR was used to examine the expression of AdipoR1 and AdipoR2 mRNA in gingiva tissue. Levels of gingival TNF-α，MMP-9 and plasma adiponectin was measured by ELISA.CEJ-A was measured for the evaluation of alveolar bone loss by standard digital photographs.ResultsThe expression levels of gingival AdipoR1 and AdipoR2 mRNA in periodontitis group is lower than that in the control group(Plt;0.01). The concentration of plasma adiponectin had no significant difference between control group and periodontitis group(Pgt;0.05). The concentration of gingival TNF-α，MMP-9 in periodontitis group was significantly higher than that in control group(Plt;0.01). Compared with periodontitis group，ROS treatment increased the expression levels of AdipoR1 mRNA(Plt;0.05)and decreased the concentration of TNF-α in gingival tissue. Median and high dose treatment increased the expression levels of AdipoR2(Plt;0.01)and the concentration of plasma adiponectin(Plt;0.05)，decreased the concentration of MMP-9 in gingival tissue(Plt;0.01)and the alveolar bone loss(Plt;0.01).ConclusionRosiglitazone treatment may reduce inflammatory response and suppress the bone resorption probably through up-regulation of the expression of adiponectin receptors and decrease of the concentration of TNF-α，MMP-9 in gingival tissue.

Periodontitis；Adiponectinreceptor；Rosiglitazone；TNF-α；MMP-9

河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào): 122300410367)

450000, 鄭州大學(xué)附屬河南省口腔醫(yī)院牙周科

郭留云 E-mail：glyun@163.com

R781.4

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.004