饒 敏, 桂家祥, 盧占軍, 肖青青, 張 岑

(1.江西省贛州出入境檢驗(yàn)檢疫局, 贛州 341000; 2.國家臍橙工程技術(shù)研究中心, 贛州 341000;3. 廣東訊動(dòng)網(wǎng)絡(luò)科技有限公司, 廣州 510000)

基于近紅外技術(shù)柑橘黃龍病田間快速檢測(cè)方法研究

饒 敏1, 桂家祥1, 盧占軍2, 肖青青3, 張 岑1

(1.江西省贛州出入境檢驗(yàn)檢疫局, 贛州 341000; 2.國家臍橙工程技術(shù)研究中心, 贛州 341000;3. 廣東訊動(dòng)網(wǎng)絡(luò)科技有限公司, 廣州 510000)

柑橘黃龍病在感病植株和健康植株之間傳播速度快，因此快速檢測(cè)柑橘黃龍病對(duì)其防治十分關(guān)鍵。本文研究了近紅外技術(shù)快速檢測(cè)柑橘黃龍病的方法。采用PLS-LDA建立的模型對(duì)未參與建模的樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，該模型檢測(cè)的準(zhǔn)確率與普通PCR檢測(cè)的結(jié)果符合率達(dá)到100%，假陽性率小于1%。該技術(shù)具有檢測(cè)周期短、無污染等優(yōu)點(diǎn)，可用于田間黃龍病的快速檢測(cè)。

近紅外光譜技術(shù); 柑橘黃龍病; 田間快速檢測(cè); PLS-LDA

黃龍病是柑橘生產(chǎn)上最具毀滅性的病害,其防治的有效措施是清除病源,切斷傳播媒介[1]。簡便、準(zhǔn)確的田間快速檢測(cè)技術(shù)是目前柑橘黃龍病防控亟須解決的問題。柑橘黃龍病的診斷方法主要有田間癥狀診斷、指示植物鑒定、PCR生物技術(shù)檢測(cè)(即DNA檢測(cè))[2]等。田間癥狀鑒別簡便、直接,一旦柑橘樹葉片出現(xiàn)斑駁狀黃化,掛果期出現(xiàn)“紅鼻子果”,即可斷定是黃龍病樹;但未表現(xiàn)典型發(fā)病癥狀的植株易與生理黃化相混淆,導(dǎo)致錯(cuò)誤診斷。指示植物鑒定周期長,難以用于實(shí)際生產(chǎn);DNA檢測(cè)雖然準(zhǔn)確,但需要在實(shí)驗(yàn)室完成,無法滿足現(xiàn)場(chǎng)、快速的檢測(cè)需求。

近紅外光是最早發(fā)現(xiàn)的不可見光,20世紀(jì)90年代以來,以近紅外光為基礎(chǔ)的光譜分析技術(shù)得到較快發(fā)展,并廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、石油化工、食品工業(yè)、制藥工業(yè)及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。將近紅外光譜(near infrared,NIR)應(yīng)用于柑橘黃龍病檢測(cè)也有了一些初步研究[3-9]。最早開展柑橘黃龍病紅外光譜檢測(cè)研究的是美國佛羅里達(dá)大學(xué),研究者分別對(duì)感染黃龍病的柑橘植株和缺鋅、缺錳植株的葉片進(jìn)行近紅外和中紅外區(qū)光譜掃描分析,發(fā)現(xiàn)感染黃龍病的葉片在近紅外區(qū)具有一定的特征,可用于柑橘黃龍病快速檢測(cè)[4]。目前對(duì)處于潛伏期的黃龍病樣品的快速檢測(cè)方法還沒有相關(guān)的研究,同時(shí)在儀器上缺乏規(guī)模化、便攜式的近紅外光譜儀器。近紅外技術(shù)在檢測(cè)黃龍病上具有快速,無損,可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)[10-13],可在實(shí)際中為種植戶提供指導(dǎo),具有良好的效果和廣闊的應(yīng)用前景。

本研究在已有研究成果的基礎(chǔ)上,就NIR應(yīng)用于柑橘黃龍病田間快速檢測(cè)方法進(jìn)行了深入的算法優(yōu)化,對(duì)黃龍病潛伏期樣品進(jìn)行了近紅外檢測(cè),同時(shí)對(duì)開發(fā)規(guī)?；捅銛y化的近紅外黃龍病專用檢測(cè)儀進(jìn)行了研究,并對(duì)研究成果進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用葉片材料均采自于國家臍橙工程技術(shù)研究中心。所采葉片類型包括：有癥狀,經(jīng)PCR檢測(cè)鑒定為感染黃龍病的葉片;經(jīng)PCR檢測(cè)感病,但田間未顯癥的葉片;田間表現(xiàn)缺素癥狀葉片(主要為缺鋅、氮、鎂元素),共計(jì)1 800個(gè)樣品。

1.2 儀器設(shè)備

光譜儀器采用廣州訊動(dòng)網(wǎng)絡(luò)有限公司開發(fā)的NGD-U1模塊,該模塊采用最新的MEMS微鏡技術(shù)原理,波長范圍900～1 700 nm,儀器輕便,適宜田間現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

1.3 試驗(yàn)方法

采集葉片近紅外光譜:擦干樣品葉片,使其干凈無污漬,不采集葉脈位置。在同一葉片,通過上述光譜儀正反兩面各采集3個(gè)點(diǎn),得到該葉片的反射率。通過化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件,建立鑒別模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜信息

感染黃龍病葉片、潛伏期黃龍病葉片以及未感染葉片原始光譜圖及二階導(dǎo)數(shù)光譜圖如圖1、圖2。

圖1 不同樣品葉片原始光譜圖Fig.1 Original spectra of different leaves

圖2 不同樣品葉片二階導(dǎo)數(shù)光譜圖Fig.2 Second derivative spectra of different leaves

從圖1、圖2上可看出,感染與未感染葉片的光譜特征區(qū)域主要分布在1 300 ～ 1 500 nm 范圍內(nèi),潛伏期與已顯癥葉片光譜圖均有明顯特征,易于識(shí)別。通過采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法[14-16],對(duì)近紅外數(shù)據(jù)進(jìn)行多元散射校正(MSC法),消除葉面散射以及光程變化對(duì)NIR漫反射光譜的影響,可以提煉出感染黃龍病的特征信息,進(jìn)而識(shí)別出是否感染。

2.2 方法篩選

NIR 應(yīng)用于柑橘黃龍病快速檢測(cè)依據(jù)NIR在定性分析中 “相似相聚”的原理,通過不同的模式識(shí)別方法將同類樣品聚在一起,對(duì)不同的樣品進(jìn)行分離,從而對(duì)樣品的類別進(jìn)行判定[18-19]。通過化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件,對(duì)樣品光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分聚類分析,得到如下聚類圖,如圖3。從圖3中可以看出,黃龍病樣品與未感染樣品有明顯界線,說明近紅外方法檢測(cè)黃龍病是可行的。

圖3 不同樣品葉片聚類分析Fig.3 Cluster analysis of different leaves

近紅外光譜分析技術(shù)的定量定性分析都需建立在化學(xué)計(jì)量學(xué)基礎(chǔ)上,為了更好地建立黃龍病判別分析模型,需進(jìn)行相應(yīng)的算法優(yōu)選,本試驗(yàn)挑選目前較常用的集中判別分析算法,K-最近鄰域(KNN)、隨機(jī)森林(random forests)、樸素貝葉斯、集成學(xué)習(xí)方法和偏最小二乘法-線性判別分析(PLS-LDA)分別建立模型,按6次隨機(jī)樣品分類,識(shí)別率結(jié)果見表1。將收集到的樣品劃分為建模集和檢驗(yàn)樣品集。建模集用于確定近紅外定量模型的參數(shù),然后采用不參與建模過程的檢驗(yàn)樣品集對(duì)優(yōu)選的模型進(jìn)行檢驗(yàn)。根據(jù)模型的可用性來評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)未知樣品的能力,本研究采用的評(píng)價(jià)指標(biāo)為識(shí)別率(recognition rate)。識(shí)別率(%)=預(yù)測(cè)準(zhǔn)確的樣品個(gè)數(shù)/總樣品數(shù)×100,識(shí)別率越大,說明模型的性能越好。

表1不同分析方法的識(shí)別率

Table1Recognitionrateofdifferentanalyticalmethods

隨機(jī)次數(shù)Randomtimes識(shí)別率/% AccuracyK鄰近算法KNN隨機(jī)森林法Randomforests樸素貝葉斯Naivebayes集成學(xué)習(xí)方法Ensemblelearningmethods偏最小二乘線性判別分析PLS?LDA198．4293．1664．7492．11100．00299．4793．1661．0592．1199．47398．4297．8970．5393．1699．47497．8994．2166．8491．5899．47597．8990．0069．4785．79100．006100．0092．1165．7986．8499．47

表1顯示,5個(gè)定性分析算法中PLS-LDA的準(zhǔn)確率和穩(wěn)定性最好,所以本研究選擇該方法作為柑橘黃龍病檢測(cè)的建模方法,并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行模型優(yōu)化、完善和驗(yàn)證。

不同的預(yù)處理方法對(duì)光譜信息的提取會(huì)有不同,本研究對(duì)比了歸一化、標(biāo)準(zhǔn)化、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布(SNV)、多元散射校正(MSC)、SG一階導(dǎo)數(shù)、SG二階導(dǎo)數(shù)等六種方法預(yù)處理后的建模差異,其識(shí)別率結(jié)果見下表2。

表2不同預(yù)處理方法的識(shí)別率

Table2Recognitionrateofdifferentpretreatmentmethods

預(yù)處理方法Pretreatmentmethod項(xiàng)目Item主因子數(shù)Principalfactor黃龍病識(shí)別率/%RecognitionrateofHLB未感染葉片識(shí)別率/%Recognitionrateofuninfectedleaves總識(shí)別率/%Totalrecognitionrate原始光譜Originalspectrum模型Model檢驗(yàn)Test2099．899．799．799．080．089．5歸一化Normalization模型Model檢驗(yàn)Test1999．899．699．7100．084．092．0標(biāo)準(zhǔn)化Standardization模型Model檢驗(yàn)Test1999．899．799．783．079．081．0標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布SNV模型Model檢驗(yàn)Test2099．999．599．799．087．093．0多元散射校正MSC模型Model檢驗(yàn)Test2099．899．699．799．091．095．0SG一階導(dǎo)數(shù)Firstderivative模型Model檢驗(yàn)Test2099．999．799．887．063．075．0SG二階導(dǎo)數(shù)Secondderivative模型Model檢驗(yàn)Test2099．399．299．281．063．072．0

表2顯示,6個(gè)預(yù)處理方法中MSC法的識(shí)別率最好,MSC具有消除葉面散射以及光程變化對(duì)NIR漫反射光譜的影響,所以本研究選擇該預(yù)處理方法,并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行模型優(yōu)化、完善和驗(yàn)證。

2.3 模型應(yīng)用

為提高PLS-LDA模型的準(zhǔn)確率,對(duì)建模的預(yù)處理方法和建模波段進(jìn)行了優(yōu)化,采用優(yōu)化后的模型對(duì)720個(gè)未參與建模的樣品(包括傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法判定為黃龍病的樣品340個(gè),未感染黃龍病樣品380個(gè))進(jìn)行判定,結(jié)果(表3,圖4)表明,經(jīng)近紅外方法預(yù)測(cè)判定黃龍病結(jié)果準(zhǔn)確識(shí)別率達(dá)到100%,假陽性率小于1%。通過上述方法建立的柑橘黃龍病檢測(cè)模型在黃龍病快速檢測(cè)系統(tǒng)中只需10 s就能得到檢測(cè)結(jié)果,并且該方法對(duì)潛伏期黃龍病檢測(cè)有效,大大減少了人為誤判的可能性。試驗(yàn)驗(yàn)證了近紅外光譜法與經(jīng)典檢測(cè)方法結(jié)果無顯著差異,并初步通過實(shí)踐應(yīng)用證明其在田間快速檢測(cè)上的可行性和實(shí)用性。

表3PLS-LDA模型預(yù)測(cè)黃龍病識(shí)別率
Table3RecognitionratesofHuanglongdiseasebyPLS-DLAmodel

樣品類別TypePCR鑒定結(jié)果/個(gè)ResultofPCRPLS?LDA鑒定結(jié)果/個(gè)ResultofPLS?LDA識(shí)別率/%Recognitionrate感染黃龍病葉片LeaveinfectedbyHuanglongdisease340340100未感染葉片Uninfectedleave38037999．7388

圖4 優(yōu)化模型對(duì)樣品的判定結(jié)果Fig.4 Results of the optimization model for the samples

3 結(jié)論與討論

NIR技術(shù)是一種快速、無污染的新型快速檢測(cè)技術(shù),本研究表明,通過優(yōu)選預(yù)處理、建模算法能將黃龍病快速檢測(cè)模型判定柑橘黃龍病陽性與普通PCR陽性的符合率提升至100%,近紅外預(yù)測(cè)值與傳統(tǒng)PCR檢測(cè)技術(shù)方法的檢測(cè)結(jié)果無顯著差異。便攜式近紅外光譜儀結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)PLS-LDA算法,能夠逐步地應(yīng)用于柑橘黃龍病田間快速檢測(cè),從而對(duì)柑橘黃龍病的整個(gè)生產(chǎn)過程進(jìn)行全程檢測(cè)和監(jiān)控,該技術(shù)具有很大的發(fā)展空間和推廣前景。

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(責(zé)任編輯： 楊明麗)

FastdeterminationofHuanglongbingdiseaseinthefieldbynearinfraredspectroscopy

Rao Min1, Gui Jiaxiang1, Lu Zhanjun2, Xiao Qingqing3, Zhang Cen1

(1.GanzhouEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Jiangxi341000,China; 2.NationalNavelOrangeEngineeringResearchCenter,Ganzhou341000,China; 3.GuangdongXundongScienceandTechnologyLtd.,Guangzhou510000,China)

It is very important to develop rapid detection method for Huanglongbing (HLB) disease, because of the rapid spread of the disease. In this paper, the near infrared technique was applied for rapid detection of HLB. The model of PLS-LDA was used to detect the samples which did not participate in the modeling. The accurate rate of this technique was 100% same with that of PCR, and the false positive rate was less than 1%. Field detection showed that the near infrared technique for HLB rapid detection is feasible and practical, and can be used in the field detection of HLB disease, with the advantages of short detection cycle, no pollution, etc.

near infrared spectroscopy; citrus Huanglongbing disease; rapid detection in the field; PLS-LDA

2017-02-23

2017-05-23

江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20152ACF60003,20151BBG70067,20141BBF60053);江西省科研院所基礎(chǔ)設(shè)施項(xiàng)目(20151BBA13045);國家自然科學(xué)基金(31560602)

聯(lián)系方式 E-mail:gzrm@qq.com

S 436.66

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.022