路志浩，霍建強(qiáng)，馬 鈺，胡 煒，毛 娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,蘭州 730070)

葡萄CIPK基因家族的鑒定表達(dá)分析

路志浩，霍建強(qiáng)，馬 鈺，胡 煒，毛 娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,蘭州 730070)

以水稻、玉米、擬南芥中已知CIPK基因注冊(cè)序列為基礎(chǔ)，從葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中電子克隆出16條CIPK基因。對(duì)其理化性質(zhì)分析表明，除 VvCIPK10編碼的251個(gè)氨基酸數(shù)目外，其余氨基酸數(shù)目基本穩(wěn)定為300～470。整個(gè)CIPK家族的理論等電點(diǎn)為6～9?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明， VvCIPK01、 VvCIPK03、 VvCIPK04、 VvCIPK08、 VvCIPK09、 VvCIPK13包含外顯子數(shù)都大于10； VvCIPK02、 VvCIPK05、 VvCIPK06、 VvCIPK07、 VvCIPK10、 VvCIPK11、 VvCIPK12、 VvCIPK14、 VvCIPK15、 VvCIPK16包含外顯子數(shù)都小于7。聚類(lèi)分析表明，CIPK基因被分為4個(gè)亞族，且在每一個(gè)亞族中都包含葡萄和擬南芥的CIPK基因家族成員，說(shuō)明它們具有很高的同源性。對(duì)CIPK蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，葡萄CIPK基因家族所編碼的蛋白質(zhì)均以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主，而β-轉(zhuǎn)角最少。亞細(xì)胞定位后發(fā)現(xiàn)， VvCIPK基因在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)最多。對(duì)葡萄CIPK基因家族上游2 kb區(qū)域順式作用元件分析表明， VvCIPK13對(duì)于A(yíng)BA和脫水脅迫的響應(yīng)最為明顯，葡萄CIPK基因家族對(duì)于MYB轉(zhuǎn)錄因子和WRKY轉(zhuǎn)錄因子均有響應(yīng)。 熒光定量分析表明， VvCIPK15在根中表達(dá)量最多，在莖中表達(dá)量最少；在不同處理下該基因表達(dá)差異性顯著。其中，受PEG、ABA、NaCl誘導(dǎo)后呈明顯上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量依次為PEGgt;NaClgt;ABA。同時(shí)該基因在受到高、低溫脅迫時(shí)表達(dá)量也有明顯上調(diào)，9個(gè)處理中只有在山梨糖中呈下調(diào)表達(dá)。推測(cè)該基因能夠參與調(diào)控干旱、鹽堿、低溫等逆境過(guò)程。

葡萄；CIPK家族；基因克??；生物信息學(xué)分析；實(shí)時(shí)定量PCR

葡萄適應(yīng)性很強(qiáng)，葡萄果實(shí)中含有白藜蘆醇和多酚等重要營(yíng)養(yǎng)或藥用成分[1]。甘肅土壤的鹽漬化與干旱以及冬季的絕對(duì)低溫是制約葡萄面積擴(kuò)展的主要因素之一。因此，有關(guān)葡萄抗逆性的研究對(duì)于擴(kuò)大葡萄栽培面積以及提高葡萄品質(zhì)具有重要的意義。

鈣調(diào)磷酸酶B類(lèi)似蛋白的互作蛋白激酶CIPK(CBL-interacting protein kinase)是作為下游蛋白與活化的鈣調(diào)磷酸酶B類(lèi)似蛋白CBL(Calcineurin B-like proteins)相互作用的一類(lèi)蛋白[2]。二者的相互作用能將植物Ca2+信號(hào)傳遞下去，而Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，在植物對(duì)抗各種非生物脅迫的防御機(jī)制中起著重要的作用[3-4]。研究表明，CIPK基因家族編碼蛋白廣泛參與植物的逆境脅迫應(yīng)答和生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控。非生物脅迫因子，如干旱、高鹽和低鉀等都能引起植物CIPK基因的上調(diào)表達(dá)。目前，對(duì)CIPK基因功能的研究主要集中在擬南芥[5]、水稻[6]和玉米[7]中。研究表明，擬南芥CIPK23編碼蛋白在鉀離子代謝中有重要作用。當(dāng)植物受到低鉀脅迫時(shí)，CBL和 CIPK23相偶聯(lián)，共同調(diào)控鉀離子的運(yùn)輸。這個(gè)途徑已經(jīng)在擬南芥、水稻、白楊和葡萄中被確定[8-12]。另外，近幾年中對(duì)于CBL-CIPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究也越發(fā)深入[13]。研究表明通過(guò) AtCBL1、AtCBL9和 AtCIPK23共同作用后，鉀離子運(yùn)輸通道將被激活，以此來(lái)調(diào)節(jié)植物對(duì)鉀的吸收[9，14]。同時(shí)，也有研究提出，CBL可以和PP2C蛋白直接結(jié)合，從而去除CIPK的抑制[15]。最近幾年，隨著大規(guī)模植物基因組測(cè)序的完成，在楊樹(shù)、豌豆和苜蓿等植物中對(duì)CIPK基因的研究也越來(lái)越深入。目前，葡萄基因組測(cè)序已完成(http://www.genoscope.cns.fr/externe/Genome Browser/Vitis/)，但對(duì)葡萄中CIPK基因家族的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，從葡萄基因組庫(kù)中進(jìn)行CIPK基因家族的電子克隆，將得到的 VvCIPK基因進(jìn)行染色體定位、理化性質(zhì)分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位、順式作用元件分析、motif序列分析、同源序列分析以及聚類(lèi)分析等，同時(shí)通過(guò)qRT-PCR實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)逆境脅迫下該基因家族的功能進(jìn)行鑒定，明確該基因家族在葡萄抗逆中的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

提取RNA所用材料為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)保存的葡萄試管苗‘寶石無(wú)核(Gem Seedless)’。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄CIPK基因家族成員鑒定 從已知的文獻(xiàn)中可以得到25個(gè)擬南芥(Arabidopsisthaliala)的CIPK基因ID；30個(gè)水稻(Oryzasativa)的CIPK基因ID；43個(gè)玉米(Zeamays)的CIPK基因ID。在NCBI中分別輸入所有的基因號(hào)獲得每一條基因?qū)?yīng)的CDS與Full-length的序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。將獲得的CDS輸入到葡萄(Vitisvinifera)基因庫(kù)中，將長(zhǎng)度大于1 000 bp的序列保留下來(lái)。為了避免重復(fù)需要對(duì)獲得的所有序列進(jìn)行篩選(使用的工具：DNAMAN)。在葡萄基因庫(kù)獲取已知序列的基因號(hào)、CDS長(zhǎng)度、氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)、分子量大小等理化性質(zhì)數(shù)據(jù)(http://www.genoscope.cns.fr/cgi-bin/blast_server/projet_ML/blast.pl)。采用WoLF PSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)。

1.2.2 葡萄CIPK基因家族進(jìn)化及結(jié)構(gòu)分析 利用MEGA 5.0軟件和clustalx.exe分析蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，采用GSDS進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)[16]，用http://meme-suite.org/tools/meme進(jìn)行motif序列分析[17]，并在http://meme-suite.org/tools/meme中進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

1.2.3 葡萄CIPK基因家族表達(dá)及其啟動(dòng)子上游2 kb順式元件分析 根據(jù)所得的基因序列提交至PLACE統(tǒng)計(jì)分析轉(zhuǎn)錄因子及逆境相關(guān)順式作用元件數(shù)量(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)，主要記錄的對(duì)象有MYB轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、ABA響應(yīng)元件、脫水響應(yīng)元件以及低溫響應(yīng)元件。

1.2.4 材料處理 將‘寶石無(wú)核’葡萄芽的莖段接于MS培養(yǎng)基上，分別置于LED白光(WLED424．724 nm，459 nm)下培養(yǎng)35 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的試管苗用于處理，脅迫處理組為：-4 ℃、4 ℃、25 ℃、40 ℃、400 mmol/L NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% PEG、400 mmol/L 甘露醇、400 mmol/L山梨糖、50 μmol/L ABA，每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù)，處理時(shí)長(zhǎng)24 h；以25 ℃處理作為對(duì)照。同時(shí)以莖為對(duì)照，檢測(cè)根、莖、葉中的表達(dá)情況。以上所有植物材料均被立即投入-80 ℃液氮中保存至RNA提取。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 參照申鵬等[18]方法提取試管苗莖葉混合RNA、試管苗根部RNA、試管苗莖部RNA、試管苗葉片RNA。由 VvCIPK基因家族的CDS序列在Primer Premier 5中設(shè)計(jì)引物(表1)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。cDNA合成用Prime Script RT reagent Kit(Perfect Real Time) 試劑盒(TaKaRa)。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在-20 ℃下保存,備用。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)，應(yīng)用Bio-Rad iCycler iQ實(shí)時(shí)定量PCR儀，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以葡萄UBQ 基因?yàn)閮?nèi)參[19]，對(duì) VvCIPK基因家族進(jìn)行特異性表達(dá)分析。擴(kuò)增體系含1 μL cDNA，上下游引物各 0.8 μL，10.4 μL 反應(yīng) MIX，7 μL ddH2O，總體系 20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線(xiàn)。試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)采用Excel 軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄CIPK基因家族編碼蛋白理化性質(zhì)分析

在NCBI中分別輸入水稻、玉米、擬南芥的基因號(hào)，獲得每一條基因?qū)?yīng)的CDS序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。將獲得的水稻、玉米、擬南芥的CDS序列輸入到葡萄基因庫(kù)中，將長(zhǎng)度大于1 000 bp的序列保留下來(lái)。為了避免重復(fù)，使用DNAMAN對(duì)獲得的所有序列進(jìn)行篩選，共得到16條 VvCIPK基因。與水稻、玉米、擬南芥相比，葡萄CIPK基因在數(shù)量上均少于上述3種模式作物。對(duì)電子克隆出的葡萄CIPK基因家族的16條基因分別命名為 VvCIPK01、 VvCIPK02、 VvCIPK03、 VvCIPK04、 VvCIPK05、 VvCIPK06、 VvCIPK07、 VvCIPK08、 VvCIPK09、 VvCIPK10、 VvCIPK11、 VvCIPK12、 VvCIPK13、 VvCIPK14、 VvCIPK15、 VvCIPK16。玉米中有43個(gè)CIPK基因，但只有26個(gè)含有FL-cDNA，而在 VvCIPK基因家族中均有FL-cDNA。 VvCIPK01與 VvCIPK07分布于5號(hào)染色體上， VvCIPK02與 VvCIPK03分布于6號(hào)染色體上， VvCIPK14與 VvCIPK15分布于8號(hào)染色體上， VvCIPK11與 VvCIPK16分布于9號(hào)染色體上， VvCIPK05與 VvCIPK12分布于10號(hào)染色體上， VvCIPK04、 VvCIPK06與 VvCIPK13分布于11號(hào)染色體上， VvCIPK08分布于18號(hào)染色體上， VvCIPK09分布于15號(hào)染色體上， VvCIPK10分布于13號(hào)染色體上(圖1)。對(duì)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明， VvCIPK10編碼的氨基酸數(shù)目為251個(gè)，其余 VvCIPK基因家族成員編碼的氨基酸數(shù)目為300～470，整體小于玉米中CIPK所編碼的氨基酸數(shù)目。 VvCIPK家族的理論等電點(diǎn)均分布在6～9，酸性氨基酸有5個(gè)，分別是： VvCIPK01、 VvCIPK03、 VvCIPK08、 VvCIPK12、 VvCIPK13。 VvCIPK基因家族成員的序列長(zhǎng)度各不相同， VvCIPK04序列最長(zhǎng)且包含14個(gè)外顯子， VvCIPK06的序列最短且僅包含3個(gè)外顯子。 VvCIPK02、 VvCIPK06、 VvCIPK10和 VvCIPK16外顯子數(shù)目最少，均含有3個(gè)； VvCIPK05、 VvCIPK07、 VvCIPK11、 VvCIPK14和 VvCIPK15均含有4個(gè)外顯子，除 VvCIPK12有 7個(gè)外顯子外，其余 VvCIPK基因上的外顯子個(gè)數(shù)均大于10(表2)。

表1 VvCIPK基因家族表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量引物Table 1 qRT-PCR primers for expression on analysis of VvCIPKs

2.2葡萄CIPK基因家族多序列比對(duì)及其進(jìn)化分析

對(duì) VvCIPK基因家族進(jìn)行多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)： VvCIPK基因家族在C端和N端的均不保守。 VvCIPK10編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度最小(圖2)。為進(jìn)一步了解葡萄CIPK蛋白的系譜發(fā)生及功能特征，本研究對(duì)葡萄CIPK基因家族編碼的氨基酸序列與已經(jīng)鑒定出的擬南芥、水稻、玉米的CIPK基因家族編碼氨基酸序列進(jìn)行了聚類(lèi)分析。結(jié)果表明，所有的氨基酸序列被分成4個(gè)亞族。第一亞族(GroupⅠ)包含27個(gè)基因序列，其中6個(gè)基因來(lái)自葡萄，9個(gè)基因來(lái)自擬南芥，其余12個(gè)基因來(lái)自水稻和玉米，其中 VvCIPK03的親緣關(guān)系和水稻CIPK基因親緣關(guān)系相近，其余5個(gè) VvCIPK基因均與擬南芥CIPK基因關(guān)系相近；第2亞族(GroupⅡ)包含19個(gè)基因序列，其中3個(gè)基因來(lái)自葡萄，8個(gè)基因來(lái)自擬南芥，其余8個(gè)基因來(lái)自水稻和玉米，其中 VvCIPK01與水稻CIPK親緣關(guān)系相近，其余2個(gè) VvCIPK基因與擬南芥CIPK關(guān)系相近；第3亞族(GroupⅢ)包含20個(gè)基因序列， 其中6個(gè)基因來(lái)自葡萄，6個(gè)基因來(lái)自擬南芥，其余8個(gè)基因來(lái)自水稻和玉米，該亞族中包含的所有 VvCIPK基因都和擬南芥CIPK基因親緣關(guān)系相近；第4亞族(GroupⅣ)包含9個(gè)基因，1個(gè)基因來(lái)自葡萄，2個(gè)基因來(lái)自擬南芥，其余6個(gè)基因來(lái)自水稻和玉米，該亞族中的 VvCIPK基因和水稻CIPK親緣關(guān)系相近(圖3)。所以整體上 VvCIPK基因與AtCIPK基因同源性高，說(shuō)明該基因在進(jìn)化上比較保守。

圖1 葡萄 CIPK基因在染色體上的分布Fig.1 The distribution of CIPK genes in grape chromosome

表2 葡萄 CIPK基因理化性質(zhì)Table 2 The physical and chemical property of VvCIPK

2.3 葡萄CIPK基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

VvCIPK基因家族結(jié)構(gòu)分析表明，該基因家族分為2組，一組包含外顯子個(gè)數(shù)小于7，另一組包含外顯子個(gè)數(shù)均大于10。外顯子個(gè)數(shù)小于7的基因有： VvCIPK02、 VvCIPK05、 VvCIPK06、 VvCIPK07、 VvCIPK10、 VvCIPK11、 VvCIPK12、 VvCIPK14、 VvCIPK15和 VvCIPK16。外顯子個(gè)數(shù)大于10的基因有： VvCIPK01、 VvCIPK03、 VvCIPK04、 VvCIPK08、 VvCIPK09和 VvCIPK13。 VvCIPK基因家族外顯子長(zhǎng)度保守性差，沒(méi)有顯著規(guī)律(圖4)。

2.4 葡萄CIPK基因家族Motif序列分析

Motif分析表明：在 VvCIPK基因家族中共找到25個(gè)motif序列，結(jié)合聚類(lèi)樹(shù)分析和基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可以將 VvCIPK01、 VvCIPK03、 VvCIPK04、 VvCIPK08、 VvCIPK09、 VvCIPK16和 VvCIPK13分為一組，這些序列上共有的motif排列順序?yàn)閙otif4、motif3、motif9、motif1、motif2、motif7、motif10和motif8，同時(shí)除 VvCIPK01以外，其余6條基因均聚到第1亞族內(nèi)(GroupⅠ)，但 VvCIPK01的外顯子分類(lèi)又和 VvCIPK03、 VvCIPK04、 VvCIPK08、 VvCIPK09和 VvCIPK13相似。故推測(cè)這7條基因執(zhí)行的功能相近。motif16到motif25這10個(gè)motif序列都只分布在葡萄CIPK基因家族中的某2個(gè)成員上，motif16只存在于 VvCIPK05和 VvCIPK11中，motif20只存在于 VvCIPK10和 VvCIPK13中，motif18只存在于 VvCIPK02和 VvCIPK12中，motif19只存在于 VvCIPK04和 VvCIPK16。但是分布的位置卻差異很大，故推測(cè)這些motif發(fā)揮功能的時(shí)間以及協(xié)作表達(dá)的蛋白上有可能存在差異(圖5)。

圖3 擬南芥、水稻、玉米和葡萄CIPK基因進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree using the CIPK full length amino acid sequence from grape Arabidopsis, rice and maize

2.5葡萄CIPK基因家族亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，除了 VvCIPK09外，葡萄CIPK基因家族在細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)；除了 VvCIPK06外，葡萄CIPK基因家族在葉綠體內(nèi)均有表達(dá)。 VvCIPK01、 VvCIPK02分別只在過(guò)氧化物酶體和細(xì)胞骨架中表達(dá)。在高爾基體中表達(dá)的基因有 VvCIPK03和 VvCIPK09；在細(xì)胞基質(zhì)中表達(dá)的基因有 VvCIPK10和 VvCIPK12(表3)。

葡萄CIPK基因家族編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角與不規(guī)則卷曲。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明： VvCIPK基因家族編碼的16條蛋白主要以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主(表4)。

2.6葡萄CIPK基因啟動(dòng)子上游2kb順式作用元件分析

為了確定 VvCIPK基因家族啟動(dòng)子上游2 kb 區(qū)域的順式作用元件，在該基因家族起始密碼子上游2 kb堿基序列中進(jìn)行搜索，結(jié)果表明： VvCIPK基因家族成員都含有MYB轉(zhuǎn)錄因子和WRKY轉(zhuǎn)錄因子，但是ABRE、DRE和LTRE則有很大不同。在 VvCIPK基因家族中，除 VvCIPK02、 VvCIPK10、 VvCIPK11、 VvCIPK12、 VvCIPK16其余均含有ABRE響應(yīng)元件； VvCIPK06、 VvCIPK12、 VvCIPK13、 VvCIPK14、 VvCIPK15中含有DRE。 VvCIPK13在A(yíng)BRE和DRE上的響應(yīng)均最高。 VvCIPK11和 VvCIPK16只含有MYB與WRKY轉(zhuǎn)錄因子(表5)。

圖4 葡萄CIPK基因家族的基因結(jié)構(gòu)Fig.4 Gene structures of CIPK in grape

圖5 葡萄CIPK 基因家族motif分析Fig.5 Grape CIPK gene family motif analysis

2.7 葡萄 CIPK15基因的實(shí)時(shí)定量分析

結(jié)果表明：除 VvCIPK15外，其余15個(gè)基因在根、葉、莖中的表達(dá)量基本一致，并且在不同脅迫處理下的表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異。 VvCIPK15在根、葉、莖中的表達(dá)差異性顯著。其中，莖中的表達(dá)量最少，根中的表達(dá)量最高，是對(duì)照的1.38倍(以莖為對(duì)照)，并且在根和葉中均呈上調(diào)表達(dá)(圖6)。 VvCIPK15在不同處理下，基因的表達(dá)情況：只有在400 mmol/L山梨糖處理24 h后呈下調(diào)表達(dá)，其余各個(gè)處理下， VvCIPK15呈上調(diào)表達(dá)。經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% PEG處理24 h后 VvCIPK15的相對(duì)表達(dá)量最高，是對(duì)照的5.24倍(以25 ℃為對(duì)照)；經(jīng)過(guò)400 mmol/L NaCl處理24 h后 VvCIPK15的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的4.90倍；經(jīng)過(guò)50 μmol/L ABA處理24 h后 VvCIPK15的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的4.49倍。同時(shí)，在-4 ℃、4 ℃和40 ℃經(jīng)24 h處理后，該基因均呈上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明 VvCIPK15也受高、低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。故推測(cè)， VvCIPK15受高鹽、干旱和溫度脅迫的誘導(dǎo)，同時(shí)還受ABA的強(qiáng)烈誘導(dǎo)(圖7)。

表3 葡萄 CIPK基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Table 3 Subcellular location prediction of CIPK gene in grape

表4 葡萄CIPK蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 4 The secondary structure of CIPK protein sequence in grape %

表5 VvCIPK基因上游2 kb區(qū)域順式作用元件的分布Table 5 Putative Cis-elements existed in the 2 kb upstream region of VvCIPK genes

圖6 葡萄 CIPK15 基因在不同器官中的表達(dá)Fig.6 The relative expression of VvCIPK15 gene in different organs

1.-4 ℃;2.4 ℃;3.25 ℃;4.400 mmol/L NaCl;5.40 ℃;6.400 mmol/L甘露醇400 mmol/L mannitol;7.400 mmol/L山梨糖 400 mmol/L sorbose;8.10%PEG;9.50 μmol/L ABA

圖7葡萄CIPK15基因在不同處理下的表達(dá)
Fig.7VvCIPK15geneexpressionunderdifferenttreatment

3 討 論

植物在不斷進(jìn)化的過(guò)程中發(fā)展出一套應(yīng)對(duì)各種非生物逆境的保護(hù)機(jī)制，這些逆境包括干旱、寒冷、高鹽、高溫和氧化等等。在這些不利因素下，植物可以通過(guò)啟動(dòng)相關(guān)基因及改變蛋白結(jié)構(gòu)等來(lái)保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的各種新陳代謝反應(yīng)，從而維持植物體結(jié)構(gòu)與功能的完整性[20]。有研究表明CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)在各種逆境響應(yīng)中起到了重要的作用[21]。

本試驗(yàn)共得到16條葡萄CIPK基因，分別命名為 VvCIPK01～ VvCIPK16，其所處的位置、大小均有差異。與水稻、玉米、擬南芥CIPK基因家族包含基因個(gè)數(shù)相比，葡萄CIPK基因家族包含基因個(gè)數(shù)少于上述3種植物。本試驗(yàn)依據(jù)進(jìn)化結(jié)果將葡萄CIPK基因家族分為4個(gè)亞族。進(jìn)化分析結(jié)果顯示： VvCIPK01、 VvCIPK03與水稻CIPK和玉米CIPK同源性高， VvCIPK07和水稻CIPK同源性高， VvCIPK基因家族的其他成員均與擬南芥CIPK基因家族同源性高。 ZmCIPK21基因組含有14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子，蛋白結(jié)構(gòu)上具有CIPK所共有的C端NAF保守結(jié)構(gòu)域[22]， VvCIPK01中有12個(gè)外顯子，故 VvCIPK01和 ZmCIPK21都屬于多外顯子的CIPK序列，并且 VvCIPK01的蛋白結(jié)構(gòu)上C端具有NAF保守結(jié)構(gòu)域。 ZmCIPK03與 VvCIPK03對(duì)比結(jié)果與 VvCIPK01和 ZmCIPK21對(duì)比結(jié)果相似，都屬于CIPK基因中多外顯子一類(lèi)，并且均含有NAF保守結(jié)構(gòu)域[23]。故推測(cè)聚類(lèi)樹(shù)中與葡萄CIPK同源性高的基因在內(nèi)部結(jié)構(gòu)上具有相似性。在外顯子的分布上，葡萄、擬南芥、水稻、玉米、楊樹(shù)CIPK基因的外顯子都可以分為多外顯子和少外顯子2類(lèi)。表明CIPK基因的進(jìn)化比較早，這2個(gè)分支的祖先在單、雙子葉分化之前就已經(jīng)存在于植物的基因組中[24-26]。對(duì) VvCIPK編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)他們以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主。這和甘蔗中CIPK編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)在組成上有相似之處，都是以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主[27]。在對(duì) VvCIPK表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，它們大多數(shù)在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中表達(dá)。但是CIPK基因家族在野大麥中的表達(dá)部位則主要聚集在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上[28]。本試驗(yàn)對(duì)啟動(dòng)子上游2 kb順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)： VvCIPK基因家族成員對(duì)于A(yíng)BA、高鹽、干旱均有響應(yīng)，其中，ABA響應(yīng)最為強(qiáng)烈，干旱響應(yīng)最弱。故推測(cè)該基因家族在逆境誘導(dǎo)下會(huì)有響應(yīng)。

已有研究表明，植物CIPK基因在逆境脅迫中有重要作用。同時(shí)，干旱或者高鹽引起的脅迫信號(hào)至少通過(guò)ABA依賴(lài)和ABA不依賴(lài)的2條途經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)[29]。本試驗(yàn)熒光定量結(jié)果表明 VvCIPK15受ABA、PEG、NaCl以及低溫脅迫的誘導(dǎo)較強(qiáng)，說(shuō)明該基因可能與干旱或滲透脅迫有關(guān)并且依賴(lài)ABA途徑。 ZmCIPK03、ZmCIPK42以及其他玉米CIPK基因家族成員對(duì)于PEG、NaCl以及低溫脅迫均會(huì)有不同程度的上調(diào)表達(dá)，但不是所有玉米CIPK基因家族成員的表達(dá)都依賴(lài)ABA途徑[7，22，30]。水稻CIPK基因家族也受ABA、高鹽、干旱、低溫等逆境誘導(dǎo)表達(dá)[6]。這一結(jié)果與本研究中葡萄 CIPK15的表達(dá)情況相似。說(shuō)明 VvCIPK基因家族很可能在逆境響應(yīng)中起到重要的作用。

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CorrespondingauthorMAO Juan,female, Ph.D,associate professor. Research area:biotechnology of fruit trees.E-mail:maojuan@gsau.edu.cn

(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕Responsibleeditor:PANXueyan)

Genome-wideIdentificationandExpressionAnalysisoftheCIPKGeneFamilyinGrape

LU Zhihao,HUO Jianqiang,MA Yu,HU Wei and MAO Juan

(College of Horticulture, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070,China)

This work was based on known genes of rice, maize and arabidopsis. A total of 16 members of this family were identified in grape genome. Analyzing their physical and chemical properties revealed all of the genes of amino acid number distribute on 300-470 but VvCIPK10 which has 251 amino acid. Theoretical isoelectric point of the whole genes distributed on 6-9.Analyzing structure of genes indicated that a part of exon of VvCIPK were more than 10( VvCIPK01, VvCIPK03, VvCIPK04, VvCIPK08, VvCIPK09 and VvCIPK13), the others were less than 7( VvCIPK02, VvCIPK05, VvCIPK06, VvCIPK07, VvCIPK10, VvCIPK11, VvCIPK12, VvCIPK14, VvCIPK15 and VvCIPK16).Phylogenetic analysis indicated that all the proteins fell into four major clusters, and every cluster contained a part of genes of grape and arabidopsis. It indicated high homology relationship of those genes.Analyzing the secondary structure of VvCIPK protein sequence indicated that most ratio were alpha helix and irregular curly, the ratio of beta angle was the least. The whole genes chief expressed in cytoplasm by using subcellular location prediction. Analysis Cis-elements in the 2 kb upstream region indicated that the response of ABA and drought stress in VvCIPK13 was the most. Meanwhile the response of MYB and WRKY in VvCIPK were existence. Real-time quantitative analysis revealed that the expression of VvCIPK15 was the most in root. Meanwhile the expression of VvCIPK15 existed large difference under the different treatment.The inducible expression level of VvCIPK15 was significantly up-regulated under the PEG, NaCl, ABA stress. The expression was the most under the treatment of PEG. Second was NaCl. Third was ABA. The inducible expression level of VvCIPK15 was also significantly up-regulated under high or low temperature stress. This gene was only down-regulated in sorbose. VvCIPK15 may play a significance role in the process of drought,salt,cold and so on.

Grape; CIPKs gene family; Gene clone; Bioinformatic analysis; Real-time PCR

2016-06-08

2016-10-15

Student Research Training Program of Nation in Gansu Agricultural University(No.201510733005);the National Natural Science Foundation of China(No.31460500).

LU Zhihao,male,bachelor student.Research area:biotechnology of fruit trees. E-mail:1790665627@qq.com

日期：2017-11-17

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.018.html

2016-06-08

2016-10-15

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家級(jí)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(201510733005)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31460500)。

路志浩，男，在讀本科生，研究方向?yàn)楣麡?shù)生物技術(shù)。E-mail: 1790665627@qq.com

毛 娟，女，博士，副教授，研究方向?yàn)楣麡?shù)生物技術(shù)。E-mail: maojuan@gsau.edu.cn

S663.1

A

1004-1389(2017)11-1619-12