竇志敏, 潘玲玲, 鄧權清, 王凱莉, 陳培壽, 沈萬寬,2*

(1. 華南農業(yè)大學農學院, 農業(yè)部華南地區(qū)作物栽培科學觀察實驗站, 廣州 510642; 2. 華南農業(yè)大學農學院, 廣東省微生物信號與病害防控重點實驗室, 廣州 510642)

廣東果蔗宿根矮化病菌檢測

竇志敏1, 潘玲玲1, 鄧權清1, 王凱莉1, 陳培壽1, 沈萬寬1,2*

(1. 華南農業(yè)大學農學院, 農業(yè)部華南地區(qū)作物栽培科學觀察實驗站, 廣州 510642; 2. 華南農業(yè)大學農學院, 廣東省微生物信號與病害防控重點實驗室, 廣州 510642)

為探明廣東果蔗宿根矮化病發(fā)生情況,為果蔗健康種苗生產及推廣應用提供科學依據,本研究采用常規(guī)PCR與巢式PCR技術分別對廣東韶關和廣州南沙果蔗產區(qū)的主栽品種‘黑皮果蔗’(‘Badila’)及華南農業(yè)大學甘蔗育種基地新引進的果蔗品種‘內江蜜蔗’、‘甜城21號’、‘甜城22號’和‘甜城99號’等進行宿根矮化病菌的檢測。結果表明,巢式PCR檢測的陽性檢出率達88.6%,明顯高于常規(guī)PCR檢測(40.4%);廣東韶關果蔗產區(qū)‘黑皮果蔗’宿根矮化病陽性率為86.8%;廣州南沙果蔗產區(qū)‘黑皮果蔗’宿根矮化病陽性率為92.7%;華南農業(yè)大學甘蔗育種基地新引進的果蔗品種除‘甜城22號’外,其他3個品種‘內江蜜蔗’、‘甜城21號’和‘甜城99號’均感染宿根矮化病菌。甘蔗宿根矮化病已在廣東主要果蔗產區(qū)普遍發(fā)生,健康種苗研究與應用十分必要。

果蔗; 宿根矮化病; 常規(guī)PCR; 巢式PCR

甘蔗宿根矮化病(ratoon stunting disease, RSD)是由一種寄居甘蔗木質部的細菌——木質部賴氏菌木質部亞種Leifsoniaxylisubsp.xyli(Lxx)引起的病害[1-2]。該病造成甘蔗產量損失達29%,在干旱等不良環(huán)境條件下引起的損失則更為嚴重[3]。甘蔗RSD是一種種苗傳播的病害,主要通過帶菌蔗種和收獲工具如蔗刀傳播,其病原菌可在蔗種及宿根蔗頭中存活較長時間[4]。由于感病的蔗株一般不表現(xiàn)典型的外部癥狀[5],單從外觀上難以診斷,使得病害發(fā)生較為隱蔽,極易造成病原菌任意傳播擴散,嚴重危害甘蔗生產[6]。

RSD的診斷方法經歷了剖莖檢視[7],相差顯微鏡鏡檢[8],免疫學檢測[9]和PCR檢測[10]等階段。PCR檢測技術具有快速、靈敏等優(yōu)點,現(xiàn)已廣泛應用于甘蔗宿根矮化病菌的檢測。Lopes等[10]、Fegan等[11]及Pan等[12]分別建立了檢測RSD致病菌的PCR體系,并對引物的特異性及靈敏度進行了研究;周丹等[13]對檢測甘蔗宿根矮化病菌的PCR方法進一步優(yōu)化,使其檢測靈敏度、效率及穩(wěn)定性比優(yōu)化前更高,更加適合于快速檢測田間大批量樣品;沈萬寬等[14]利用細菌16S-23S rDNA內轉錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS1/ITS2及甘蔗RSD特異引物Lxx1/Lxx2,建立了檢測RSD致病菌的巢式PCR技術,其靈敏度更高,檢測更加準確。2013年,Pelosi等[15]建立了RSD病原菌Lxx的實時熒光定量PCR檢測技術。

果蔗即鮮食水果型甘蔗,皮薄、莖脆、汁多,富含人體所需的多種維生素和氨基酸,具有生津解渴,消除疲勞的功效。廣東韶關、廣州南沙區(qū)是廣東傳統(tǒng)果蔗產區(qū),年種植面積8 000～10 000 hm2,占廣東果蔗種植面積的70%。近年來,隨著市場需求和種植效益的提高,果蔗生產發(fā)展迅速,種植面積不斷擴大。然而,我國果蔗品種單一(以熱帶原種‘Badila’,即‘黑皮果蔗’為主),且種植年代久,品種抗性較差,較容易感染宿根矮化病、花葉病等種苗傳播病害,導致果蔗產量和品質下降,種植效益降低[16]。生產、推廣和應用脫毒健康種苗是防治甘蔗RSD的主要措施,種植脫毒健康種苗不僅可以有效地脫除RSD致病菌,還有利于提高甘蔗單產和蔗糖分[17]。探明蔗區(qū)RSD發(fā)生危害情況,是科學防控甘蔗RSD的關鍵。目前,有關我國糖蔗RSD檢測及調查分析的報道不少[18-20],但有關果蔗RSD的檢測及調查分析鮮有報道[21]?；诖?本研究應用常規(guī)PCR和巢式PCR檢測技術分別對廣東兩大果蔗產區(qū)主栽果蔗品種及新引進的果蔗品種進行宿根矮化病菌的檢測,對比分析兩種PCR技術檢測結果,明確病害發(fā)生情況,為果蔗RSD的診斷及健康種苗的推廣應用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2016年10月-11月,分別在廣東韶關和廣州南沙果蔗主產區(qū)隨機采集株齡8個月以上的‘黑皮果蔗’主莖,同時在華南農業(yè)大學甘蔗育種基地采集新引進自四川省內江農科院的果蔗或糖果兼用品種‘內江蜜蔗’、‘甜城21號’、‘甜城22號’和‘甜城99號’等株齡8個月以上的主莖,共114份樣品(表1)。陽性對照為Lxx的基因組DNA,由本實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器

TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×Buffer(含Mg2+)、DL2000 DNA Marker及EB替代物均購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;瓊脂糖購自廣州健陽生物科技有限公司。PCR儀為BIO-RAD熱循環(huán)儀;凝膠成像系統(tǒng)為Tanon-1600。

1.3 樣品處理與總DNA的提取

參照沈萬寬等[22]的方法,取樣品蔗莖基部1個或2個節(jié),用利刀削去蔗皮,用手持蔗汁壓榨器壓汁,每個樣品取300 μL以上蔗汁于1.5 mL離心管中,每取完1個樣后,要用清水反復沖洗刀和壓榨器,防止樣品交叉污染,取汁后的離心管及時放入-20℃冰箱保存,蔗汁用于提取總DNA。

采用CTAB法提取蔗汁總DNA,每個樣品取300 μL蔗汁于1.5 mL滅菌離心管中,加入600 μL 2% CTAB提取緩沖液(含0.2%β-巰基乙醇),65℃溫浴45 min,其間不時搖動;加入600 μL的氯仿/異戊醇(24∶1),劇烈振蕩30 s,12 000 r/min、4℃離心10 min;轉移上清到一個新的1.5 mL滅菌離心管中,加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1),輕緩多次顛倒混勻,12 000 r/min、4℃離心10 min;將上層水相轉入一個新的1.5 mL滅菌離心管中,加入1 /10體積3 mol/L的NaAc(pH 5.2)和等體積冷的異丙醇,混勻,-20℃下靜置30 min;12 000 r/min、4℃離心10 min;棄上清,沉淀分別用70%乙醇和無水乙醇各洗1次;風干后用50 μL的TE緩沖液溶解,-20℃保存。

1.4 常規(guī)PCR檢測

采用Pan等[12]報道的甘蔗宿根矮化病菌特異引物Lxx1: 5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′和Lxx2: 5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′進行檢測。引物委托生工生物工程(上海)有限公司合成。以總DNA為模板進行PCR擴增,反應體系20.0 μL:模板1.0 μL,10×Buffer(含Mg2+)2.0 μL,dNTPs (2.5 mmol/L)1.6 μL,引物Lxx1/Lxx2 (5 μmol/L)各1.0 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,用ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序為:94℃預變性2 min;94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸60 s,進行35個循環(huán);最后72℃延伸5 min。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結果并拍照保存。

1.5 巢式PCR檢測

參照沈萬寬等[14]的巢式PCR檢測方法,利用細菌ITS通用引物ITS1/ITS2(ITS1: 5′-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3′;ITS2:5′-GTGCCAA-GGCATCCACC-3′)和特異引物Lxx1/Lxx2進行檢測。引物委托生工生物工程(上海)有限公司合成。以總DNA為模板，以ITS1/ITS2為引物進行第一輪PCR擴增,反應體系及擴增程序參見1.4,其中退火溫度為56℃,循環(huán)30次。以第一輪擴增產物為模板,利用引物Lxx1/Lxx2進行第二輪PCR擴增,反應體系及擴增程序均同1.4。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結果并拍照保存。

1.6 序列測定與分析

PCR產物核苷酸序列委托生工生物工程(上海)有限公司測定,同源性比較在NCBI數據庫中通過BLAST程序進行,序列分析應用DNAStar軟件進行。

2 結果與分析

2.1 常規(guī)PCR檢測

利用引物Lxx1/Lxx2對114份樣品的蔗汁總DNA進行常規(guī)PCR檢測,陽性樣品的PCR產物電泳后可見單一的擴增條帶,大小與預期一致,為438 bp,且空白對照(無菌水)無擴增條帶(圖1)。PCR產物經測序,BLAST比對及DNAStar軟件分析,其序列與來自澳大利亞、美國和中國福建等地的Lxx株系或分離物(GenBank登錄號為AF034641,AF056003,EU723209)相應核苷酸序列的同源性為99%～100%,確認該擴增序列為Lxx基因組片段序列。表明具有該目的條帶的樣品為感染甘蔗宿根矮化病菌的樣品。

圖1 部分果蔗樣品常規(guī)PCR檢測結果Fig.1 Detection of partial fruit cane samples by conventional PCR

2.2 巢式PCR檢測

利用引物ITS1/ITS2和Lxx1/Lxx2對114份樣品的蔗汁總DNA進行巢式PCR檢測,經過兩輪擴增,產物電泳后,可見單一明亮條帶,大小與預期一致,為438 bp,且空白對照(無菌水)無擴增條帶(圖2)。對第二輪PCR產物進行測序,通過BLAST比對及DNAStar軟件分析,其序列與來自巴西、澳大利亞和美國等地的Lxx株系或分離物(GenBank登錄號為AE016822,AF034641,AF056003)相應核苷酸序列同源性為99%～100%的一致性,確認該擴增序列為Lxx基因組片段序列。表明具有該目的條帶的樣品為感染甘蔗宿根矮化病菌的樣品。

圖2 部分果蔗樣品巢式PCR檢測結果Fig.2 Detection of partial fruit cane samples by nested PCR

2.3 常規(guī)PCR與巢式PCR檢測結果比較分析

對114份樣品分別進行常規(guī)PCR和巢式PCR檢測,常規(guī)PCR有46份呈陽性反應,陽性檢出率為40.4%;巢式PCR有101份呈陽性反應,陽性檢出率為88.6%。46份常規(guī)PCR檢測為陽性的樣品,巢式PCR檢測均為陽性;有55份常規(guī)PCR檢測為陰性的樣品,巢式PCR檢測為陽性;僅13份樣品常規(guī)PCR和巢式PCR檢測均為陰性(表1～表2)。結果表明,相較于巢式PCR,常規(guī)PCR漏檢率為54.5%。

2.4 廣東果蔗宿根矮化病發(fā)生情況

114份樣品宿根矮化病檢測結果顯示,廣東韶關果蔗產區(qū)‘黑皮果蔗’宿根矮化病陽性率為86.8%;廣州南沙果蔗產區(qū)‘黑皮果蔗’宿根矮化病陽性率為92.7%;華南農業(yè)大學甘蔗育種基地的5個果蔗品種中有4個感染宿根矮化病,陽性率為80%,其中新引進的果蔗品種除‘甜城22號’外,其他3個品種‘內江蜜蔗’、‘甜城21號’和‘甜城99號’均感染宿根矮化病(表1～表2)。

表1新引進果蔗品種宿根矮化病菌檢測結果

Table1DetectionofLeifsoniaxylisubsp.xyli(Lxx)fromintroducedfruitcanecultivars

品種Cultivar常規(guī)PCR檢測結果ConventionalPCR巢式PCR檢測結果NestedPCR內江蜜蔗Neijiangmizhe++甜城21號TianchengNo．21++甜城22號TianchengNo．22--甜城99號TianchengNo．99++

表2廣東果蔗宿根矮化病菌檢測結果

Table2DetectionofLeifsoniaxylisubsp.xyli(Lxx)fromfruitcanecultivarsinGuangdong

采集地Collectionsite樣品數Totalsamples常規(guī)PCR ConventionalPCR陽性樣品數/份Positivesamples陽性檢出率/%Positiverate巢式PCR NestedPCR陽性樣品數/份Positivesamples陽性檢出率/%Positiverate華南農業(yè)大學甘蔗育種基地SugarcanebreedingbaseofSCAU5360．0480．0廣東韶關Shaoguan，Guangdong683044．15986．8廣州市南沙區(qū)Nansha，Guangzhou411331．73892．7總計Total1144640．410188．6

3 討論

與常規(guī)PCR相比,巢式PCR對靶標DNA進行兩輪擴增,可顯著提高檢測靈敏度。沈萬寬等[14]報道的甘蔗RSD致病菌巢式PCR檢測技術可檢測出10 fg Lxx基因組DNA,較常規(guī)PCR檢測靈敏度提高100倍。Liu等[23]報道的油茶炭疽病菌巢式PCR檢測技術,靈敏度可達10 ag,較常規(guī)PCR檢測靈敏度提高至少1萬倍。鹿連明等[24]設計8對引物比較分析柑橘黃龍病菌常規(guī)PCR檢測與巢式PCR檢測技術的靈敏度,發(fā)現(xiàn)巢式PCR檢測的靈敏度均比常規(guī)PCR檢測至少高1 000倍。李本金等[25]建立的荔枝霜疫霉巢式PCR檢測技術,靈敏度可達100 fg,較常規(guī)PCR提高1 000倍。本研究分別利用常規(guī)PCR和巢式PCR技術對果蔗宿根矮化病菌進行檢測,常規(guī)PCR檢測的陽性檢出率為40.4%,而巢式PCR檢測的陽性檢出率達88.6%,這與巢式PCR較常規(guī)PCR檢測靈敏度更高相一致。

據報道,甘蔗宿根矮化病已廣泛發(fā)生于廣東、廣西及云南等糖蔗產區(qū),黃孟群等[18]對廣東甘蔗宿根矮化病進行調查,共抽查162片蔗田,發(fā)現(xiàn)只有13.5%的田塊不發(fā)病,‘粵糖57/423’、‘粵糖71/210’和‘臺糖134’的感病率分別達到77.3%、92%和95.5%;鄧展云等[19]對廣西部分蔗區(qū)進行抽查,主栽品種‘桂糖11號’RSD陽性率達 86%;王曉燕等[20]對云南省18個蔗區(qū)的RSD發(fā)生危害情況進行系統(tǒng)調查,18個蔗區(qū)均檢測出甘蔗宿根矮化病菌,陽性檢出率為56.4%～88%;張榮躍等[26]對廣西和云南幾個甘蔗主產區(qū)主栽糖蔗品種RSD發(fā)生情況進行調查,陽性率達到59.54%,檢測的20個主栽糖蔗品種中有19個品種感病。楊湛端等[21]對番禺果蔗宿根矮化病進行初步調查,發(fā)現(xiàn)大田種植的‘黃皮果蔗’和‘黑皮果蔗’RSD陽性率分別為95%和93%。本研究對廣東韶關、廣州南沙果蔗產區(qū)的主栽品種‘黑皮果蔗’檢測發(fā)現(xiàn),其RSD陽性率分別達86.8%和92.7%;華南農業(yè)大學甘蔗育種基地的5個果蔗品種中有4個感染宿根矮化病,陽性率為80%。雖然,果蔗宿根矮化病調查仍處于起步階段,但從上述已有的調查結果可以看出果蔗宿根矮化病發(fā)生率普遍高于糖蔗,可能的原因是果蔗為熱帶原種(主要為‘Badila’,即‘黑皮果蔗’),未經過雜交改良,品種抗性較差;而糖蔗品種為甘蔗屬種間雜交種,導入了甘蔗野生種的優(yōu)良抗性基因,具有較強的抗逆性。同時,在實際生產中,果蔗品種單一、連續(xù)種植年代久、農民長期無性繁殖自留種莖造成病菌逐年累積,也是果蔗宿根矮化病發(fā)病率高的原因之一。

本調查表明宿根矮化病已在廣東果蔗產區(qū)普遍發(fā)生,嚴重影響果蔗產量和品質,阻礙果蔗產業(yè)可持續(xù)發(fā)展。因此,有必要及時研究和推廣應用果蔗健康種苗,促進果蔗產業(yè)健康發(fā)展。

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(責任編輯： 楊明麗)

信息公告

2017曾士邁張樹榛獎勵基金評選結果公告

為弘揚曾士邁、張樹榛先生的奉獻、愛國、科學精神，促進植物病理學發(fā)展而設立的“曾士邁張樹榛獎勵基金”已于2017年初啟動,每年獎勵一名做出突出貢獻的科技人員以及兩名優(yōu)秀青年工作者?，F(xiàn)已圓滿完成2017年的評獎工作。經基金管理委員會評審，決定將“曾士邁張樹榛未來之星獎”授予梁俊敏和曹學仁兩位同志，并獎勵每人2萬元人民幣，以表彰他們在植物病害流行學研究中的工作，激勵他們在未來的工作中大膽創(chuàng)新，積極進取，做出更大貢獻。

曾士邁張樹榛獎勵基金管理委員會

二〇一七年十一月十日

秘書處聯(lián)系人：吳波明 電話：18510081892 E-mail: bmwu@cau.edu.cn

DetectionofLeifsoniaxylisubsp.xyli,causalbacteriumofsugarcaneratoonstuntingdisease,fromfruitcaneplantingareasinGuangdong

Dou Zhimin1, Pan Lingling1, Deng Quanqing1, Wang Kaili1, Chen Peishou1, Shen Wankuan1,2

(1.CollegeofAgronomy,SouthChinaAgriculturalUniversity,ScientificObservingandExperimentalStationofCropCultivationinSouthChina,MinistryofAgriculture,Guangzhou510642,China; 2.CollegeofAgronomy,SouthChinaAgriculturalUniversity,GuangdongKeyLaboratoryofMicrobialSignalsandDiseaseControl,Guangzhou510642,China)

This study aimed to understand the occurrence situation of ratoon stunting disease (RSD) in Guangdong fruit cane planting areas and provide scientific basis for the production and application of healthy seedlings. Conventional PCR and nested PCR were used to detectLeifsoniaxylisubsp.xyli, the causal bacterium of ratoon stunting disease, from fruit cane cultivars, including ‘Badila’, ‘Neijiang mizhe’, ‘Tiancheng No.21’, ‘Tiancheng No.22’ and ‘Tiancheng No.99’. Samples of ‘Badila’ used as the main fruit cane cultivar were collected from Shaoguan City and Nansha District of Guangdong Province. Samples of introduced fruit cane cultivars ‘Neijiang mizhe’, ‘Tiancheng No.21’, ‘Tiancheng No.22’ and ‘Tiancheng No.99’ were collected from the sugarcane breeding base of South China Agricultural University (SCAU). The results showed that the positive detection rate was 88.6% by nested PCR, significantly higher than that by conventional PCR, which was 40.4%. The RSD positive rate of ‘Badila’ was 86.8% in Shaoguan and 92.7% in Nansha of Guangzhou, respectively. The introduced fruit cane cultivars from the sugarcane breeding base of SCAU were all infected by RSD pathogen except the ‘Tiancheng No.22’. The sugarcane ratoon stunting disease has occurred widely in the major fruit cane planting areas of Guangdong. It is necessary to carry out the research and application of healthy fruit cane seedlings.

fruit cane; ratoon stunting disease; conventional PCR; nested PCR

2017-02-23

2017-04-19

廣州市科技計劃項目(201604020087)；華南農業(yè)大學人才引進啟動項目(13009)

* 通信作者 E-mail：wkshen@scau.edu.cn

S 435.661

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.028