于子翔, 李 麗, 俞祿珍, 楊翠云, 吳建祥, 黃衛(wèi)昌, 于 翠*

(1. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局, 上海 200135; 2. 上海辰山植物園, 上海 201602; 3. 浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所, 杭州 310058)

建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒聯(lián)合免疫膠體金試紙條的研制及應(yīng)用

于子翔1, 李 麗2, 俞祿珍1, 楊翠云1, 吳建祥3, 黃衛(wèi)昌2, 于 翠1*

(1. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局, 上海 200135; 2. 上海辰山植物園, 上海 201602; 3. 浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所, 杭州 310058)

為了實(shí)現(xiàn)蘭花種植苗圃和口岸一線直接檢測(cè)樣品中建蘭花葉病毒Cymbidiummosaicvirus(CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒Odontoglossumringspotvirus(ORSV)的目的,我們研制了上述兩種病毒聯(lián)合免疫膠體金檢測(cè)試紙條。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,標(biāo)記單抗C10并固定于膠金墊上;將抗體5B7和4F3分別固定于硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線,將羊抗鼠抗體包被固定于硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線,經(jīng)優(yōu)化后組裝膠體金試紙條。結(jié)果表明研制的聯(lián)合試紙條特異性強(qiáng),能夠在10 min之內(nèi)同時(shí)檢出兩種病毒,操作簡(jiǎn)便。對(duì)兩個(gè)種植苗圃的93份蘭花樣品進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)所得結(jié)果與ELISA的檢測(cè)結(jié)果符合性好(Kappa值分別為84.6%和86.7%),能滿足蘭花樣品中建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的初篩要求。

建蘭花葉病毒; 齒蘭環(huán)斑病毒; 聯(lián)合免疫膠體金試紙條

隨著人民生活水平的提高,國(guó)人對(duì)蘭花的品種和數(shù)量都有相當(dāng)大的需求。然而病蟲(chóng)害特別是病毒的侵染會(huì)嚴(yán)重影響蘭花的品質(zhì)。目前至少有28種病毒曾被記錄可侵染蘭科植物,其中各項(xiàng)特性已被清楚掌握,分類地位明確的有建蘭花葉病毒Cymbidiummosaicvirus(CymMV)、齒蘭環(huán)病毒Odontoglossumringspotvirus(ORSV)、黃瓜花葉病毒Cucumbermosaicvirus(CMV)、煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)、煙草脆裂病毒Tobaccorattlevirus(TRV)、番茄環(huán)斑病毒Tomatoringspotvirus(ToRSV)、番茄斑萎病毒Tomatospottedwiltorthotospovirus(TSWV)、鳳仙花壞死斑病毒Impatiensnecroticspotorthotospovirus(INSV)、建蘭環(huán)斑病毒Cymbidiumringspotvirus(CymRSV)、菜豆黃花葉病毒Beanyellowmosaicvirus(BYMV)、蕪菁花葉病毒Turnipmosaicvirus(TuMV)、三葉草黃脈病毒Cloveryellowveinvirus(CYVV)和蘭花斑點(diǎn)病毒Orchidfleckdichorhavirus(OFV)等13種[1-2],而對(duì)于蘭花上最近發(fā)生的辣椒褪綠病毒Capsicum chlorosis virus (CaCV)、石斛脈壞死病毒Dendrobium vein necrosis virus (DVMV)和蝶蘭褪綠斑病毒Phalaenopsis chlorotic spot virus(PhCSV)等15種病毒的分類地位、傳播方式及侵染過(guò)程等尚不十分明確。

針對(duì)侵染蘭花的病毒檢測(cè),酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)和RT-PCR分子檢測(cè)應(yīng)用較為普遍[3-6]。這兩種方法特異性較強(qiáng)且靈敏度高,但是需要一定的試驗(yàn)場(chǎng)所、儀器設(shè)備,不適合口岸一線及苗圃的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。免疫層析膠體金試紙條檢測(cè)是一種簡(jiǎn)便、靈敏、適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的方法,目前已有侵染葫蘆科的4種病毒的免疫膠體金試紙條研制成功[7],但均無(wú)成功應(yīng)用報(bào)告,此外還有煙草環(huán)斑病毒和番茄環(huán)斑病毒聯(lián)合免疫膠體金試紙的研制8]等。在蘭花病毒病的發(fā)生中以CymMV和ORSV最為普遍,危害也最大,而CymMV和ORSV的復(fù)合膠體金免疫層析試紙條的研究尚未見(jiàn)報(bào)道,因此研制這兩種主要蘭花病毒的試紙條可以快速篩查出帶病植株,將在我國(guó)蘭花的進(jìn)出境口岸一線和蘭花種植苗圃中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 病毒來(lái)源

建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒陽(yáng)性對(duì)照購(gòu)自美國(guó)Agdia公司,用于試紙條的靈敏度檢測(cè);南芥菜花葉病毒、黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒陽(yáng)性對(duì)照購(gòu)自美國(guó)Agdia公司,用于驗(yàn)證試紙條檢測(cè)的特異性;辰山植物園蘭花培養(yǎng)溫室、孫橋農(nóng)業(yè)園區(qū)蘭花種植苗圃采集的樣品用于驗(yàn)證試紙條檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

1.2 膠體金的制備、鑒定

采用常規(guī)的氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。具體制備和鑒定過(guò)程參考魏梅生等的方法[8-10]。將燒制的膠體金溶液用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(島津UV-2450)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描鑒定。

1.3 抗體配對(duì)篩選

先將所有抗體分別稀釋至2 mg/mL,然后分別標(biāo)記和包被,CymMV采用4×4配對(duì),ORSV采用6×6配對(duì),組裝簡(jiǎn)易試紙條進(jìn)行抗體配對(duì)篩選。

1.4 免疫膠體金試紙條制備工藝優(yōu)化

著重對(duì)標(biāo)記量、標(biāo)記pH、復(fù)溶液配方、膠體金與抗體配比量進(jìn)行優(yōu)化,具體優(yōu)化過(guò)程參照魏梅生等的文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。

1.4.1 免疫膠體金制備及條件優(yōu)化

取10支潔凈小試管分別加入1 mL膠體金,用0.2 mol/L K2CO3分別調(diào)節(jié)pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0,加入不同濃度的待標(biāo)記單抗50 μL,使其終濃度分別為5、7.5、10、12.5、15 μg/mL,混勻后室溫靜置反應(yīng)15 min,加入100 μL 10% NaCl溶液,觀察顏色變化。根據(jù)結(jié)果確定免疫膠體金的最適pH及抗體標(biāo)記量。標(biāo)記了膠體金后的單抗加入10%BSA封閉15 min,離心棄上清,用復(fù)溶液復(fù)溶沉淀至合適的比例,用噴金儀器涂在玻璃纖維紙上,制作膠金墊。

1.4.2 檢測(cè)線和質(zhì)控線

用0.02 mol/L PBS(pH 7.4)將CymMV和ORSV單克隆抗體稀釋到1.0 mg/mL,劃線于硝酸纖維素膜(NC膜)上,作為檢測(cè)線(test line)。T1線為ORSV的檢測(cè)線,T2線為CymMV的檢測(cè)線。用0.02 mol/L PBS(pH 7.4)將羊抗鼠IgG分別稀釋到1.0 mg/mL,劃線在硝酸纖維素膜上,37℃烘干,作為質(zhì)控線(control line),簡(jiǎn)稱C線。

1.5 試紙條組裝

以硝酸纖維素膜作為固相載體,用1.3篩選出的ORSV特異性單抗制作檢測(cè)線T1,CymMV特異性單抗制作檢測(cè)線T2,羊抗鼠二抗制作質(zhì)控線C,包被在硝酸纖維素膜上(圖1)。

圖1 聯(lián)合免疫膠體金試紙條工藝設(shè)計(jì)圖Fig.1 Design of the complex gold immunochromatography assay stripe

用1.4.1篩選出的ORSV/CymMV通用型單抗C10制作成膠金墊。將包被膜和膠金墊配以樣品墊、吸水濾紙、PVC底板等制作成大板,然后用切條機(jī)切割成一定寬度的試紙條,裝卡、裝袋、包裝。

1.6 試紙條的質(zhì)量檢測(cè)

1.6.1 特異性檢測(cè)

分別將建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病毒、黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒陽(yáng)性對(duì)照按照說(shuō)明與2 mL的PBS緩沖液混勻,低速離心5 min,上清即為制備好的待檢樣品。將上述溶液取60 μL滴于加樣孔中進(jìn)行檢測(cè),每種病毒重復(fù)2次。

1.6.2 靈敏度檢測(cè)

取CymMV和ORSV陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行倍比稀釋獲得10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍和1 280倍的樣品稀釋液,分別用試紙條進(jìn)行靈敏度檢測(cè),測(cè)試方法同1.6.1。

1.7 蘭花樣品檢測(cè)

分別在辰山植物園蘭花培養(yǎng)溫室、孫橋農(nóng)業(yè)園區(qū)蘭花種植苗圃采集有癥狀樣品,利用免疫膠體金試紙條及DAS-ELISA方法分別進(jìn)行檢測(cè),將結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析,若結(jié)果不一致,再利用RT-PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.8 Kappa值計(jì)算

Kappa值用于評(píng)價(jià)兩種不同方法的檢測(cè)結(jié)果是否具有一致性,是描述檢測(cè)一致性較為理想的指標(biāo)。本文采用不帶加權(quán)的計(jì)算方法評(píng)價(jià)DAS-ELISA和免疫膠體金試紙條的一致性。Kappa=(Po-Pc)/(1-Pc),其中Po為實(shí)際一致率,Pc為理論一致率。Po=(a+d)/n;Pc=[(a+b)(a+c)+(c+d)(b+d)]/n2。

表1Kappa值計(jì)算表格

Table1TableforcalculatingthevalueofKappa

方法1Method1方法2 Method2陽(yáng)性數(shù)量/份Positivesamplenumbers陰性數(shù)量/份Negativesamplenumbers合計(jì)Total陽(yáng)性數(shù)量Positivesamplenumbersabg1陰性數(shù)量Negativesamplenumberscdg2合計(jì)Totalf1f2n

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體配對(duì)篩選

抗體經(jīng)過(guò)純化后分別通過(guò)4×4和6×6的交叉配對(duì)反應(yīng),確定CymMV的C10與5B7、ORSV的4F3和6B4配對(duì)最佳。將上述4株單抗分別組合,制作二合一試紙條。利用該試紙條分別檢測(cè)CymMV和ORSV,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)病毒之間存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng),結(jié)果無(wú)法判定。進(jìn)一步研究分析,單抗C10與ORSV存在明顯的交叉反應(yīng),因此可利用此特性,將C10作為通用型抗體用來(lái)制作膠體金,然后再用CymMV和ORSV特異性單抗分別制作檢測(cè)線。經(jīng)進(jìn)一步篩選,確定最佳配對(duì)方式為：膠體金標(biāo)記C10—分別包被4F3和5B7作為T1和T2檢測(cè)線。

2.2 免疫膠體金試紙條優(yōu)化參數(shù)

經(jīng)過(guò)試驗(yàn),免疫膠體金試紙條的條件優(yōu)化如下：膠體金制備按照V氯金酸(1%)∶V檸檬酸三鈉(1%)=1∶1的比例燒制,粒徑約40 nm;單抗C10標(biāo)記量為10 μg/mL,標(biāo)記pH為8.0;金標(biāo)記物復(fù)溶液配方為: 0.1 mol/L Tris+10%蔗糖+1%PVP+1%BSA+0.5% Tween-20,鹽酸調(diào)pH至8.5;膠體金復(fù)合物濃縮比例為100 μL/mL;膠體金復(fù)合物噴涂量為10 μL/cm;檢測(cè)線T1,單抗4F3濃度為1.5 mg/mL;檢測(cè)線T2,單抗5B7濃度為1.5 mg/mL;質(zhì)控線,羊抗鼠IgG濃度為1.5 mg/mL;檢測(cè)線T1、T2和質(zhì)控線劃膜量均為1 μL/cm。

2.3 試紙條特異性

分別使用滴管滴加建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒陽(yáng)性對(duì)照約60～100 μL后,相應(yīng)病毒的檢測(cè)線及質(zhì)控線出現(xiàn)明顯條帶;兩種病毒陽(yáng)性對(duì)照混合后各取50 μL加入檢測(cè)孔后,兩條檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)明顯條帶;加入南芥菜花葉病毒、黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒的陽(yáng)性對(duì)照,僅質(zhì)控線出現(xiàn)條帶,因此本試紙條具有較好的特異性。

2.4 試紙條靈敏度

分別將稀釋10、20、40、80、160、320、640、1 280倍的CymMV和ORSV陽(yáng)性對(duì)照滴加于樣品孔檢測(cè)試紙條的靈敏度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)試紙條可檢測(cè)稀釋至40倍的齒蘭環(huán)斑病毒汁液,而建蘭花葉病毒汁液稀釋至160倍仍可以檢測(cè)到。

2.5 DAS-ELISA檢測(cè)與免疫膠體金試紙條的檢測(cè)比對(duì)結(jié)果

從辰山植物園采集帶有癥狀的蘭花樣品7份,分別進(jìn)行免疫膠體金試紙條檢測(cè)和DAS-ELISA檢測(cè),結(jié)果(表2)表明,除7#樣品外,DAS-ELISA檢測(cè)與免疫膠體金檢測(cè)結(jié)果基本一致,反應(yīng)程度也基本一致。7#樣品ORSV試紙條檢測(cè)為陰性,而DAS-ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性,對(duì)該樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),結(jié)果為陽(yáng)性,這一結(jié)果表明免疫膠體金試紙條對(duì)ORSV的檢測(cè)靈敏度較低，有可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

表2蘭花樣品DAS-ELISA和免疫膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果比較1)

Table2DetectionresultofDAS-ELISAandcomplexgold-immunochromatographyassaystripes

檢測(cè)方法Methods陽(yáng)性對(duì)照PositivecontrolORSVCymMV樣品Sample1#ORSVCymMV2#ORSVCymMV3#ORSVCymMV4#ORSVCymMV5#ORSVCymMV6#ORSVCymMV7#ORSVCymMV健康對(duì)照HealthycontrolORSVCymMV試紙條Assaystripe+++++++++++±++++++++++-++++±+-++++±+--DAS?ELISA(OD)1．0600．4351．3703．5500．2703．3410．9853．6120．1743．1950．2190．3420．1463．2091．0000．3730．120．129

1) “+”表示試紙條檢測(cè)線顏色的深淺,+越多,表明病毒含量越高; “±”表示試紙條檢測(cè)線顏色肉眼不易判定;“-”表示未檢出。OD值為酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的數(shù)值。

“+” means the depth of the color of the test line, more “+”, more virus; “±” means the test line cannot be determined with eyes; “-” means the result was not detected. OD value is the absorption values under wave 405 nm with microplate reader.

2.6 蘭花樣品檢測(cè)

我們從辰山植物園、孫橋農(nóng)業(yè)園區(qū)采集93份樣品進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比,免疫膠體金試紙條檢出CymMV陽(yáng)性樣品51份,ORSV陽(yáng)性樣品38份,其中CymMV和ORSV同時(shí)侵染樣品28份,而DAS-ELISA檢測(cè)出CymMV陽(yáng)性樣品58份,ORSV陽(yáng)性樣品43份,CymMV和ORSV同時(shí)侵染樣品31份。利用Kappa值來(lái)比較兩種檢測(cè)方法的符合性,由表3、表4可知免疫膠體金試紙條與DAS-ELISA檢測(cè)CymMV和ORSV的符合率均超過(guò)80%,基本能夠滿足田間及口岸一線的檢測(cè)需求。

表3免疫膠體金試紙條與DAS-ELISA檢測(cè)CymMV的一致性評(píng)價(jià)(Kappa值)

Table3ResultconsistencybetweenDAS-ELISAandcomplexgoldimmunochromatographyassaystripesbasedonKappavaluefordetectionofCymMV

免疫膠體金試紙條Complexgoldimmunochromatographyassaystripes雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法 DAS?ELISA陽(yáng)性數(shù)量/份Positivesamplenumbers陰性數(shù)量/份Negativesamplenumbers合計(jì)Total陽(yáng)性數(shù)量Positivesamplenumbers51051陰性數(shù)量Negativesamplenumbers73542合計(jì)Total583593Kappa值=84．6%

表4免疫膠體金試紙條與DAS-ELISA檢測(cè)ORSV的一致性評(píng)價(jià)(Kappa值)

Table4ResultconsistencybetweenDAS-ELISAandcomplexgoldimmunochromatographyassaystripesbasedonKappavaluefordetectionofORSV

免疫膠體金試紙條Complexgoldimmunochromatographyassaystripes雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附 DAS?ELISA陽(yáng)性數(shù)量/份Positivesamplenumbers陰性數(shù)量/份Negativesamplenumbers合計(jì)Total陽(yáng)性數(shù)量Positivesamplenumbers38038陰性數(shù)量Negativesamplenumbers64955合計(jì)Total444993Kappa值=86．7%

3 討論

本研究在獲得建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒單克隆抗體的基礎(chǔ)上研制了建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒聯(lián)合免疫膠體金試紙條。該試紙條能夠在10 min之內(nèi)檢出這兩種嚴(yán)重危害蘭花的病毒,且特異性強(qiáng),效果穩(wěn)定,操作簡(jiǎn)便,與DAS-ELISA的檢測(cè)結(jié)果符合性好(Kappa值分別為84.6%和86.7%),能夠滿足蘭花實(shí)際樣品中建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的檢測(cè),實(shí)現(xiàn)種植苗圃及口岸現(xiàn)場(chǎng)一線使用的目標(biāo)。

免疫膠體金試紙條在現(xiàn)場(chǎng)使用過(guò)程中雖然操作比較簡(jiǎn)單,但是還需注意以下兩點(diǎn):①由于病毒分布的不均一性,不同位置取樣會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)差異性,特別是不同樣本之間相對(duì)強(qiáng)度的偏差,在生產(chǎn)調(diào)試過(guò)程中,檢測(cè)7#樣本時(shí),ORSV未檢出明顯反應(yīng),而DAS-ELISA陽(yáng)性,出現(xiàn)這一結(jié)果原因可能是兩種方法使用抗體不同,對(duì)病毒的檢測(cè)靈敏度不同,而導(dǎo)致結(jié)果有差異;②樣本處理之后,放置時(shí)間較長(zhǎng),結(jié)果會(huì)出現(xiàn)明顯的波動(dòng)性,建議樣本處理后及時(shí)檢測(cè),不要放置過(guò)夜。

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(責(zé)任編輯： 楊明麗)

ComplexgoldimmunochromatographyassayandapplicationforrapiddetectionofCymbidiummosaicvirusandOdontoglossumringspotvirus

Yu Zixiang1, Li Li2, Yu Luzhen1, Yang Cuiyun1, Wu Jianxiang3, Huang Weichang2, Yu Cui1

(1.ShanghaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shanghai200135,China; 2.ShanghaiChenshanBotanicalGarden,Shanghai201602,China; 3.InstituteofBiotechnology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

In order to directly detectCymbidiummosaicvirus(CymMV) andOdontoglossumringspotvirus(ORSV) in planting garden and import port, we developed gold-immunochromatographic assay stripe kit. Tri-sodium citrate with aqueous gold chloride was warmed up and mixed to make colloidal gold particles. Monoclonal antibody (McAb) C10 was selected to conjugate with colloidal gold as the detector antibody that was spotted on a conjugated pad, and the McAb 5B7 and 4F3 were used as capture antibody at the test line (T) respectively. Goat anti-mouse IgG antibody was used capture antibody at the control line (C). After an optimized process, the assay stripes were packaged. The result indicated that the viruses could be specifically detected on immune-strip within 10 minutes. 93 samples from Chenshan Botanical Garden and Sunqiao Agricultural Garden were tested, and the results were compared with those obtained by DAS-ELISA in order to examine the reliability. The two methods showed significant consistence (Kappa=84.6% and 86.7 % of CymMV and ORSV, respectively). The established gold-immunochromatographic assay could meet the requirements of primary screening of the two viruses in the gardens and the ports.

Cymbidiummosaicvirus;Odontoglossumringspotvirus; complex gold immunochromatography assay

2017-03-28

2017-05-16

上海市綠化和市容管理局(G152427)

* 通信作者 E-mail: yuc@shciq.gov.cn

S 41-30

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.023