陳冉冉, 謝吉鵬, 葉 婷, 董云浩, 國立耘, 周 濤

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系, 北京 100193)

我國部分蘋果產(chǎn)區(qū)蘋果銹果類病毒的檢測和全序列分析

陳冉冉, 謝吉鵬, 葉 婷, 董云浩, 國立耘*, 周 濤*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系, 北京 100193)

近年來,由蘋果銹果類病毒Applescarskinviroid(ASSVd)引起的蘋果花臉病、銹果病在我國一些蘋果產(chǎn)區(qū)日趨嚴(yán)重,對我國蘋果生產(chǎn)和蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重危害。為了解ASSVd在我國一些蘋果產(chǎn)區(qū)的發(fā)生和變異情況,采用RT-PCR對陜西、山東、山西、河北、北京和黑龍江6個蘋果產(chǎn)區(qū)的35份蘋果樣品進(jìn)行檢測,并克隆獲得30個分離物的基因組全序列,大小為330～333個核苷酸。分析表明,這些分離物的基因組全序列與GenBank中ASSVd基因組核苷酸序列相似度為96%～100%,在蘋果銹果類病毒屬的末端保守區(qū)及中央保守區(qū)保守,在致病區(qū)和左端區(qū)域有突變,一些分離物的突變位點(diǎn)相同。系統(tǒng)發(fā)育分析表明分離物因相同的突變位點(diǎn)而聚類,而與地理來源無關(guān)。

蘋果; 蘋果銹果類病毒; RT-PCR; 變異分析; 系統(tǒng)發(fā)育

蘋果是我國重要的栽培果樹,其栽培面積和產(chǎn)量居世界首位[1]。由病毒和類病毒引起的蘋果病害在我國蘋果產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍,已經(jīng)成為影響蘋果產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素[2]。蘋果銹果類病毒Applescarskinviroid(ASSVd)是馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科Pospiviroidae蘋果銹果類病毒屬Apscarviroid成員[3]。1985年我國學(xué)者陳煒等在國內(nèi)首次報道了ASSVd[4]。1987年Hashimoto等發(fā)表了ASSVd的基因組全序列[3]。ASSVd基因組為一條環(huán)狀的單鏈RNA,全長約330個核苷酸[3],具有5個功能區(qū),形成穩(wěn)定的桿狀或擬桿狀的二級結(jié)構(gòu)[5]。有研究發(fā)現(xiàn)類病毒的保守區(qū)域與復(fù)制密切相關(guān)[6-7],RNA的缺失、插入、替換主要發(fā)生在致病區(qū)和可變區(qū)[8]。關(guān)于變異位點(diǎn)對ASSVd致病性的影響尚無明確數(shù)據(jù),需進(jìn)一步研究。目前發(fā)現(xiàn)ASSVd可侵染蘋果[9]、梨[10]、桃[11]、杏[12]和野櫻桃[13]等植物。植株一旦感染ASSVd,終生帶毒,果樹幼樹期不出現(xiàn)病癥,結(jié)果后病癥顯現(xiàn),果實的食用價值和商品價值大為降低。

當(dāng)前我國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,苗木需求量大,因苗木的調(diào)運(yùn)和無性材料的快繁等因素, ASSVd的發(fā)生呈加重趨勢,在蘋果生產(chǎn)中造成的危害日益嚴(yán)重[2]。為研究ASSVd在我國一些蘋果產(chǎn)區(qū)的發(fā)生和變異情況,本文對采自我國6個蘋果產(chǎn)區(qū)的35份蘋果樣品進(jìn)行檢測,克隆得到30個ASSVd分離物的全序列,通過對全序列的比對分析,發(fā)現(xiàn)了一些相同的變異位點(diǎn),為研究ASSVd的變異和進(jìn)化提供了新的數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 蘋果樣品

2011年-2016年在陜西、山東、山西、河北、北京和黑龍江的蘋果產(chǎn)區(qū)采集有癥狀的蘋果果實樣品和無明顯癥狀的枝條樣品,共35份(表1)。樣品整理后保存于4℃和-20℃。

表1樣品基本信息

Table1Informationofsamples

編號Number采集時間/年-月Samplingtime采集地點(diǎn)Samplingsite品種Variety采樣部位Tissue樣品癥狀表現(xiàn)Symptomonsamplexa?12011-11陜西西安短枝禮富枝條枝條無明顯癥狀(葉片花葉)xa?42011-11陜西西安短枝禮富枝條枝條無明顯癥狀(果實花臉)sxqy?12015-09陜西千陽未知枝條枝條無明顯癥狀sxqy?22015-09陜西千陽未知枝條枝條無明顯癥狀qd?12012-07山東青島SH38枝條枝條無明顯癥狀(果實花臉)qd?22012-07山東青島SH38枝條枝條無明顯癥狀(果實花臉)yt?12012-11山東煙臺富士果實果實花臉qd?32015-09山東青島未知枝條枝條無明顯癥狀qd?42015-09山東青島未知枝條枝條無明顯癥狀qd?52015-09山東青島未知枝條枝條無明顯癥狀qd?62015-09山東青島未知枝條枝條無明顯癥狀qd?72015-09山東青島未知枝條枝條無明顯癥狀qd?82015-09山東青島未知枝條枝條無明顯癥狀sx?12016-04山西瑞陽枝條枝條無明顯癥狀sx?52016-04山西瑞陽枝條枝條無明顯癥狀sx?82016-04山西瑞陽枝條枝條無明顯癥狀sx?142016-04山西瑞陽枝條枝條無明顯癥狀hb?32012-11河北未知(砧木)枝條枝條無明顯癥狀hb?62012-11河北未知(砧木)枝條枝條無明顯癥狀hb?72012-11河北未知(砧木)枝條枝條無明顯癥狀hb?82012-11河北未知(砧木)枝條枝條無明顯癥狀hb?122012-11河北未知(砧木)枝條枝條無明顯癥狀shz2?12012-11北京三合莊富士果實果實花臉cp?12012-11北京昌平富士果實果實銹果cp?22012-11北京昌平富士果實果實花臉mdj?22011-09黑龍江牡丹江金紅123果實果實著色不勻mdj?112011-09黑龍江牡丹江龍豐果實果實著色不勻mdj?122011-09黑龍江牡丹江金紅123果實果實花臉mdj?132011-09黑龍江牡丹江龍冠果實果實畸形592-022015-11黑龍江牡丹江山丁子枝條枝條無明顯癥狀592-032015-11黑龍江牡丹江山丁子枝條枝條無明顯癥狀592-082015-11黑龍江牡丹江山丁子枝條枝條無明顯癥狀592-102015-11黑龍江牡丹江山丁子枝條枝條無明顯癥狀592-202015-11黑龍江牡丹江山丁子枝條枝條無明顯癥狀592-222015-11黑龍江牡丹江山丁子枝條枝條無明顯癥狀

1.2 方法

1.2.1 植物總RNA的提取

取0.1～0.2 g樣品(葉片,枝條韌皮部或果皮)用SiO2吸附法[14]進(jìn)行植物總RNA提取。提取的RNA直接反轉(zhuǎn)錄或-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-PCR檢測

反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL:2.5 mmol /L dNTPs 1.0 μL、5×M-MLV Buffer 4 μL、M-MLV(40 U/μL)0.5 μL、RNase inhibitor(40 U/μL)0.5 μL、隨機(jī)六聚體引物和Oligo(dT)引物各0.5 μL、植物總RNA 3.5 μL,用DEPC水補(bǔ)足至20 μL,42℃水浴反應(yīng)1 h,產(chǎn)物直接進(jìn)行PCR或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照報道的擴(kuò)增ASSVd全基因組序列的引物(正向引物:5′-CCGGTGAGAAAGGAGCTGCCAGCA-3′;反向引物:5′-CCTTCGTCGACGACG-ACAGGTGAG-3′)[5]進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為25 μL:2.5 mmol /L dNTPs 1.0 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.25 μL,正、反向引物各0.5 μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0 μL,用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,67℃退火30 s,72℃延伸40 s,30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆和測序分析

在紫外燈下切下含有目的片段的瓊脂糖凝膠,使用普通DNA凝膠回收試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。將純化的PCR產(chǎn)物連接至克隆載體pMD19-T(simple)上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選單菌落于800 μL含氨芐青霉素(50 μg/mL)的 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),通過菌液PCR驗證鑒定重組質(zhì)粒,每個樣品篩選3個陽性菌液送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.4 序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

用DNAMAN軟件對所得基因序列進(jìn)行分析。通過BLAST(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比對分析目的片段。序列對比運(yùn)用DNAMAN軟件和Multalin在線軟件[15]進(jìn)行,以GenBank中ASSVd標(biāo)準(zhǔn)序列(NC_001340.1)為對比序列。進(jìn)化樹構(gòu)建運(yùn)用ClustalX和MEGA 6.06的鄰接法(neighbor-joining)進(jìn)行,重復(fù)次數(shù)為1 000,以GenBank中ASBVd(NC_001410)、PSTVd(NC_002030)和ADFVd(NC_003463.1)標(biāo)準(zhǔn)序列作為外組對照,其中ASBVd作為不同科的外組對照,PSTVd作為不同屬的外組對照,ADFVd作為同屬的外組對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASSVd檢測結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果表明,從采自陜西的4份樣品(sxqy-1,sxqy-2,xa-1和xa-4),采自山東的8份樣品(qd-1,qd-2,yt-1,qd-3,qd-4,qd-6,qd-7和qd-8),采自河北的5份樣品(hb-3,hb-6,hb-7,hb-8和hb-12),采自北京的3份樣品(shz2-1,cp-1和cp-2)和采自黑龍江的10份樣品(mdj-2,mdj-11,mdj-12,mdj-13,592-02,592-03,592-08,592-10,592-20,592-22)中均檢測到330 bp左右的特異片段,與ASSVd陽性對照樣品檢出的條帶一致,表明樣品被ASSVd侵染。ASSVd的檢測結(jié)果如表2所示。

表2RT-PCR檢測蘋果樣品中ASSVd結(jié)果

Table2ResultssummaryofdetectionofASSVdinapplesamplesusingRT-PCR

采樣地點(diǎn)Collectionsite檢測樣品數(shù)/個NumberofsamplesASSVd陽性樣品數(shù)/個Numberofpositivesamples陽性檢出率/%Detectionrate陜西Shaanxi44100山東Shandong9888．9山西Shanxi400河北Hebei55100北京Beijing33100黑龍江Heilongjiang1010100合計Total353085．7

圖1 我國部分蘋果產(chǎn)區(qū)30個ASSVd分離物基因組核苷酸序列比對Fig.1 Multiple genome sequences alignment of 30 ASSVd isolates from some apple production areas in China

2.2 ASSVd分離物序列測定與變異分析

將30個樣品的PCR產(chǎn)物克隆測序,結(jié)果表明所有片段的長度均為330～333 nt。序列比對結(jié)果表明,擴(kuò)增得到的30個片段與GenBank中ASSVd基因組核苷酸序列一致性為96%～100%,表明這些片段均為ASSVd基因組序列。其中樣品xa-1,xa-4,mdj-2,mdj-11和 mdj-12擴(kuò)增獲得的ASSVd序列與登錄號為AF421195.1的核苷酸序列一致性均為100%;樣品cp-1,cp-2和shz2-1擴(kuò)增得到的ASSVd序列與登錄號為AY972082.1的核苷酸序列一致性分別為100%,99%和98%;樣品qd-1,qd-2,hb-6,hb-7和hb-8擴(kuò)增獲得的ASSVd序列與登錄號為HQ326093.1的核苷酸序列一致性均為99%;樣品qd-3,qd-7,592-02,592-08,592-10,592-20,qd-8和qd-4擴(kuò)增得到的ASSVd序列與登錄號為KC110860.1的核苷酸序列一致性分別為99%,99%,99%,99%,99%,99%,98%和96%;樣品592-03擴(kuò)增出的ASSVd序列與登錄號為HQ840722.1的核苷酸序列一致性為98%;從樣品yt-1擴(kuò)增出的ASSVd序列與登錄號為KC110858.1的核苷酸序列一致性為97%;從樣品mdj-13,592-22和qd-6擴(kuò)增出的ASSVd序列與登錄號為KU507023.1的核苷酸序列一致性分別為99%,98%和96%;從樣品hb-3,hb-12,sxqy-1和sxqy-2擴(kuò)增出的ASSVd序列與登錄號為KP765428.1的核苷酸序列一致性分別為98%,98%,97%和97%。以樣品編號命名上述ASSVd分離物。

以GenBank中ASSVd標(biāo)準(zhǔn)序列(NC_001340.1)為對比序列,運(yùn)用Multalin在線軟件比對所有30個分離物的基因組序列,結(jié)果如圖1所示。所有30條序列及ASSVd標(biāo)準(zhǔn)序列(NC_001340.1)在蘋果銹果類病毒屬的末端保守區(qū)(TCR)及中央保守區(qū)(CCR)兩個保守區(qū)保守,只有qd-6分離物在第12位有T-A突變。變異位點(diǎn)集中在致病區(qū)(P區(qū))與左末端區(qū)(TLR)交界處。進(jìn)一步分析不同分離物的序列,發(fā)現(xiàn)分離物xa-1,xa-4,sxqy-1,sxqy-2,qd-1,qd-2,hb-3,hb-6,hb-7,hb-8,hb-12,cp-1,cp-2,shz2-1,mdj-2,mdj-11和mdj-12與參考序列一致性較高;分離物yt-1,qd-3,qd-4,qd-6,qd-7,qd-8,mdj-13,509-02,509-03,509-08,509-10,509-20和509-22在第39位存在C-A突變,第251位存在G-A突變,第261位和第262位插入T堿基,第267位存在G-A突變,第290位存在G-T突變,第291位存在A-G突變。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

進(jìn)化樹分析結(jié)果如圖2所示。

圖2 我國部分蘋果產(chǎn)區(qū)ASSVd分離物系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of genomic sequences of ASSVd isolates from some apple production areas in China

30個分離物按突變位點(diǎn)的不同聚為2組,聚集與地理來源無關(guān)。與ASSVd參考序列一致性高的分離物xa-1,xa-4,sxqy-1,sxqy-2,qd-1,qd-2,hb-3,hb-6,hb-7,hb-8,hb-12,cp-1,cp-2,shz2-1,mdj-2,mdj-11和mdj-12聚為一組;分離物yt-1,qd-3,qd-4,qd-6,qd-7,qd-8,mdj-13,509-02,509-03,509-08,509-10,509-20和509-22聚為一組。這些組與外組對照分區(qū)明顯。

3 討論

近年來,ASSVd在我國蘋果產(chǎn)區(qū)的發(fā)生率逐年增加,若不及時、正確地防控,將對我國蘋果產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重危害。本研究采集我國6個蘋果產(chǎn)區(qū)的疑似被ASSVd侵染的蘋果果實樣品和一些無癥狀的枝條樣品35份,利用RT-PCR方法進(jìn)行ASSVd檢測,結(jié)果表明,采自陜西、山東、河北、北京及黑龍江的蘋果樣品檢測到ASSVd,樣品的陽性檢出率為88.9%～100%。這些數(shù)據(jù)表明我國一些蘋果產(chǎn)區(qū)有ASSVd發(fā)生。將來的工作將在更廣地區(qū)采集更多樣品進(jìn)一步調(diào)查我國蘋果產(chǎn)區(qū)的ASSVd發(fā)生情況。

本研究成功克隆了30個ASSVd分離物的基因組全序列,序列比對結(jié)果表明這些序列含有相同的保守區(qū)域(CCR和TCR)。變異位點(diǎn)集中在致病區(qū)域和可變區(qū)域,這與之前的研究發(fā)現(xiàn)類病毒RNA的缺失、插入、替換主要發(fā)生在致病區(qū)和可變區(qū)的結(jié)果一致[8]。關(guān)于變異位點(diǎn)對ASSVd致病性的影響尚無明確數(shù)據(jù),需進(jìn)一步研究。進(jìn)化樹分析表明所有30條ASSVd序列聚集成兩組,并且分離物因相同的變異位點(diǎn)而分組聚類。變異位點(diǎn)分析表明來自同一品種的分離物亦無特異性變異,同一地理來源的分離物無特異性變異,其中黑龍江的‘山丁子’樣品和山東部分樣品存在相同的變異位點(diǎn),推測這可能與苗木的調(diào)運(yùn)和接穗的隨意嫁接有關(guān)。

鑒于ASSVd的發(fā)生對我國蘋果生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害,并有逐年加重的趨勢,應(yīng)及時采取防控措施,切斷ASSVd傳播源頭,盡早更換病樹。ASSVd的傳播途徑主要有種子[16]、帶毒枝條嫁接以及修剪工具導(dǎo)致的污染傳播[17]。因為目前無有效的防治藥劑,因此防控ASSVd的根本措施應(yīng)以預(yù)防為主,選用無毒苗木。

[1] 楊振鋒,叢佩華,聶繼云,等.我國蘋果產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、存在問題及建議[J].北方果樹,2006(5):34-36.

[2] 郝璐,葉婷,陳善義,等.我國北方部分蘋果主產(chǎn)區(qū)病毒病的發(fā)生與檢測[J].植物保護(hù),2015,41(2):158-161.

[3] Hashimoto J,Koganezawa H.Nucleotide sequence and secondary structure ofApplescarskinviroid[J]. Nucleic Acids Research,1987,15(17):7045-7052.

[4] 陳煒,田波.蘋果銹果病組織中發(fā)現(xiàn)的類病毒RNA [J].科學(xué)通報,1985,30(17):1360.

[5] Hadidi A,Huang C,Hammond R W,et al.Homology of the agent associated with dapple apple disease to apple scar skin viroid and molecular detection of these viroids [J].Phytopathology, 1990, 80(3):263-268.

[6] Baumstark T,Schroder A R,Riesner D.Viroid processing: switch from cleavage to ligation is driven by a change from a tetraloop to a 1oop E conformation[J].The EMBO Journal,1997,16(3):599-610.

[7] Gas M E,Hernndez C,Flores R,et al.Processing of nuclear viroidsinvivo:an interplay between RNA conformations [J].PLoS Pathogens,2007,3(11):1813-1826.

[8] Kyriakopoulou P E,Osaki H,Zhu Shuifang,et al.Applescarskinviroidin pear [M]∥ Hadidi A,Flores R,Randles J W.Viroids.Australia:CSIRO Publishing,2003:142-145.

[9] Puchta H,Luckinger R,Yang X C,et al.Nucleotide sequence and secondary structure ofApplescarskinviroid(ASSVd) from China [J].Plant Molecular Biology,1990,14(6):1065-1067.

[10] Kyriakopoulou P E,Hadidi A.Natural infection of wild and cultivated pears withApplescarskinviroidin Greece [J].Acta Horticulturae,1998(472):617-625.

[11] 趙英,牛建新.新疆桃樹上蘋果銹果類病毒(ASSVd)的檢測與全序列分析[J].果樹學(xué)報,2008,25(2):274-276.

[12] Zhao Ying, Niu Jianxin. Apricot is a new host ofApplescarskinviroid[J].Australasian Plant Disease Notes,2008,3(1):98-100.

[13] Walia Y,Dhir S,Bhadoria S,et al.Molecular characterization ofApplescarskinviroidfrom Himalayan wild cherry [J].Forest Pathology,2012,42:84-87.

[14] 董雅鳳,張尊平,楊俊玲,等.葡萄卷葉病毒3 RT-PCR檢測技術(shù)研究[J].中國果樹,2005(6):9-12.

[15] Walia Y,Kumar Y,Rana T,et al.Molecular characterization and variability analysis ofApplescarskinviroidin India [J].Journal of General Plant Pathology,2009,75:307-311.

[16] 梁成林,趙玲玲,宋來慶,等.幾種蘋果實生砧木種子傳毒潛力檢測[J].果樹學(xué)報,2014,31(6):1164-1169.

[17] 白海霞,高彥,賈少武,等.選用蘋果無毒苗木防控病毒病危害[J].西北園藝(果樹),2015(3):13-15.

(責(zé)任編輯： 楊明麗)

DetectionandfullnucleotidesequencesanalysisofApplescarskinviroidisolatesinsomeappleproducingareasofChina

Chen Ranran, Xie Jipeng, Ye Ting, Dong Yunhao, Guo Liyun, Zhou Tao

(DepartmentofPlantPathology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

In recent years, dappling, scarring and malformation on apple fruits caused byApplescarskinviroid(ASSVd) is increasing and seriously affects apple production and apple industry development in China. To understand the occurrence and variations of ASSVd in apple production regions of China, 35 samples were collected from six major apple producing areas including Shaanxi, Shandong, Shanxi, Hebei, Beijing and Heilongjiang provinces. Reverse transcription-PCR and sequence analysis showed that 30 isolates of ASSVd were obtained with genome sizes of 330-333 nucleotides, which had 96%-100% identities with sequences of ASSVd in GenBank, and had conserved terminal conserved region (TCR) and central conserved region (CCR). Mutations were found in pathogenic region and terminal left region. Interestingly, same mutation sites were found in some isolates. Phylogenetic analysis showed that these isolates clustered due to mutation sites on ASSVd genome while no relation to geographical origins.

apple;Applescarskinviroid; RT-PCR; variation analysis; phylogenesis

2016-11-22

2017-01-20

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蘋果)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(nycytx-08-04-02); 國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203076-02)

* 通信作者 E-mail: ppguo@cau.edu.cn;taozhoucau@cau.edu.cn

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.015