何亞鵬，張 琪，徐麗美，龐文靜，付明哲，許信剛

(西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

FMDV、BTV、PPRV多重RT-PCR檢測方法的建立

何亞鵬，張 琪，徐麗美，龐文靜，付明哲，許信剛

(西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

為建立能夠同時檢測并鑒別口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)、藍舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)和小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)感染的多重RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應，Reverse transcription-polymerase chain reaction)方法，根據(jù)3種病毒的基因組全序列和保守區(qū)序列設計 3 對特異性引物，優(yōu)化反應體系和擴增條件，建立能夠同時檢測 3 種病毒的多重RT-PCR方法。結(jié)果表明，建立的多重RT-PCR檢測方法敏感性強，對FMDV、BTV和PPRV的核酸最低檢測量分別為15.42、6.29、16.50 ng/μL；特異性試驗結(jié)果表明所建立方法的特異性良好。建立的多重RT-PCR方法具有敏感性高、特異性強、重復性好、快速簡便等特點，可以用于臨床上 3 種病毒感染的診斷和鑒別。

口蹄疫病毒；藍舌病病毒；小反芻獸疫病毒；多重RT-PCR

口蹄疫、藍舌病、小反芻獸疫分別是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)、藍舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)、小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的動物急性傳染病，這 3 種病毒都可以引起反芻動物發(fā)病，且發(fā)病率高，并能夠形成大范圍流行，均被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告的動物疫病[1-3]，在中國被列為一類動物疫病[4]。臨床上存在 3 種病毒混合感染，患畜均表現(xiàn)出精神沉郁，體溫升高，口腔黏膜、乳頭和蹄部冠狀帶等處發(fā)生水泡及潰瘍，臨床癥狀極為相似[5-7]。目前對這 3 種疫病的診斷多采用病原分離鑒定及常規(guī)的血清學方法，所需時間較長，普通PCR檢測需要不同的反應體系，耗時費力。因此建立能同時、快速、精確檢測并鑒別FMDV、BTV、PPRV 3 種病毒感染的多重RT-PCR方法十分必要。多重PCR技術(shù)是在同一PCR體系中加入多對引物同時擴增多種目的基因的分子生物學檢測方法，具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點[8]。本研究針對 3 種病毒基因的保守區(qū)設計特異性引物，建立特異、敏感、快速并能同時檢測鑒別FMDV、BTV和PPRV感染的多重RT-PCR方法，以期為這 3 種病毒感染的同時診斷及鑒別提供方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒與質(zhì)粒 PPRV疫苗株為新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；豬瘟兔化弱毒活疫苗(CSFV)為中牧股份有限公司產(chǎn)品；羊口瘡疫苗(ORFV)和山羊痘疫苗(GTPV)為齊魯動物保健品有限公司產(chǎn)品；BTV的RNA、FMDV的RNA、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和Vero細胞由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)微生物實驗室保存。

1.1.2 待檢組織或病料 23 份病料是2015年陜西省部分地區(qū)養(yǎng)羊場病羊的痂皮、肝臟、脾臟、肺臟和淋巴結(jié)等組織樣品，每頭羊的各種組織混合為 1 份病料。

1.1.3 主要試劑 Fast Quant RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Trizol Reagent試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；Premix rTaqDNA聚合酶為大連寶生物有限公司產(chǎn)品；小量凝膠回收試劑盒Easy Pure Quick Gel Extraction Kit、克隆載體pEASY-T1 Cloning Kit、小量質(zhì)粒提取試劑盒Easy Pure Plasmid Mini Prep Kit為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)NCBI上公布的 3 種病毒的全基因序列并參考國內(nèi)相關(guān)文獻[4,9-10]，應用Primer Premier 5.0軟件設計 3 對引物，分別用于擴增FMDV的 3D基因、BTV的 NS3基因和PPRV的N基因的保守區(qū)。利用NCBI BLAST對引物的特異性進行比對， 3 對引物均具有良好的特異性。引物信息見表1，引物由Invitrogen公司合成。將各引物濃度稀釋至20 μmol/L，-20 ℃保存，備用。

表1 PCR引物信息Table 1 The information of primers for PCR

1.2.2 病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 小反芻獸疫疫苗株RNA的提取按Trizol Regent試劑盒說明進行，所提取的RNA溶于DEPC水中。按照Fast Quant RT Kit試劑盒說明書將 3 種病毒RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應體系：RNA 2 μg，10×Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 補至20 μL，反應條件：42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育 3 min，得到的cDNA于-20 ℃保存，備用。

1.2.3 單項PCR檢測 分別以合成的FMDV、BTV、PPRV的cDNA進行單引物單模板PCR擴增。PCR擴增體系為25 μL：Premix rTaqDNA聚合酶混合物12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL(20 μmol/L)，cDNA 2 μL，去離子水9.5 μL。PCR程序：預變性94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。為探索不同退火溫度對擴增效果的影響，將退火溫度設置51、53、55、57、59 ℃ 5個梯度，以確定單項PCR擴增的最佳退火溫度。

1.2.4 多重RT-PCR反應條件的優(yōu)化 測定FMDV、BTV、PPRV的cDNA質(zhì)量濃度，統(tǒng)一稀釋至50 μg/L，各取1 μL混合后作為多重PCR模板，建立多重PCR反應體系。對多重PCR退火溫度(51、53、55、57、59 ℃ 5個梯度)和引物濃度(FMDV、BTV、PPRV上下游各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L 5個梯度)等反應條件進行優(yōu)化，選擇最佳退火溫度和引物濃度。

1.2.5 多重RT-PCR特異性試驗 采用優(yōu)化后的反應條件，在反應體系中分別加入 3 種病毒的cDNA和 3 種cDNA混合物作為模板，同時分別加入CSFV的cDNA、PRRSV的cDNA、ORFV的DNA、GTPV的DNA、Vero細胞的DNA及滅菌雙蒸水作為模板，進行多重PCR反應。

1.2.6 多重RT-PCR反應靈敏性檢測 測定FMDV、BTV、PPRV的RNA的質(zhì)量濃度分別為48.2、98.4和51.6 ng/μL。取FMDV、BTV、PPRV的RNA各10 μL進行混合，然后將混合物進行倍比稀釋(50～56)，分別將不同稀釋倍數(shù)的RNA混合物進行反轉(zhuǎn)錄，反應體系：RNA混合物 3 μL，10×Fast RT Buffer 3 μL，RT Enzyme Mix 1.5 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 3 μL，RNase-Free ddH2O 補至30 μL，反應條件：42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min。得到的cDNA采用優(yōu)化的擴增條件進行多重RT-PCR擴增，檢測多重RT-PCR反應的靈敏性。

1.2.7 重復性試驗 應用建立的多重PCR方法，分別對FMDV、BTV、PPRV的cDNA及 3 個cDNA混合陽性樣品、CSFV的cDNA、PRRSV的cDNA、ORFV的DNA、GTPV的DNA、Vero細胞的DNA及滅菌雙蒸水樣品各 2 份重復檢測 3 次，以檢測所建立方法的重復性。

1.2.8 臨床樣品檢測 利用建立的多重RT-PCR方法對陜西省部分羊場送檢的 23 份病羊的痂皮、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)和肺臟組織樣品進行檢測，同時采用已經(jīng)建立的單項RT-PCR方法進行檢測，并對結(jié)果進行比較[1,9-10]。取疑似病料混合樣品約100 mg，加液氮充分研磨后轉(zhuǎn)入組織勻漿器中，加入10 mmol/L PBS(pH 7.2)1 mL充分勻漿。于-80 ℃反復凍融 3 次裂解細胞后，12 000 r/mim離心5 min，上清用于病毒RNA的提取，其余操作按照“1.2.4”已優(yōu)化的檢測方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單項RT-PCR擴增

通過單項RT-PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳可觀察到130 bp(圖1-a，F(xiàn)MDV)、257 bp(圖1-b，BTV)和687 bp(圖1-c，PPRV)的條帶，大小與預期相符，證明引物特異性良好，5個退火溫度之間差異較小(圖1)。

a:FMDV；b:BTV；c:PPRV;M.DNA marker DL2000；1～5.退火溫度分別為49、51、53、55和57 ℃ Annealing temperatures were 49 ℃, 51 ℃, 53 ℃, 55 ℃ and 57 ℃ respectively

圖1單項RT-PCR擴增及退火溫度優(yōu)化
Fig.1OptimizationforannealingtemperatureofsingleRT-PCR

2.2 多重RT-PCR引物優(yōu)化

取不同濃度的引物組合進行多重RT-PCR反應，以獲取最佳的引物濃度。結(jié)果表明，F(xiàn)MDV、BTV和PPRV引物濃度為0.4 μmol/L時多重PCR擴增效果最好(圖2)。

M.DNA marker DL2000；1. FMDV、BTV、PPRV引物終濃度都為0.2 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 0.2 μmol/L;2. FMDV、BTV、PPRV引物終濃度都為0.4 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 0.4 μmol/L;3.FMDV、BTV、PPRV引物終濃度都為0.6 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 0.6 μmol/L;4. FMDV、BTV、PPRV引物終濃度都為0.8 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 0.8 μmol/L;5. FMDV、BTV、PPRV引物終濃度都為1.0 μmol/L Primers concentration for FMDV, BTV and PPRV were 1.0 μmol/L

圖2多重RT-PCR引物濃度優(yōu)化
Fig.2TheprimerconcentrationoptimizationresultsofmultiplexRT-PCR

2.3 多重RT-PCR退火溫度優(yōu)化

選取不同的退火溫度(49～57 ℃)進行多重RT-PCR反應，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，在53～57 ℃都有較好的擴增效果，試驗最終選擇55 ℃作為退火溫度(圖3)。

M.DNA marker DL2000；1～5.退火溫度分別為49、51、53、55、57 ℃ Annealing temperatures were 49 ℃, 51 ℃, 53 ℃, 55 ℃ and 57 ℃, respectively

圖3多重RT-PCR退火溫度優(yōu)化
Fig.3TheannealingtemperatureoptimizationresultsofmultiplexRT-PCR

2.4 特異性擴增

采用優(yōu)化的PCR反應條件，在反應體系中分別加入FMDV、BTV和PPRV的cDNA及 3 種cDNA混合物作為模板，同時分別加入CSFV的cDNA、PRRSV的cDNA、ORFV的DNA、GTPV的DNA、Vero細胞的DNA及滅菌雙蒸水作為模板，進行多重PCR反應。結(jié)果表明， 3 種病毒的cDNA模板以及 3 種cDNA混合物作為模板均能擴增到相對應的目的條帶，而其他結(jié)果均為陰性，說明此方法特異性好(圖4)。

2.5 靈敏性試驗

多重RT-PCR靈敏性試驗結(jié)果表明，在FMDV、BTV和PPRV的引物濃度為0.4 μmol/L時，該多重RT-PCR方法能檢測出FMDV、BTV和PPRV的最低RNA質(zhì)量濃度分別為15.42、6.29、16.50 ng/μL(圖5)。

M. DNA marker DL2000；1～10. 多重PCR模板分別為FMDV、BTV、PPRV、FMDV+BTV+PPRV、CSFV、PRRSV、GTPV、ORFV、VERO細胞和ddH2O The template of multiplex PCR were FMDV、BTV、PPRV、FMDV+BTV+PPRV、CSFV、PRRSV、GTPV、ORFV、VERO cell line and ddH2O

圖4多重RT-PCR特異性試驗
Fig.4SpecificitytestofthemultiplexRT-PCR

M. DNA marker DL2000；1～7.依次為50～56倍比稀釋的病毒RNA Different dilutions of RNA from 50～56

圖5多重RT-PCR靈敏性試驗
Fig.5SensitivitytestofthemultiplexRT-PCR

2.6 重復性試驗

應用建立的多重RT-PCR方法在不同時間對每份樣品進行 3 次重復檢測。結(jié)果表明，檢測結(jié)果一致，說明該方法重復性良好。

2.7 臨床樣品檢測

應用建立的多重RT-PCR方法對陜西省部分羊場送檢的 23 份病羊的痂皮、肝臟、肺臟、脾臟和淋巴結(jié)樣品進行檢測，所有樣品檢測結(jié)果均為陰性，采用已經(jīng)建立的單項RT-PCR檢測所得結(jié)果也均為陰性。

3 討 論

近年來，中國口蹄疫疫情不斷發(fā)生，給養(yǎng)殖戶造成重大損失，再加上周邊國家口蹄疫疫情復雜、流行毒株跨境傳播的威脅進一步加大中國口蹄疫防控的復雜性和難度[5]。中國云南省(1979)、湖北省(1983)、安徽省(1985)、四川省(1988)、山西省(1993)、廣西壯族自治區(qū)(1985)等地均報道藍舌病的爆發(fā)。吉林省、遼寧省、新疆維吾爾自治區(qū)和西藏自治區(qū)也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)藍舌病的存在[6,11]。小反芻獸疫作為外來病，近期再次在中國部分省份發(fā)生和流行，提示必須加強對小反芻獸疫的防控工作[12]。所以，應建立完善的防控體系，及時快速地診斷、凈化、隔離，建立免疫緩沖帶，這樣才能消除國內(nèi)的疫情和阻止國外疫情向中國蔓延。目前，用于診斷這 3 種疾病的方法主要有病原分離鑒定、ELISA、常規(guī)RT-PCR、膠體金免疫試驗等。病原的分離鑒定雖然可靠但耗時長且過程繁瑣，不宜用于大規(guī)模疾病的臨床診斷。血清學試驗方法是國內(nèi)主要使用的檢測手段，但其存在相對滯后、成本高的缺陷。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，PCR方法已經(jīng)成為眾多病原檢測和分析的主要手段，但目前還未見能一次性檢測和鑒別口蹄疫、藍舌病、小反芻獸疫的RT-PCR方法的報道。盡快開發(fā)出可鑒別這 3 種疫病的快速、特異且敏感的診斷方法，對控制這些具有嚴重危害的傳染病在中國流行具有十分重要的意義。

多重PCR(multiplex PCR)方法具有高效、系統(tǒng)、經(jīng)濟、簡便等優(yōu)點，是在同一個PCR反應體系中加入2對或2對以上的引物，能同時擴增出對應的多個核酸片段的PCR方法。多種病原體在同一反應管內(nèi)同時被檢出將大大節(jié)省時間、試劑、經(jīng)費。該技術(shù)主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定某些遺傳病及癌基因的分型鑒定等。本研究針對中國面臨的口蹄疫、藍舌病和小反芻獸疫疫情的嚴峻形勢，建立多重RT-PCR方法，旨在對這 3 種疫病的快速精確診斷、為防控疫情爭取有利條件。所建立的多重RT-PCR方法能在同一個反應體系中同時檢測出FMDV、BTV和PPRV 3 種病毒的核酸，省時省力。通過對檢測方法特異性、敏感性的考察及對樣品的檢測，初步表明該方法可以應用于口蹄疫、藍舌病和小反芻獸疫單純感染和混合感染的檢測。

建立一種多重PCR檢測方法須經(jīng)一步步的條件優(yōu)化才能達到預期的效果。本試驗過程中，經(jīng)過對 FMDV、BTV 和 PPRV 引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，各目的片段能夠被有效擴增。敏感性試驗結(jié)果表明，該方法能檢測出FMDV、BTV 和 PPRV 的最低 RNA質(zhì)量濃度分別為15.42、6.29、16.50 ng/μL，敏感性遠遠高于傳統(tǒng)的檢測方法，并且已經(jīng)可以滿足臨床檢測和監(jiān)測的需要。本試驗中目的片段均間隔120 bp以上，擴增結(jié)果顯示目的條帶在瓊脂糖凝膠電泳后易于區(qū)分且無非特異性擴增出現(xiàn)。應用本研究建立的多重PCR方法對 23 份臨床病料進行檢測，從檢測結(jié)果可以看出均未能檢出相應病毒核酸，與已建立的單項RT-PCR檢測所得結(jié)果一致，表明在檢測的病料中不存在這些重要的Ⅰ類病原感染，下一步將增加對臨床樣品檢測數(shù)量，以進一步豐富檢測數(shù)據(jù)并為流行病學調(diào)查提供資料。此外，引起羊發(fā)病的還有綿羊痘病毒、山羊痘病毒、羊口瘡病毒等DNA病毒以及支原體，所以建立能同時檢測羊常見DNA和RNA病毒以及支原體混合感染的多重PCR方法是進一步研究的重點。

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CorrespondingauthorXU Xingang,male,Ph.D,associate professor.Research area:molecular etiology.E-mail: 286567031@qq.com FU Mingzhe, male, senior veterinary officer. Research area: sheep and goat disease. E-mail：1692831800@qq.com

(責任編輯：顧玉蘭Responsibleeditor:GUYulan)

EstablishmentofMultiplexRT-PCRMethodforDetectingFMDV,BTVandPPRV

HE Yapeng, ZHANG Qi, XU Limei, PANG Wenjing, FU Mingzhe and XU Xingang

(College of Veterinary Medicine, Northwest Aamp;F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

In order to develop multiplex RT-PCR method for the clinical detection of FMDV, BTV and PPRV infection of goats and sheep, three pairs of primers were designed and synthesized according to the highly conserved regions of FMDV, BTV and PPRV genome sequence in GenBank. The multiplex RT-PCR reaction condition was optimized and the multiplex RT-PCR method for detecting FMDV, BTV and PPRV infection was established. The results showed that the newly-established method had high sensitivity. The lowest levels of the three viruses were 15.42 ng/μL,6.29 ng/μL and 16.50 ng/μL, respectively. The specificity test showed that the newly-established method has high specificity. The result indicated multiplex RT-PCR method had specificity, sensitivity, repetitive characteristics and it has applied value in detection of FMDV, BTV and PPRV infection．

FMDV(Foot-and-mouth disease virus); BTV(Bluetongue virus); PPRV(Peste des petits ruminants virus); Multiplex RT-PCR

2016-05-26

2016-06-14

Scientific and Technological Projects of Shaanxi Province(No.2016NY-092); Major Industrial Innovation Chain Projects of Shaanxi Province(No.2016KTZDNY02-06)； Technology Achievement Project of Demonstration Station(Base) of Northwest Aamp;F University(No.TGZX2015-32).

HE Yapeng, male, master student.Research area: molecular etiology and immunology. E-mail:879533817@qq.com

日期：2017-11-17

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.002.html

2016-05-26

2016-06-14

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)(2016NY-092)；陜西省重點產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新鏈(2016KTZDNY02-06)；西北農(nóng)林科技大學試驗示范站(基地)科技成果推廣(TGZX2015-32)。

何亞鵬，男，碩士研究生，從事分子病原學與免疫學研究。E-mail：879533817@qq.com

許信剛，男，博士，副教授，主要從事分子病原學研究。E-mail：286567031@qq.com 付明哲，男，高級獸醫(yī)師，主要從事羊病研究。E-mail：1692831800@qq.com

S855.3

A

1004-1389(2017)11-1584-06