柳延濤，段 維，王 波，劉勝利，王 鵬，趙 剛

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 作物所，新疆石河子 832000；2. 新疆康地種業(yè)科技股份有限公司，烏魯木齊 830011)

SSR標(biāo)記技術(shù)鑒定‘新食葵7號(hào)’品種純度的研究

柳延濤1，段 維2，王 波1，劉勝利1，王 鵬1，趙 剛1

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 作物所，新疆石河子 832000；2. 新疆康地種業(yè)科技股份有限公司，烏魯木齊 830011)

以‘新食葵7號(hào)’及其雙親的DNA為模板，對(duì)100對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，以期為生產(chǎn)應(yīng)用提供準(zhǔn)確、便捷的雜交種種子純度鑒定方法。SSR多態(tài)引物標(biāo)記521在‘新食葵7號(hào)’母本產(chǎn)生特異條帶大小為482 bp，父本為447 bp；標(biāo)記563在母本上特異條帶大小為352 bp，父本為384 bp，分子鑒定的純度和田間鑒定純度基本一致，通過SSR引物篩選，得到可以區(qū)分父本、母本和雜交種的標(biāo)記引物521和563，這2個(gè)引物標(biāo)記可有效鑒定‘新食葵7號(hào)’雜交種種子的純度。

向日葵；雜交種；品種純度鑒定；SSR標(biāo)記

向日葵(HelianthusannuusL.)是世界五大經(jīng)濟(jì)作物之一，具有耐鹽堿、耐干旱、耐瘠薄的特性，是中國北方地區(qū)的主要油料作物。國內(nèi)從20世紀(jì)70年代開展三系雜交育種，雜交種已在生產(chǎn)中大面積推廣應(yīng)用。由于在向日葵三系雜交制種過程中很容易自交結(jié)實(shí)形成假雜種，影響品種雜種優(yōu)勢(shì)的發(fā)揮。此外，在大規(guī)模雜交制種過程中，由于父本收獲不及時(shí)或不徹底，其自交結(jié)實(shí)的種子也很容易混進(jìn)雜交種，從而造成種子純度質(zhì)量下降。因此，在向日葵雜交種銷售之前必須進(jìn)行嚴(yán)格的純度鑒定。

目前，向日葵雜交種鑒定大多采用形態(tài)學(xué)方法，根據(jù)作物的形態(tài)特征和農(nóng)藝特征鑒定特定的基因型，是一種基本的品種純度檢驗(yàn)方法，具有簡單、直觀、易觀測(cè)記載等優(yōu)點(diǎn)，但鑒定周期長，費(fèi)用高[1-2]，屬基因表達(dá)的間接鑒定。近年來，DNA多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)迅速發(fā)展，尤其是DNA多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)以其直接進(jìn)行基因的分子鑒定，具有材料少、時(shí)間短、結(jié)果穩(wěn)定性好、重復(fù)性高、技術(shù)簡單、成本低的顯著優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為檢測(cè)的主要方法[3]。目前，SSR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于玉米、水稻、大豆等其他作物的品種純度鑒定，SSR最大的優(yōu)點(diǎn)在于其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序凝膠電泳分離時(shí)具有單堿基的高分辨率，能檢測(cè)到很高的多態(tài)性，遺傳信息量較大，并具有較好的穩(wěn)定性和重演性[4-6]。本研究利用 SSR 標(biāo)記技術(shù)對(duì)‘新食葵7號(hào)’進(jìn)行純度鑒定，旨在通過分子標(biāo)記技術(shù)快速、穩(wěn)定及準(zhǔn)確鑒定‘新食葵7號(hào)’雜交種種子純度，為向日葵育種和種子管理探索準(zhǔn)確、便捷的雜交種種子純度鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為‘新食葵7號(hào)’雜交種，及其母本‘BH3-Ⅱ12555’、父本‘XX2-u1111’樣品；均由新疆農(nóng)墾科學(xué)院提供。一份用于田間小區(qū)種植鑒定，一份用于SSR 標(biāo)記技術(shù)鑒定?！率晨?號(hào)’是由新疆農(nóng)墾科學(xué)院作物所選育的產(chǎn)量較高、綜合經(jīng)濟(jì)性狀好、抗逆性較強(qiáng)的中早熟食葵雜交種，2011年通過新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定。以‘新食葵7號(hào)’及其雙親的DNA為模板，進(jìn)行SSR物分子標(biāo)記的多態(tài)篩選。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取 考慮到成本，試驗(yàn)選取600?！率晨?號(hào)’種子，分成3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)200粒，參照已報(bào)道的CTAB法提取DNA[7-8](這種方法是由Murray 和Thompson(1980)修改而成的簡便方法)。食葵DNA快速提取試劑含100 mmol/L Tris-HCl pH 8，1.4 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，pH 8， 2.74 mmol/L CTAB，20 mmol/L 2-巰基乙醇。

在大批量鑒定時(shí)，使用新疆康地種業(yè)科技有限公司設(shè)計(jì)的一套批量DNA提取方法(一種組合式磁性分離裝置[9]，專利號(hào)：Z1201120272074.2)，利用該裝置可以一次提取1～96個(gè)不同樣品，并在DNA的質(zhì)量上有所提高，極大地節(jié)約了人力成本和時(shí)間。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)混樣含5×反應(yīng)緩沖液4 μL，25 mmol/L MgCl2溶液2 μL，0.1 mmol/L dNTPs溶液3 μL，1 μmol/L Primer溶液3 μL，5 UTaqDNA聚合酶0.2 μL，1～5 ng模板DNA；反應(yīng)總體積為20 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃變性2 min，94 ℃變性45 s、57 ℃退火45 s、72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

1.2.3 膠板電泳 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度100 g/L，待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；電泳緩沖液為1×TBE，使電泳緩沖液液面剛高出凝膠面，恒壓電泳。

取4 mL上述“1.2.2”中PCR擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液1 mL，含如下成分：2.5 g/L溴酚藍(lán)，2.5 g/L二甲苯青，40 g蔗糖定容至0.1 L；加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1 cm處時(shí)，停止電泳；電泳完畢，取出凝膠；凝膠用蒸餾水稍沖洗后，按照以下程序進(jìn)行銀染：固定(100.0 g/L乙醇、5.0 g/L冰乙酸)20 min；銀染(2.0 g/L硝酸銀水溶液)12 min；蒸餾水漂洗2次； 0.02 g/L硫代硫酸鈉的水溶液漂洗；顯色(15.0 g/L氫氧化鈉、4.0 g/L甲醛)適度；在白色燈下DNA存在處顯示出肉眼可辨的條帶，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存。

1.3 田間小區(qū)種植鑒定方法

選取900粒向日葵種子，分成3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)300粒，于同年冬天種植在海南三亞實(shí)驗(yàn)站，行距40 cm，株距15 cm。出苗后調(diào)查向日葵的整齊度等形態(tài)特征，計(jì)算品種的純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

以‘新食葵7號(hào)’及其雙親的DNA為模板，對(duì)100對(duì)SSR引物分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，獲得能夠同時(shí)區(qū)分父本、母本和雜交種的SSR多態(tài)引物標(biāo)記521和563。利用該引物不僅可以鑒定出‘新食葵7號(hào)’雜交種樣品中母本自交結(jié)實(shí)產(chǎn)生的假雜種，而且可以鑒定出由于收割不及時(shí)或不徹底等原因混進(jìn)的父本假雜種。其序列如下。

標(biāo)記521 ：5′-CACTGCAACACCTTTCCT- TT-3′；5′-AGGTAGCCTGACAAACAGATAAGG-3′。

標(biāo)記563：5′-CATTGTGACCGATGGA- CGATA-3′；5′-GCACCAGTCCTCTTAGCGAA- T-3′。

2.2 ‘新食葵7號(hào)’雜交種的鑒定

利用篩選出的SSR多態(tài)引物標(biāo)記521和563對(duì)‘新食葵7號(hào)’雜交種及親本進(jìn)行鑒定，選取部分條帶圖像(圖1)?？梢詮膱D1看出，12個(gè)泳道從右到左分別是父本、母本、及F1雜交種。其中父本特異條帶大小為482 bp，母本為447 bp；第10泳道表現(xiàn)為父本條帶，表明該籽?？赡苡兄品N田的種植父本混入。

1～9.‘新食葵7號(hào)’F1雜交種 Hybrid；10.混入‘新食葵7號(hào)’雜交種父本的F1Male parent mixed with hybrids；11.‘新食葵7號(hào)’母本 Maternal parent；12.‘新食葵7號(hào)’父本 Male parent

圖1引物521擴(kuò)增的SSR圖譜
Fig.1TheSSRproductsamplifiedbytheprimer521

圖2為SSR引物標(biāo)記563擴(kuò)增的‘新食葵7號(hào)’雜交種及親本的圖像，13個(gè)泳道從左到右分別是母本、父本、及F1雜交種。產(chǎn)生的母本特異條帶大小為352 bp，父本為384 bp；第3和第5泳道表現(xiàn)為父本條帶，表明該籽?？赡苡兄品N田的父本混入。

通過對(duì)‘新食葵7號(hào)’親本及雜交種SSR分子標(biāo)記鑒定和田間鑒定相比較(表1)可以看出，其鑒定該品種的純度和田間鑒定純度基本一致，但SSR純度鑒定結(jié)果比田間種植鑒定純度低0.1%～0.8%，推測(cè)可能是在田間種植鑒定過程中，由于雜交種單株具有雜種優(yōu)勢(shì)，在有限的生長空間比假雜種更容易成活，從而造成鑒定結(jié)果偏高。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，除母本(包括不育系、保持系)、父本基因型外，其他遺傳背景相似的單一基因位點(diǎn)很容易被鑒別出來，田間純度鑒定主要以農(nóng)藝性狀為標(biāo)準(zhǔn)，遺傳背景相似的雜交種難以鑒別，因此該引物可快速有效鑒定‘新食葵’雜交種種子的純度，并且利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)也是一種準(zhǔn)確、快速、便捷鑒定向日葵雜交種純度的方法。

1.‘新食葵7號(hào)’母本 Maternal parent；2.‘新食葵7號(hào)’父本 Male parent；3～4和 6～13.‘新食葵7號(hào)’F1雜交種 Hybrid;5.混入‘新食葵7號(hào)’雜交種父本的F1Male parent mixed with the hybrid

圖2引物563擴(kuò)增的SSR圖譜
Fig.2TheSSRproductsamplifiedbytheprimer563

表1 不同鑒定方法的結(jié)果比較Table 1 Comparison of the results of different identification methods

3 討論與結(jié)論

從傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定、生化指紋檢測(cè)發(fā)展到分子水平和基因水平檢測(cè)雜交向日葵品種純度的檢驗(yàn)技術(shù)，經(jīng)歷從簡單到復(fù)雜而精確的過程，每一種方法都有其各自的優(yōu)點(diǎn)和不足。每一種向日葵雜交種純度的鑒定方法在應(yīng)用上都具有重要的意義。

目前，向日葵種子純度鑒定主要是冬季在海南種植鑒定，需要經(jīng)歷播種、出苗和一定的生育期，因此田間鑒定時(shí)間長，海南種植異地鑒定費(fèi)用高，而且通常在種子銷售完后才得到鑒定結(jié)果。本試驗(yàn)基于PCR 技術(shù)，利用向日葵2個(gè)SSR分子標(biāo)記完成對(duì)向日葵雜交種子純度的鑒定，均在室內(nèi)操作，過程快捷，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，為向日葵雜交的種子純度鑒定提供新思路。通過建立標(biāo)準(zhǔn)食葵DNA的提取方法，包括食葵SSR技術(shù)最佳程序，PCR擴(kuò)增反應(yīng)各組分的優(yōu)化組合，以及擴(kuò)增條帶的顯色程序；本研究以商品食葵品種‘新食葵7號(hào)’及其雙親的DNA為模板，進(jìn)行大量SSR引物分子標(biāo)記的篩選和重復(fù)，獲得能夠同時(shí)區(qū)分父本、母本和雜交種的引物標(biāo)記521和563，這2個(gè)引物標(biāo)記可有效鑒定‘新食葵7號(hào)’雜交種種子純度，辨別種子真?zhèn)?，利于油葵雜交種種子高效準(zhǔn)確的質(zhì)量控制，加快‘新食葵7號(hào)’商品種子的質(zhì)量檢測(cè)進(jìn)程。

本研究結(jié)果表明，SSR標(biāo)記技術(shù)表現(xiàn)為多態(tài)性好、靈敏度高，適于食葵種子的純度鑒定，但是能否篩選到合適的引物是該方法成功應(yīng)用的限制因素。建議在第一批引物設(shè)計(jì)的思路下，增加引物數(shù)量。對(duì)向日葵等作物純度鑒定SSR核心引物資料目錄索引，一些學(xué)者也作了相關(guān)研究[10-14]。另外，食葵親本材料少，由于品種保護(hù)等原因，要收集到親本種子越來越難，影響引物的篩選。所以建議收集更多的父母本材料，進(jìn)行更大范圍的引物篩選，擴(kuò)大適應(yīng)性，節(jié)約鑒定時(shí)間。

在使用過程中可以達(dá)到以下有益效果：(1)加快鑒定時(shí)間：建立食葵DNA提取、SSR技術(shù)，擴(kuò)增效果穩(wěn)定，省去繁雜的試劑配置和特定引物篩選進(jìn)程。(2)特異性好：利用該引物分別對(duì)‘新食葵7號(hào)’的母本多次進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，各引物對(duì)各自模板均產(chǎn)生特異條帶。(3)重復(fù)性好：用該引物進(jìn)行多次重復(fù)性檢測(cè)，結(jié)果表明，該方法具有很好的重復(fù)性。比田間小區(qū)種植鑒定的結(jié)果更真實(shí)和準(zhǔn)確，試驗(yàn)結(jié)果也表明該方法多態(tài)性好、靈敏度高，非常適用于向日葵種子的純度鑒定。但是存在一些不足之處，如開發(fā)此類標(biāo)記需要預(yù)先得知標(biāo)記兩端的序列信息，而且引物合成費(fèi)用較高，因此，合成引物不易獲得。

近年來，隨著分子生物學(xué)快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)越來越廣泛應(yīng)用于作物育種、基因文庫、DNA指紋等諸多領(lǐng)域，其中利用分子標(biāo)記進(jìn)行親緣分析和品種純度鑒定成為近期的研究熱點(diǎn)。本文以‘新食葵7號(hào)’及其雙親為試驗(yàn)材料，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)100對(duì)SSR引物分子標(biāo)記進(jìn)行篩選研究，以期為向日葵育種和種子管理探索準(zhǔn)確、便捷的雜交種種子純度鑒定方法。另外，此方法還有利于‘新食葵7號(hào)’雜交種種子高效準(zhǔn)確的質(zhì)量控制，對(duì)加快食葵商品種子的質(zhì)量檢測(cè)進(jìn)程意義重大。

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CorrespondingauthorWANG Bo，male，associate research fellow. Research area:crop cultivation and physiology.E-mail:519392988@qq.com

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsibleeditor:GUOBaishou)

PurityIdentificationofSunflowerHybrid‘Xinshikui7’UsingSSRMarkersTechnique

LIU Yantao1, DUAN Wei2, WANG Bo1, LIU Shengli1, WANG Peng1and ZHAO Gang1

(1.Institute of Crop Research，Xinjiang Academy of Agricultural Reclamation Sciences,Shihezi Xinjiang 832000,China;2.Xinjiang Kangdi Seed Science amp; Technolog Co. Ltd., Urumqi 830011,China)

SSR molecular marker technique was used to provide accurate, convenient method for the identification of the purity of sunflower hybrid seeds in production and processing. With the DNA of ‘Xinshikui 7’ and its parents as template,100 pairs of SSR molecular markers were screened after DNA extraction, PCR amplification and electrophoresis production. The result showed that the SSR polymorphic primer marker 521 produced a specific band of 482 bp in the female parent, and a specific band of 447 bp in the male parent; the primer marker 563 produced a specific band of 352 bp in the female parent, and a specific band of 384 bp in the male parent. The indoor molecular purity identification were consistent with field purity identification. The primer marker 521 and 563 could be used to distinguish the male parent, female parent and hybrid of ‘Xinshikui 7’, and both of the 2 primer markers can effectively identify the purities of the hybrid seeds of ‘Xinshikui 7’, as well as the authenticity of the seeds. The proposed method was simple, fast, and accurate to operate with the advantages of high reproducibility, and it had become the major method in the identification of sunflower varieties.

Sunflower; Hybrid; Variety purity identification; SSR marker

2016-11-30

2017-04-06

Science and Technology Project of Xinjiang Production and Construction Corps(No. 2016AC024)；National Sunflower Modern Industrial Technology System construction Project(No. CARS-16).

LIU Yantao，male，associate research fellow. Research area:crop cultivation and physiology.E-mail:ziheng1979@126.com

日期：2017-11-17

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.016.html

2016-11-30

2017-04-06

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技攻關(guān)(2016AC024)；國家向日葵現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(CARS-16)。

柳延濤，男，副研究員，主要從事農(nóng)作物栽培與生理研究。E-mail：ziheng1979@126.com

王 波，男，副研究員，主要從事農(nóng)作物栽培與生理研究。E-mail：519392988@qq.com

S565.503.7

A

1004-1389(2017)11-1614-05