楊志強(qiáng), 王麗艷, 梁洪宇, 劉 旭, 白雪萍, 趙長(zhǎng)江, 張海燕

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 黑龍江省普通高等學(xué)校寒地作物種質(zhì)改良與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 大慶 163319)

短管赤眼蜂Argonaute蛋白基因家族鑒定及表達(dá)分析

楊志強(qiáng)#, 王麗艷#, 梁洪宇, 劉 旭, 白雪萍, 趙長(zhǎng)江, 張海燕*

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 黑龍江省普通高等學(xué)校寒地作物種質(zhì)改良與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 大慶 163319)

動(dòng)物和植物Argonaute蛋白在RNA誘導(dǎo)的基因沉默中發(fā)揮重要作用。本研究采用生物信息學(xué)方法在全基因組水平鑒定短管赤眼蜂Argonaute蛋白基因家族,鑒定并命名6個(gè)TpAGO蛋白。蛋白結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化分析將TpAGO家族蛋白分為PIWI和Ago兩個(gè)亞家族。TpAGO蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的數(shù)量比例差異不大，分布卻存在一定差異,其中α-螺旋分布差異尤為顯著。TpAGO蛋白基因結(jié)構(gòu)表現(xiàn)明顯的多樣性,基因外顯子數(shù)量差異明顯,從1到20個(gè)數(shù)量不等;Ka/Ks分析表明TpAGO2和TpAGO5,TpAGO3和TpAGO4兩對(duì)基因間進(jìn)化動(dòng)力為正選擇作用,其他組合間表現(xiàn)為純化選擇。EST表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)TpAGO基因在昆蟲(chóng)的卵期、幼蟲(chóng)期、蛹期和成蟲(chóng)期均有不同程度的表達(dá),而且靶向EST在同一物種中具有單一性別(雌性或雄性)表達(dá)特性,表明短管赤眼蜂TpAGO蛋白基因可參與赤眼蜂性別及發(fā)育調(diào)控。該研究不僅有助于揭示赤眼蜂產(chǎn)雌孤雌生殖的表觀遺傳機(jī)理,也有助于推動(dòng)赤眼蜂等天敵的生防應(yīng)用。

短管赤眼蜂; Argonaute; 基因家族; 生物信息學(xué)

害蟲(chóng)生物防治是有害生物治理中最成功、最節(jié)約和環(huán)境安全的方法。理論研究的核心是明確各類天敵的特性及其對(duì)害蟲(chóng)的控制功能,以及天敵和害蟲(chóng)之間相互作用規(guī)律[1]。赤眼蜂屬膜翅目,是一種卵寄生性天敵昆蟲(chóng),目前已成為害蟲(chóng)生物防治中應(yīng)用最多,范圍最廣的害蟲(chóng)天敵之一。其中,感染共生菌Wolbachia的赤眼蜂具有更好的應(yīng)用前景,因其營(yíng)產(chǎn)雌孤雌生殖方式致使赤眼蜂后代完全為雌性,同比大大提高了天敵赤眼蜂的寄生能力,即有效增強(qiáng)了天敵對(duì)害蟲(chóng)的控制能力,提高了生物防治效果。盡管已有大量研究表明,赤眼蜂的產(chǎn)雌孤雌生殖方式是由Wolbachia感染所決定的[2-4],但是Wolbachia與赤眼蜂互作調(diào)控產(chǎn)雌孤雌生殖的分子機(jī)理至今未見(jiàn)明確報(bào)道。

MicroRNAs(miRNA)是內(nèi)源非編碼小RNA,在細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,涉及發(fā)育、分化、凋亡和免疫等過(guò)程,值得一提的是,miRNA也參與Wolbachia與宿主互作調(diào)控[5]。那么,小RNA沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)的重要組成部分Argonaute蛋白(Argonaute protein)在Wolbachia與宿主互作中的功能如何？Argonaute 蛋白是一個(gè)高度保守的家族,含有PIWI和PAZ兩個(gè)共同的結(jié)構(gòu)域,存在于絕大部分真核生物中。Argonaute蛋白在各個(gè)物種間的數(shù)量差距很大,其中人類Homosapiens含有8種[6],擬南芥Arabidopsisthaliana中有10種[7]、果蠅Drosophilamelanogaster中有 5種、家蠶Bombyxmori4種[8],秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditiselegans27種[9]。但是,迄今為止,關(guān)于赤眼蜂Argonaute蛋白及其功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用生物信息學(xué)方法,在短管赤眼蜂Trichogrammapretiosum基因組水平分離鑒定Argonaute蛋白基因,在對(duì)基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化分析的同時(shí),進(jìn)行了基于EST的表達(dá)譜分析,探討Argonaute蛋白基因的功能。該研究有助于揭示Argonaute蛋白及其協(xié)調(diào)小RNA途徑在赤眼蜂生長(zhǎng)發(fā)育和性別調(diào)控中的作用,為在表觀遺傳學(xué)水平解析赤眼蜂產(chǎn)雌孤雌生殖機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因家族成員鑒定

利用已發(fā)表的家蠶、果蠅Argonaute蛋白序列為種子序列,通過(guò)BLASTp在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索短管赤眼蜂基因組(JARR00000000.1);同時(shí),以蛋白保守結(jié)構(gòu)域PIWI和PAZ為種子在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索短管赤眼蜂基因組,分離鑒定短管赤眼蜂Argonaute蛋白。然后,使用BioEdit軟件構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù),對(duì)上述兩種方法獲得的短管赤眼蜂Argonaute蛋白進(jìn)行篩選去冗余并命名TpAGO。采用Expasy(http:∥web.expasy.org/protparam/)分析蛋白分子式、分子量和等電點(diǎn)等數(shù)據(jù);采用WoLF PSORT(http:∥www.genscript.com/tools/wolf-psort)對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2 氨基酸比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

使用DNAMAN對(duì)短管赤眼蜂TpAGO蛋白進(jìn)行比對(duì)作圖;使用MEGA7.0對(duì)不同昆蟲(chóng)AGO蛋白采用鄰接法比對(duì)并生成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),進(jìn)行1 000次Bootstrap檢驗(yàn)。

1.3 蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA 在線分析軟件(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu);使用Expasy(https:∥swissmodel.expasy.org/interactive)分析蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 基因結(jié)構(gòu)分析

短管赤眼蜂TpAGO全長(zhǎng)基因提交GSDS軟件(http:∥gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1.5 堿基替換率分析

將短管赤眼蜂的TpAGO基因的編碼區(qū)(去終止子)通過(guò)MEGA7.0的ClustalW比對(duì),然后使用DNAsp軟件計(jì)算TpAGO基因的非同義替換率Ka、同義替換率Ks以及他們的比值(Ka/Ks)。

1.6 基因表達(dá)分析

使用短管赤眼蜂TpAGO基因編碼序列在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTn分析;同時(shí)使用TpAGO氨基酸序列在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行tBLASTn分析,獲得TpAGO基因的EST表達(dá)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 短管赤眼蜂TpAGO蛋白基因的鑒定

通過(guò)兩種方法共獲得191條序列,一方面采用DNAMAN進(jìn)行序列分析,去除冗余序列,另一方面利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析,最終獲得6個(gè)非冗余的短管赤眼蜂AGO蛋白,分別命名為T(mén)pAGO1至TpAGO6(表1)。TpAGO蛋白編碼基因長(zhǎng)度介于2 364 bp(TpAGO2.1)至3 144 bp(TpAGO4)之間。其中,4個(gè)TpAGO蛋白預(yù)測(cè)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核定位,包括TpAGO1、TpAGO2、TpAGO3和TpAGO4;2個(gè)TpAGO蛋白預(yù)測(cè)為線粒體或細(xì)胞核定位,分別為T(mén)pAGO5和TpAGO6。

表1短管赤眼蜂TpAGO蛋白基因特征1)

Table1CharactersofTpAGOinTrichogrammapretiosum

蛋白名稱ProteinnameNCBI登錄號(hào)Proteinregistrationno．開(kāi)放閱讀框/bpOpenreadingframe氨基酸Aminoacids分子式Molecularformula分子量/kDMolecularweight亞細(xì)胞定位SubcellularlocalizationTpAGO1XP＿014222947．12748915C4534H7194N1298O1357S36102．76Nuc/CytTpAGO2XP＿014229707．12364787C4032H6347N1135O1163S3590．45Cyt/NucTpAGO3XP＿014222980．12727908C4553H7349N1275O1346S38102．71Cyt/NucTpAGO4XP＿014235216．131441047C5198H8245N1523O1550S38118．09Nuc/CytTpAGO5XP＿014225266．12691896C4478H7078N1272O1282S49100．82Mit/NucTpAGO6XP＿014228304．12856951C4720H7451N1343O1377S47106．55Mit/Nuc

1) Nuc:細(xì)胞核; Cyt:細(xì)胞質(zhì); Mit:線粒體。

Nuc:cell nucleus, Cyt:cytoplasm, Mit:mitochondria.

2.2 短管赤眼蜂AGO蛋白結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用DNAMAN對(duì)鑒定獲得的6種TpAGO蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析,均具有ArgoN、PAZ和PIWI保守結(jié)構(gòu)域,氨基酸組成變異較大(圖1)。通過(guò)鄰接法對(duì)鑒定的6個(gè)短管赤眼蜂、4個(gè)家蠶、5個(gè)黑腹果蠅、3個(gè)麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis的Argonaute蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),供試的18個(gè)Argonaute蛋白可分為兩大亞家族,分別為Ago亞家族和PIWI亞家族。PIWI亞家族蛋白涵蓋4個(gè)物種的10個(gè)成員,含有典型的PAZ、PIWI和ArgoN結(jié)構(gòu)域,包括短管赤眼蜂TpAGO1、TpAGO2和TpAGO3,果蠅DmPIWI、DmAUB和DmAGO3,家蠶BmPIWI、BmAGO3,麗蠅蛹集金小蜂NvAUB和NvAGO3。其中,短管赤眼蜂TpAGO1和TpAGO2與NvAUB、DmPIWI和DmAUB、BmPIWI親緣關(guān)系較近,TpAGO3與NvAGO3、DmAGO3和BmAGO3親緣關(guān)系較近。Ago亞家族蛋白涵蓋4個(gè)物種的8個(gè)成員,含有典型的PAZ、PIWI、ArgoN和Argol1結(jié)構(gòu)域(圖1),包括短管赤眼蜂TpAGO4、TpAGO5和TpAGO6,果蠅DmAGO1和DmAGO2,家蠶BmAGO1和BmAGO2,麗蠅蛹集金小蜂。其中,短管赤眼蜂TpAGO5和TpAGO6與DmAGO1和BmAGO1親緣關(guān)系較近;TpAGO4與NvAGO2、DmAGO2和BmAGO2親緣關(guān)系較近。

圖1 短管赤眼蜂TpAGO蛋白序列同源性及保守功能區(qū)分析Fig.1 Homology and conserved domains of TpAGO proteins

圖2 昆蟲(chóng)Argonaute蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of insect Argonaute proteins

2.3 短管赤眼蜂TpAGO基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化動(dòng)力分析

對(duì)6個(gè)短管赤眼蜂TpAGO基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖3)發(fā)現(xiàn),AGO蛋白基因結(jié)構(gòu)表現(xiàn)明顯的多樣性,基因外顯子數(shù)量差異明顯,從1到20個(gè)數(shù)量不等,與蛋白氨基酸結(jié)構(gòu)和亞家族分類無(wú)明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系。其中,TpAGO1含有10個(gè)外顯子,TpAGO2有8個(gè)外顯子,TpAGO3含有11個(gè)外顯子,TpAGO4含有20個(gè)外顯子,TpAGO6只有1個(gè)外顯子。值得注意的是TpAGO5含有12個(gè)外顯子,且內(nèi)含子跨度較大,最大內(nèi)含子跨度為32 623 bp,而且內(nèi)含子中間有許多未知序列,該基因結(jié)構(gòu)或基因組序列需進(jìn)一步確證。此外6個(gè)TpAGO基因終止密碼子也不完全相同,除TpAGO6終止密碼子為tag外,其余5個(gè)TpAGO基因的終止子均為taa。

另外,通過(guò)對(duì)短管赤眼蜂TpAGO基因編碼區(qū)序列堿基替代率分析(表2)發(fā)現(xiàn),Ka/Ks比值高于1的組合有TpAGO2和TpAGO5,TpAGO3和TpAGO4,表明這兩對(duì)基因間(或者兩對(duì)基因所在兩個(gè)亞家族間)進(jìn)化動(dòng)力為正選擇作用。其他組合的Ka/Ks比值均小于1,表現(xiàn)為純化選擇。但是AGO基因家族成員間Ka/Ks比值整體較高,最低的為0.732 1,表明該家族基因可能經(jīng)受較大的選擇壓力,可能與基因結(jié)構(gòu)的多樣性有一定關(guān)聯(lián)。

表2 短管赤眼蜂TpAGO基因的Ka/Ks比值

2.4 短管赤眼蜂TpAGO蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)軟件對(duì)6個(gè)TpAGO蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(表3,圖4,5),4種二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲在AGO蛋白間數(shù)量比例差異不大,分布卻存在一定差異(圖4),但是AGO蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)基本相似(圖5),相差不大。供試的6個(gè)AGO蛋白中α-螺旋氨基酸數(shù)量比例在28.37%～40.64%之間;延伸鏈的氨基酸數(shù)量比例在17.86%～25.16%之間;β-折疊的氨基酸數(shù)量比例在7.59%～10.29%之間;無(wú)規(guī)則卷曲的氨基酸數(shù)量比例在30.07%～44.70%之間。而且,均以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲兩種二級(jí)結(jié)構(gòu)為主。其中,α-螺旋分布在AGO蛋白間存在一定差異(圖4),PIWI亞家族蛋白(TpAGO1、TpAGO2和TpAGO3)的N端α-螺旋分布明顯高于Ago亞家族蛋白(TpAGO4、TpAGO5和TpAGO6)。上述結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與蛋白進(jìn)化存在明顯的相關(guān)性,表明兩個(gè)亞家族成員在功能進(jìn)化上存在一定分歧。

表3短管赤眼蜂TpAGO蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

Table3SecondarystructureoftheTpAGOproteins

二級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸數(shù)∥百分比/% Number∥PercentageofAAα?螺旋Alphahelix延伸鏈Extendedstrandβ?折疊Betaturn無(wú)規(guī)則卷曲RandomcoilTpAGO6296∥31．13195∥20．5076∥7．99384∥40．38TpAGO5276∥30．80196∥21．8868∥7．59356∥39．73TpAGO4297∥28．37187∥17．8695∥9．07468∥44．70TpAGO3369∥40．64181∥19．9385∥9．36273∥30．07TpAGO2264∥33．55198∥25．1681∥10．29244∥31TpAGO1323∥35．30192∥20．9876∥8．31324∥35．41

圖4 短管赤眼蜂TpAGO蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of the TpAGO proteins

2.5 短管赤眼蜂TpAGO基因在發(fā)育階段的表達(dá)

通過(guò)TpAGO基因在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析,EST靶向序列以BLASTn比對(duì)中E值小于2e-13或tBLASTn比對(duì)中E值小于1e-67為標(biāo)準(zhǔn),獲得短管赤眼蜂TpAGO基因表達(dá)信息(表4),結(jié)果表明TpAGO基因在昆蟲(chóng)的卵期、幼蟲(chóng)期、蛹期和成蟲(chóng)期均有不同程度的表達(dá),而且靶向EST在同一物種中具有單一性別(雌性或雄性)表達(dá)特性。其中TpAGO1基因靶向EST來(lái)源包括麗蠅蛹集金小蜂雄性蛹,埃及伊蚊Aedesaegypti雌成蟲(chóng),擬果蠅雌成蟲(chóng),褐飛虱Nilaparvatalugens幼蟲(chóng)和胡蜂Nasoniagiraulti幼蟲(chóng)。TpAGO2基因靶向EST來(lái)源包括擬果蠅雌成蟲(chóng),埃及伊蚊雌成蟲(chóng),麗蠅蛹集金小蜂蛹和成蟲(chóng),胡峰蛹和成蟲(chóng)、埃及伊蚊幼蟲(chóng),褐飛虱幼蟲(chóng)和玉帶鳳蝶Papiliopolytes蛹。TpAGO3基因靶向EST來(lái)源包括麗蠅蛹集金小蜂雌、雄蛹,埃及伊蚊雌成蟲(chóng),茶足柄瘤蚜繭蜂Lysiphlebustestaceipes成蟲(chóng)。TpAGO4基因靶向EST來(lái)源包括麗蠅蛹集金小蜂雄蛹,麗蠅蛹集金小蜂雌成蟲(chóng),赤擬谷盜Triboliumcastaneum雌性卵,埃及伊蚊雌成蟲(chóng)。TpAGO5基因靶向EST來(lái)源包括雄麗蠅蛹集金小蜂雄性蛹和成蟲(chóng),豌豆長(zhǎng)管蚜Acyrthosiphonpisum雄性若蟲(chóng),桃蚜Myzuspersicae雌成蟲(chóng),黑腹果蠅和螺旋蠅Cochliomyiahominivorax卵,二斑葉螨Tetranychusurticae卵,食糞金龜Onthophagustaurus蛹,刺舌蠅Glossinamorsitans成蟲(chóng)。TpAGO6基因靶向EST來(lái)源包括麗蠅蛹集金小蜂雄性蛹和成蟲(chóng),家蠶雌性蛹,桃蚜雌成蟲(chóng),果蠅卵,豌豆長(zhǎng)管蚜若蟲(chóng),食糞金龜蛹,玉帶鳳蝶成蟲(chóng)、三角渦蟲(chóng)Dugesiajaponica、赤擬谷盜、刺舌蠅和岡比亞按蚊Anophelesgambiae成蟲(chóng)。

表4短管赤眼蜂TpAGO基因EST表達(dá)譜1)

Table4ExpressionprofilesofTpAGOgenesbyESTdata

續(xù)表4Table4(Continued)

性別 Sex雄性Male雌性Female混合Mix發(fā)育階段 Developmentalstage卵期Egg幼蟲(chóng)期Larva蛹期Pupa成蟲(chóng)AdultTpAGO6N．vGE426508．1，N．vGE354623．1M．pEE264736．1，P．pGW819200．1，B．mFY018570．1G．mDV618432．1，D．mAI455659．2，D．mAA390688．1，D．mBP544019．1D．mAI455659．2，D．mAA390688．1，D．mBP544019．1A．pCV842652．1N．vGE354623．1，O．tFG542481．1，B．mFY018570．1N．vGE426508．1，D．jFY948757．1，T．cDT777867．1，G．mDV618432．1，M．pEE264736．1，P．pGW819200．1，A．gBM584762．1

1) 斜體表示使用BLASTn對(duì)EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),其余為tBLASTn對(duì)EST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。N.v:麗蠅蛹集金小蜂; N.l:褐飛虱; N.g:胡蜂; A.a:埃及伊蚊; A.p:豌豆長(zhǎng)管蚜;A.g:岡比亞按蚊;D.s:擬果蠅; D.j:三角渦蟲(chóng); D.m:黑腹果蠅; L.t:茶足柄瘤蚜繭蜂; P.p:玉帶鳳蝶; C.h:螺旋蠅; M.p:桃蚜; T.c:赤擬谷盜; T.u:二斑葉螨;G.m:刺舌蠅; O.t:食糞金龜; B.m:家蠶。

Genes in italic are analyzed by BLASTn in the EST database, and the remaining by tBLASTn. N.v:Nasoniavitripennis; N.l:Nilaparvatalugens; N.g:Nasoniagiraulti; A.a:Aedesaegypti; A.p:Acyrthosiphonpisum; A.g:Anophelesgambiae; D.s:Drosophilasimulans; D.j:Dugesiajaponica; D.m:Drosophilamelanogaster; L.t:Lysiphlebustestaceipes; P.p:Papiliopolytes; C.h:Cochliomyiahominivorax; M.p:Myzuspersicae; T.c:Triboliumcastaneum; T.u:Tetranychusurticae; G.m:Glossinamorsitansmorsitans; O.t:Onthophagustaurus; B.m:Bombyxmori.

3 結(jié)論與討論

昆蟲(chóng)中小分子RNA可分為3種,siRNA(small interfering RNA)、miRNA(microRNA)及piRNA(PIWI-interacting RNA)。在siRNA通路中,RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)中的AGO-2與siRNA雙鏈體(siRNA duplex)的引導(dǎo)鏈(guide strand)結(jié)合,同時(shí)切割siRNA雙鏈體的另一條過(guò)客鏈(passenger stand)使其脫離復(fù)合體;然后AGO-2蛋白通過(guò)siRNA引導(dǎo)鏈連接序列互補(bǔ)的靶mRNA,促成靶基因的沉默。在miRNA通路中,AGO-1蛋白與miRNA(引導(dǎo)鏈)/miRNA*(過(guò)客鏈)結(jié)合,分離miRNA*[10];然后,與靶基因互補(bǔ)的miRNA能夠促使AGO-1對(duì)靶標(biāo)mRNA切割[11]。在piRNA通路中,PIWI亞家族成員參與調(diào)控[12-13],piRNA中多為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座子的反義鏈,PIWI和Aub蛋白與它們結(jié)合,引導(dǎo)并切割正義的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生本來(lái)的正義piRNA[14],AGO-3結(jié)合正義piRNA,并切割來(lái)源于不同逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子分化的反義轉(zhuǎn)錄本[15]。

Argonaute 蛋白家族是一個(gè)高度保守的家族,該蛋白以基因家族的形式存在于絕大部分真核生物中。果蠅含有5 個(gè)特征性的Argonaute 蛋白:DmPiwi、DmAubergine、DmAgo-l、DmAgo-2 和DmAgo-3,其中DmPIWI、DmAubergine 和DmAgo-3 都屬于PIWI 亞家族[16]。而DmPIWI和DmAub蛋白的突變會(huì)影響果蠅胚胎發(fā)育。PIWI亞家族蛋白在果蠅中影響轉(zhuǎn)基因調(diào)節(jié)的共抑制作用[17],參與生殖干細(xì)胞的發(fā)育調(diào)節(jié)[18]。DmAub蛋白可以通過(guò)調(diào)節(jié)oskar和gurken的翻譯及極細(xì)胞的形成來(lái)影響胚胎發(fā)育,DmAub蛋白也可以通過(guò)睪丸中的stellate調(diào)節(jié)抑制來(lái)體現(xiàn)它的必要性[19]。DmAGO1和DmAGO2基因表達(dá)貫穿果蠅整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期,其中DmAGO1對(duì)于胚胎的發(fā)育系統(tǒng)有正調(diào)節(jié)作用。而且,DmAGO1與DmAGO2也可以在生殖系統(tǒng)外表達(dá),具有更多的功能。另外,家蠶中的Argonaute 家族已經(jīng)被鑒定出來(lái),包括BmAgo-1、BmAgo-2、BmAgo-3 和BmPIWI,且在數(shù)量和序列上都與其他昆蟲(chóng)是保守的[7]。前兩者屬于Argonaute 亞家族,分別在siRNA/miRNA 通路中發(fā)揮作用[20-21],后兩者屬于PIWI亞家族,在家蠶的生殖器官中表達(dá)量較高[20]。上述研究表明,Argonaute蛋白極有可能參與赤眼蜂生長(zhǎng)發(fā)育和性別調(diào)控,也有可能參與Wolbachia感染對(duì)宿主赤眼蜂產(chǎn)雌孤雌生殖的分子調(diào)控。

本研究首次在短管赤眼蜂全基因組水平分離Argonaute蛋白,鑒定的6個(gè)TpAGO蛋白基因都含有典型的PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域,與果蠅和家蠶的Argonaute蛋白基因結(jié)構(gòu)基本一致。短管赤眼蜂TpAGO1和TpAGO2與NvAUB,DmPIWI和DmAUB,BmPIWI親緣關(guān)系較近,推測(cè)赤眼蜂TpAGO1-2可能與果蠅和家蠶AGO蛋白功能相近,參與短管赤眼蜂生殖干細(xì)胞的形成,以及在赤眼蜂piRNA通路中起重要作用。TpAGO3與NvAGO3、DmAGO3和BmAGO3親緣關(guān)系較近,推測(cè)赤眼蜂TpAGO3可能與家蠶AGO3蛋白功能相近,在幼蟲(chóng)期到成蟲(chóng)期的表達(dá)量明顯不同,可能參與了幼蟲(chóng)組織的降解或蛹/成蟲(chóng)組織的生成等發(fā)育調(diào)節(jié)活動(dòng)。短管赤眼蜂TpAGO5和TpAGO6與DmAGO1和BmAGO1親緣關(guān)系較近,推測(cè)赤眼蜂TpAGO5-6可能與果蠅和家蠶AGO1蛋白功能相近,參與胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)。TpAGO4與NvAGO2,DmAGO2和BmAGO2親緣關(guān)系較近,推測(cè)與果蠅DmAGO2功能相似,參與胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)。本研究基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)揭示的短管赤眼蜂TpAGO基因表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 供試6個(gè)TpAGO基因可能參與赤眼蜂性別調(diào)控,其中,TpAGO4-6不僅在赤眼蜂卵期高表達(dá),與親緣聚類結(jié)果相近,而且在蛹期和成蟲(chóng)期也具有較高表達(dá);TpAGO1-3多在蛹期和成蟲(chóng)期有較高表達(dá),在卵期沒(méi)有表達(dá)。上述結(jié)果表明赤眼蜂6個(gè)TpAGO有可能都參與分裂期性別調(diào)控,但是不同亞家族在生長(zhǎng)發(fā)育階段具有明確的分工。

另外,TpAGO蛋白基因結(jié)構(gòu)表現(xiàn)明顯的多樣性,基因外顯子數(shù)量差異明顯,從1到20個(gè)數(shù)量不等,可能與該家族基因Ka/Ks值偏高,最低的為0.732 1,存在較高的進(jìn)化選擇壓力有關(guān)。其中,TpAGO2和TpAGO5,TpAGO3和TpAGO4兩對(duì)基因間Ka/Ks值大于1,進(jìn)化動(dòng)力為正選擇作用,其他組合間表現(xiàn)為純化選擇。值得一提的是,TpAGO4與其他的TpAGO蛋白基因相差較大,如編碼蛋白長(zhǎng)度最長(zhǎng)、分子量、外顯子數(shù)最多,在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上與果蠅AGO2同源,可能參與siRNA通路對(duì)胚胎發(fā)育的調(diào)控。

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(責(zé)任編輯： 田 喆)

IdentificationandexpressionanalysisofArgonauteproteingenefamilyinTrichogrammapretiosum

Yang Zhiqiang, Wang Liyan, Liang Hongyu, Liu Xu, Bai Xueping, Zhao Changjiang, Zhang Haiyan

(CollegeofAgronomy,KeyLaboratoryofCropGermplasmImprovementandCultivationinColdRegionsofHeilongjiangProvincialHigher-EducationInstitutions,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China)

The Argonaute family play an important role in gene silencing of RNA induction in plants and animals. Six Argonaute proteins were identified and named in genome-wide level inTrichogrammapretiosumby using the bioinformatics methods. Analysis results of protein structure and phylogenetic analysis showed that TpAGO family proteins were divided into two subgroups, PIWI and Ago, and the numbers of secondary structures of TpAGO protein were similar, while the distribution was different among TpAGOs, especially the helix structure was differently distributed. The gene structure of TpAGOs showed obvious diversity, and the exon numbers varied significantly, ranging from 1 to 20. The evolutionary powers of two pairs of genes were positive selection, including TpAGO2 and TpAGO5, TpAGO3 and TpAGO4, and other combinations were driven by purification options. Expressional profiles by ESTs showed that TpAGO was expressed in different developmental stages, including egg, larval, pupal and adult stages, and worked in single gender (female or male) in the same species, which suggested that TpAGOs were involved in sex and development regulation ofT.pretiosum. This research helps to reveal the genetic mechanism of thelytoky pattern and promote the biocontrol application ofTrichogramma.

Trichogrammapretiosum; Argonaute; gene family; bioinformatics analysis

2017-02-05

2017-02-22

國(guó)家自然科學(xué)基金(31301714);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20132305120001);黑龍江省自然科學(xué)基金(C2015039);黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201610223039)

* 通信作者 E-mail:zhanghy51@126.com

#為并列第一作者

S 476.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.006