魯艷輝, 梁 齊, 鄭許松, 王國(guó)榮, 呂仲賢*

(1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所, 浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 杭州 310021;2. 浙江省杭州市蕭山區(qū)農(nóng)業(yè)局, 杭州 211203)

誘殺植物香根草對(duì)稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)解毒酶和乙酰膽堿酯酶的影響

魯艷輝1, 梁 齊1, 鄭許松1, 王國(guó)榮2, 呂仲賢1*

(1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所, 浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 杭州 310021;2. 浙江省杭州市蕭山區(qū)農(nóng)業(yè)局, 杭州 211203)

香根草能夠有效誘集水稻害蟲(chóng)稻蛀莖夜蛾Sesamiainferens雌成蟲(chóng)在其上產(chǎn)卵,但孵化出的幼蟲(chóng)在香根草上不能完成生活史。為了初步明確香根草對(duì)稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)生理生化水平的影響,本研究分析測(cè)定了取食香根草后稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶和乙酰膽堿酯酶AChE活性的變化。結(jié)果表明:與取食水稻的幼蟲(chóng)相比,取食香根草后幼蟲(chóng)解毒酶谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶GSTs和AChE活性顯著提高。其他兩種解毒酶,羧酸酯酶CarE和細(xì)胞色素P450酶活性無(wú)顯著差異。取食香根草后,4齡幼蟲(chóng)GSTs比活力約為取食水稻的2.1倍;2齡幼蟲(chóng)AChE比活力約為取食水稻的2.9倍。本研究結(jié)果表明香根草可能存在某些有毒活性物質(zhì)或者次生代謝物質(zhì),誘導(dǎo)了稻蛀莖夜蛾體內(nèi)GSTs和AChE的活性,這可能是稻蛀莖夜蛾取食香根草后的應(yīng)急防御機(jī)制之一。此研究結(jié)果為深入闡明香根草在生理、生化水平上對(duì)稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)的影響奠定了基礎(chǔ),為開(kāi)發(fā)以香根草為基礎(chǔ)的稻蛀莖夜蛾綠色防控新技術(shù)提供了理論依據(jù)。

稻蛀莖夜蛾; 香根草; 解毒酶; 乙酰膽堿酯酶; 誘殺植物

稻蛀莖夜蛾Sesamiainferens(Walker),舊稱大螟, 屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae,是一種鉆蛀性害蟲(chóng),寄主范圍廣,能夠取食水稻、茭白、高粱、玉米、甘蔗等數(shù)十種禾本科植物[1]。長(zhǎng)久以來(lái),稻田稻蛀莖夜蛾的防治仍依靠化學(xué)農(nóng)藥。但是,化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用,導(dǎo)致其抗藥性不斷提高,加大了稻蛀莖夜蛾的猖獗危害。同時(shí),也帶來(lái)了農(nóng)藥殘留超標(biāo)、環(huán)境污染等問(wèn)題。目前,水稻害蟲(chóng)的綠色防控技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn),比如利用禾本科香根草Vetiveriazizanioides(Linn.)Nash防治水稻螟蟲(chóng)[2]。香根草對(duì)稻蛀莖夜蛾具有較強(qiáng)的引誘作用,可引誘稻蛀莖夜蛾雌成蟲(chóng)在其上產(chǎn)卵,但孵化出的幼蟲(chóng)取食香根草后生長(zhǎng)發(fā)育緩慢進(jìn)而不能完成生活史,從而降低了稻蛀莖夜蛾種群數(shù)量,減少了其對(duì)水稻的危害[3]。

在植物與植食性昆蟲(chóng)的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中,植物產(chǎn)生化學(xué)防御物質(zhì)抵御害蟲(chóng)侵害,害蟲(chóng)也誘導(dǎo)其體內(nèi)相關(guān)酶系來(lái)克服植物中的潛在毒性[4]。植物次生代謝產(chǎn)物是影響昆蟲(chóng)與植物相互作用的重要因素,表現(xiàn)為影響昆蟲(chóng)的取食行為及其對(duì)食物的利用[5]。許多植物次生物質(zhì)對(duì)昆蟲(chóng)的解毒酶系具有誘導(dǎo)作用[6]。昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的解毒酶系有羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)、細(xì)胞色素P450和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase, GSTs)等[7],解毒酶系的改變是昆蟲(chóng)取食適應(yīng)性的重要表現(xiàn)形式之一[8]。乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)藥劑的作用靶標(biāo),因此常被定義為靶標(biāo)酶。目前,已有許多關(guān)于取食不同寄主植物影響昆蟲(chóng)解毒酶和AChE活性變化的報(bào)道[5, 9-12]。但是取食香根草后對(duì)稻蛀莖夜蛾解毒酶系影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道,本研究通過(guò)測(cè)定取食香根草后稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶和AChE活性的變化,分析香根草對(duì)稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響,以期為更好地建立以香根草為基礎(chǔ)的稻蛀莖夜蛾綠色防控新技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試植物

水稻品種‘浙優(yōu)12號(hào)’購(gòu)自浙江省農(nóng)科種業(yè)有限公司。播種于溫室塑料槽內(nèi),約30 d后移栽至直徑為12 cm的塑料盆中,至45 d分蘗期時(shí)剪取莖稈用于稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)的飼喂試驗(yàn)。

香根草種苗購(gòu)自深圳市鑫淼森園林草坪有限公司。將香根草種苗種于溫室,以分蘗苗作為繁殖體,待香根草分蘗較多時(shí)剪取莖稈用于稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)的飼喂試驗(yàn)。

1.2 供試?yán)ハx(chóng)

稻蛀莖夜蛾種群于2014年5月采自杭州市蕭山區(qū)義橋鎮(zhèn)(30°04′ N,120°12′ E)水稻田,室內(nèi)建立并維持種群,幼蟲(chóng)采用人工飼料飼養(yǎng),飼料配方由中國(guó)水稻研究所提供[13],置于溫度(27±2)℃,相對(duì)濕度(70±5)%,光周期L∥D=16 h∥8 h的智能人工氣候室內(nèi)飼養(yǎng)。待稻蛀莖夜蛾化蛹后將蛹收集起來(lái),放置在干凈的養(yǎng)蟲(chóng)籠中,保濕,讓其繼續(xù)發(fā)育羽化,對(duì)羽化后的成蟲(chóng)以10%的蜂蜜水提供營(yíng)養(yǎng)。

選取初孵幼蟲(chóng)用于水稻(對(duì)照)和香根草的飼喂試驗(yàn)。當(dāng)水稻飼喂的幼蟲(chóng)達(dá)1、2、3、4齡時(shí),對(duì)水稻和香根草飼喂的幼蟲(chóng)分別進(jìn)行取樣,幼蟲(chóng)饑餓3 h后,在液氮中速凍并立即轉(zhuǎn)至-80℃冰箱中保存,供后續(xù)酶活性測(cè)定試驗(yàn)用。試驗(yàn)中每處理各重復(fù)3次。

1.3 取食水稻和香根草后稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶活性測(cè)定

CarE活性測(cè)定:參照Lu等[7]的方法稍加改進(jìn)。每個(gè)樣品稱取100 mg,加入pH 7.0的PBS 1 mL,充分勻漿后,在4℃,12 000×g條件下離心15 min,取上清液40 μL加入酶標(biāo)板中,每孔加入100 μL底物與顯色劑的混合液(含0.2 mol/L、pH6.0的PBS,10 mmol/Lα-乙酸萘酯和1 mmol/L固藍(lán)RR鹽,混合后過(guò)濾)。然后加入5 μL酶液和45 μL 0.1 mol/L、pH 7.6的PBS,利用動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定10 min內(nèi)OD450值變化,以反應(yīng)速度mol/(min·mg)表示酶活力。

GSTs活性測(cè)定:參照Habig等[14]的方法稍加改進(jìn)。用0.1 mol/L,pH 6.5的PBS制備酶液,在96孔酶標(biāo)板中每孔依次加入45 μL PBS、5 μL酶液(制備方法同蛋白酶)、50 μL 1.2 mmol/L的1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和50 μL 6 mmol/L的還原型谷胱甘肽(GSH)。利用動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定10 min內(nèi)OD340值變化,以反應(yīng)速度nmol/(min·mg)表示酶活力。

細(xì)胞色素P450酶活性測(cè)定:參考Rose等[15]的方法稍加改進(jìn)。利用0.1 mol/L、pH 7.6、含1 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT,1 mmol/L苯基硫,1 mmol/L PMSF的PBS制備酶液。在96孔酶標(biāo)板中依次加入2 μmol/L對(duì)硝基苯甲醚(溶解于0.1 mol/L pH 7.8的磷酸緩沖液)50 μL,9.6 mmol/L的NADPH 5 μL和45 μL制備好的酶液。利用動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定10 min內(nèi)OD405值變化,以反應(yīng)速度nmol/(min·mg)表示酶活力。

1.4 取食水稻和香根草后稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)AChE活性測(cè)定

AChE活性測(cè)定:參照Ellman[16]的方法并稍加改進(jìn)。將稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)利用0.1 mol/L,pH 7.5的PBS充分勻漿,勻漿液于4℃,12 000×g條件下離心15 min,取50 μL酶液加入酶標(biāo)板中,依次加入100 μL碘化硫代乙酰膽堿ATChI(0.5 mmol/L)、100 μL DTNB溶液(20 mmol/L)混合后,利用酶標(biāo)儀測(cè)OD405。以反應(yīng)速度mol/(min·mg)表示酶活力。

1.5 蛋白含量測(cè)定

利用Bradford[17]的考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定酶提取液中的蛋白含量,用于酶活性計(jì)算。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,并采用T測(cè)驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)取食香根草后體內(nèi)解毒酶活性

稻蛀莖夜蛾在取食水稻和香根草后,1～4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)CarE比活力無(wú)顯著差異(表1)。

表1取食水稻和香根草后稻蛀莖夜蛾體內(nèi)CarE比活力1)

Table1CarEspecificactivityofSesamiainferensafterfeedingonriceandvetiver

植物PlantCarE比活力/nmol·min-1·mg-1 CarEspecificactivity1齡1stinstar2齡2ndinstar3齡3rdinstar4齡4thinstar水稻Rice(0．082±0．023)a(0．093±0．022)a(0．118±0．017)a(0．113±0．011)a香根草Vetiver(0．092±0．009)a(0．177±0．021)a(0．186±0．011)a(0．257±0．047)a

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,同列數(shù)據(jù)后相同字母表示在0.05水平差異不顯著。下同。

Data in the table are mean±SE; The same letters in the same column indicate no significant difference at 0.05 level. The same below.

取食香根草后的2～4齡稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)GSTs比活力顯著高于取食水稻的,且在4齡時(shí)兩者差異最顯著,取食香根草的幼蟲(chóng)GSTs比活力約為取食水稻的2.1倍(表2)。

表2取食水稻和香根草后稻蛀莖夜蛾體內(nèi)GSTs比活力

Table2GSTsspecificactivityofSesamiainferensafterfeedingonriceandvetiver

植物PlantGSTs比活力/nmol·min-1·mg-1 GSTsspecificactivity1齡1stinstar2齡2ndinstar3齡3rdinstar4齡4thinstar水稻Rice(21．348±9．367)a(23．988±11．336)b(39．177±7．081)b(33．850±9．294)b香根草Vetiver(32．799±15．480)a(48．343±23．327)a(53．721±23．193)a(71．487±27．352)a

稻蛀莖夜蛾在取食水稻和香根草后,1～4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450酶的比活力無(wú)顯著差異(表3)。

表3取食水稻和香根草后稻蛀莖夜蛾體內(nèi)P450酶比活力

Table3SpecificactivityofP450enzymesofSesamiainferensafterfeedingonriceandvetiver

植物PlantP450酶比活力/nmol·min-1·mg-1 P450enzymespecificactivity1齡1stinstar2齡2ndinstar3齡3rdinstar4齡4thinstar水稻Rice(29．934±11．564)a(47．751±6．605)a(47．697±1．800)a(85．879±17．399)a香根草Vetiver(57．393±3．153)a(58．271±1．157)a(56．222±5．785)a(88．326±5．736)a

2.2 稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)取食香根草后體內(nèi)AChE活性

取食香根草后的2～4齡稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)AChE比活力顯著高于取食水稻的,且在2齡時(shí)兩者差異最顯著,取食香根草約為取食水稻上AChE比活力的2.9倍(表4)。

表4取食水稻和香根草后稻蛀莖夜蛾體內(nèi)AChE比活力

Table4AChEspecificactivityofSesamiainferensafterfeedingonriceandvetiver

植物PlantAChE比活力/nmol·min-1·mg-1 AChEspecificactivity1齡1stinstar2齡2ndinster3齡3rdinstar4齡4thinstar水稻Rice(14．204±0．943)b(44．767±6．130)b(65．133±11．708)b(103．235±8．251)b香根草Vetiver(21．142±2．237)a(128．958±7．845)a(119．910±2．777)a(187．488±34．821)a

3 討論

香根草作為誘殺植物防治水稻螟蟲(chóng)已成為稻螟綠色防控的重要措施之一,具有很大的開(kāi)發(fā)潛力[2, 18-20]。筆者前期研究表明,二化螟Chilosuppressalis幼蟲(chóng)取食香根草后體內(nèi)CarE和細(xì)胞色素P450酶的活性顯著下降[12]。為了進(jìn)一步明確香根草在生理、生化水平上對(duì)稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)的影響,我們測(cè)定了取食香根草后稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)3種重要解毒酶和AChE酶的活性變化。

昆蟲(chóng)取食寄主植物后,解毒酶系統(tǒng)會(huì)發(fā)生明顯改變,包括酶的誘導(dǎo)作用等[5-6]。寄主植物中的毒素或次生物質(zhì)在昆蟲(chóng)體內(nèi)的降解主要依靠解毒酶,昆蟲(chóng)體內(nèi)的解毒酶系主要是以GSTs、CarE、細(xì)胞色素P450酶為主,這些酶系對(duì)維持昆蟲(chóng)體內(nèi)正常的生理代謝功能和分解外源毒物都起著重要作用[21]。本文研究結(jié)果表明,取食香根草后稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)GSTs活性顯著升高,說(shuō)明GSTs在稻蛀莖夜蛾對(duì)香根草的解毒代謝中發(fā)揮著重要作用。關(guān)于寄主植物誘導(dǎo)解毒酶活性的研究很多,呂朝軍等[22]研究發(fā)現(xiàn):取食蘋(píng)果樹(shù)的蘋(píng)果黃蚜Aphiscitricola的CarE活性顯著高于取食梨樹(shù)、李樹(shù)和杏樹(shù)的蘋(píng)果黃蚜的CarE活性,推測(cè)這可能與寄主植物體內(nèi)次生代謝物的種類(lèi)不同相關(guān)。林佳和謝佳燕發(fā)現(xiàn)取食鵝觀草的禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi與取食小麥和燕麥的禾谷縊管蚜酯酶活性存在顯著差異[4]。安志蘭等發(fā)現(xiàn)取食番茄、一品紅、棉花和茄子的煙粉虱BemisiatabaciCarE、GSTs等解毒酶均存在顯著差異[11]。此外,李飛等研究發(fā)現(xiàn):害蟲(chóng)能夠通過(guò)改變自身的解毒酶或AChE的特性等方式不斷適應(yīng)寄主植物體內(nèi)產(chǎn)生的次生代謝物[23]。稻蛀莖夜蛾取食香根草后,AChE活性顯著上升,可能是稻蛀莖夜蛾取食香根草后應(yīng)急防御機(jī)制之一。也有研究表明,取食茄子的煙粉虱AChE活性分布與取食番茄的明顯不同[11];取食馬鈴薯、玉米、藜和大豆后對(duì)草地螟Loxostegesticticalis中腸AChE活性影響顯著[24];番茄、四季豆、苦瓜等寄主植物對(duì)南美斑潛蠅LiriomyzahuidobrensisAChE活性影響顯著[10]。

解毒酶和AChE是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的生化物質(zhì),取食不同寄主植物能夠改變昆蟲(chóng)解毒酶或AChE活性。由于目前并無(wú)香根草內(nèi)殺蟲(chóng)活性物質(zhì)鑒定及香根草對(duì)稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)致死作用機(jī)制的相關(guān)報(bào)道,我們推測(cè)可能是香根草內(nèi)的次生物質(zhì)或者有毒活性成分誘導(dǎo)或激活了稻蛀莖夜蛾體內(nèi)與解毒代謝相關(guān)酶的表達(dá),這也是昆蟲(chóng)對(duì)寄主植物的應(yīng)急防御機(jī)制之一,但是這種現(xiàn)象是否能引起稻蛀莖夜蛾對(duì)香根草的完全適應(yīng),使其成為替代寄主,或者是否影響稻蛀莖夜蛾的耐藥性仍有待進(jìn)一步研究探討。此研究結(jié)果為深入闡明香根草對(duì)稻蛀莖夜蛾幼蟲(chóng)生理生化水平的影響,為開(kāi)發(fā)以香根草為基礎(chǔ)的稻蛀莖夜蛾綠色防控新技術(shù)提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 田 喆)

EffectsofthevetivergrassVetiveriazizanioidesontheactivitiesofdetoxificationenzymesandacetylcholinesteraseinthepinkstemborerSesamiainferenslarvae

Lu Yanhui1, Liang Qi1, Zheng Xusong1, Wang Guorong2, Lü Zhongxian1

(1.StateKeyLaboratoryandBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl,InstituteofPlantProtectionandMicrobiology,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021,China; 2.XiaoshanAgriculturalBureau,Hangzhou,ZheijiangProvince,Hangzhou211203,China)

The vetiver grassVetiveriazizanioidescould effectively attract female adults ofSesamiainferensto lay eggs, while the offspring larvae could not complete their life cycles after feeding on vetiver. Aimed to preliminarily clear the physiological and biochemical effect of vetiver against the larvae ofS.inferens, we determined the activities of the detoxification enzymes and acetylcholinesterase (AChE) ofS.inferenslarvae after feeding on vetiver and rice. The results showed that, compared with the larvae fed on rice, the activities of detoxification enzyme glutathioneS-transferase (GSTs) and AChE were significantly increased in the larvae fed on vetiver. However, there was no significant difference in carboxylesterase (CarE) and cytochrome P450s activities. The GSTs activity in the fourth-instar larvae and the AChE activity in the second-instar larvae fed on vetiver were 2.1-, 2.9-fold higher than those in the larvae fed on rice. These results indicated that vetiver may have some active substances or secondary metabolite substances that induced GSTs and CarE activities in the larvae fed on vetiver, which may be one of the mechanisms for emergency adaptation ofS.inferensagainst vetiver. This study lays the foundation for further elucidating the physiological and biochemical effect of vetiver against the larvae ofS.inferens, and provides a theoretical basis for the development of sustainable control technology forS.inferensbased on the trap plant vetiver in rice ecosystem.

Sesamiainferens;Vetiveriazizanioides; detoxification enzyme; acetylcholinesterase; trap plant

2017-02-24

2017-05-02

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0200800)；重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地(2010DS700124-ZZ1601)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303017)

* 通信作者 E-mail: luzxmh@163.com

S 433.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.020