任 璐, 周建波, 劉慧平, 曹俊宇, 殷 輝, 趙曉軍*

(1. 農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 太原 030031; 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,太谷 030801; 3. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 太原 030006)

辣椒炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides對(duì)啶氧菌酯的敏感基線及抗性突變體生物學(xué)性狀

任 璐1,2, 周建波1,3, 劉慧平2, 曹俊宇2, 殷 輝1,3, 趙曉軍1,3*

(1. 農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 太原 030031; 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,太谷 030801; 3. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 太原 030006)

為評(píng)估辣椒炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides對(duì)啶氧菌酯的抗性風(fēng)險(xiǎn),建立了辣椒炭疽病菌對(duì)啶氧菌酯的敏感基線,室內(nèi)篩選獲得了辣椒炭疽病菌抗啶氧菌酯突變體,并對(duì)突變體生物學(xué)性狀進(jìn)行了研究。在山西省3個(gè)未使用過(guò)啶氧菌酯及QoI類(lèi)藥劑的地區(qū)采集并分離到45株辣椒炭疽病菌。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定其對(duì)啶氧菌酯的敏感性,結(jié)果顯示,EC50值介于1.404～16.650 μg/mL,平均EC50值為(6.783±3.499)μg/mL。啶氧菌酯與水楊肟酸(SHAM)共同處理時(shí)(SHAM的處理濃度為100 μg/mL),EC50+S為0.022～0.275 μg/mL,平均(0.109±0.058)μg/mL,EC50+S呈連續(xù)性單峰曲線,且敏感性頻率分布呈近似正態(tài)分布,EC50+S平均值可作為辣椒炭疽病菌對(duì)啶氧菌酯的敏感基線。且水楊羥肟酸旁路氧化貢獻(xiàn)值F(F=EC50/EC50+S)最低為6.039,最高為301.441,平均78.026。室內(nèi)誘導(dǎo)獲得8株抗性突變體,其中低抗突變體6株,中抗突變體2株。中抗突變體無(wú)性繁殖10代,其抗性可穩(wěn)定遺傳。突變體產(chǎn)孢量和菌絲生長(zhǎng)速率與敏感菌株相比均無(wú)顯著差異,但無(wú)藥條件下,突變體致病力較敏感菌株有所降低?？垢芯昃缘矸圩鳛樘荚础⑾跛徕涀鳛榈磿r(shí)利用率最高;最適pH均為5和6;菌絲的最適生長(zhǎng)溫度均為25℃。表明辣椒炭疽病菌抗啶氧菌酯突變體具有較高的適合度,對(duì)啶氧菌酯具有較高抗性風(fēng)險(xiǎn),這一研究結(jié)論為指導(dǎo)生產(chǎn)用藥,延緩抗藥性發(fā)展提供理論依據(jù)。

辣椒炭疽病菌; 啶氧菌酯; 敏感基線; 抗性風(fēng)險(xiǎn); 生物學(xué)性狀

辣椒炭疽病是辣椒生產(chǎn)中常見(jiàn)的真菌性病害,也是辣椒生產(chǎn)過(guò)程中三大病害之一。該病害由子囊菌門(mén)炭疽菌屬Colletotrichum的多個(gè)種侵染造成,如Colletotrichumgloeosporioides、C.capsici、C.acutatum等。炭疽病菌可危害辣椒葉片和果實(shí),尤以對(duì)果實(shí)危害最為明顯與嚴(yán)重,導(dǎo)致辣椒腐爛,失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在夏季天氣悶熱、濕度大時(shí)易發(fā)生,造成辣椒大面積減產(chǎn)[1]。報(bào)道顯示,在很多亞洲國(guó)家,如韓國(guó)、印度、泰國(guó),由于該病害的發(fā)生,辣椒產(chǎn)量明顯下降[2]。Colletotrichumspp.還可以侵染甜椒[3]。有報(bào)道指出,C.acutatum是引起韓國(guó)辣椒和甜椒炭疽病的主要致病菌,C.capsici是泰國(guó)辣椒炭疽病的主要致病菌[3-4],而在我國(guó)的各主要辣椒產(chǎn)區(qū),不同省份所報(bào)道的優(yōu)勢(shì)致病菌有所不同[5-6],根據(jù)我們的取樣和調(diào)查,C.gloeosporioides是引起山西省辣椒產(chǎn)區(qū)辣椒炭疽病的優(yōu)勢(shì)致病菌。

目前,化學(xué)防治是生產(chǎn)上果蔬炭疽病的主要防治手段,常用殺菌劑主要有芳烴類(lèi)、有機(jī)硫類(lèi)及苯并咪唑類(lèi)等。已有報(bào)道顯示炭疽病菌對(duì)多種常用藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗性。例如,Sander等[7]報(bào)道,南非芒果上的C.gloeosporioides已對(duì)多種苯并咪唑類(lèi)殺菌劑敏感性降低。Maymon等[8]報(bào)道,羽扇豆和鱷梨上C.gloeosporioides對(duì)苯并咪唑類(lèi)殺菌劑產(chǎn)生了抗性。在中國(guó),有些省份也出現(xiàn)炭疽病菌對(duì)多種類(lèi)型的藥劑敏感性下降。曹學(xué)仁等[9]報(bào)道了海南省橡膠炭疽病菌Colletotrichumspp.對(duì)多菌靈和咪鮮胺的敏感性降低;韓國(guó)興等[10]發(fā)現(xiàn)浙江省杭州地區(qū)的草莓炭疽病菌C.gloeosporioides對(duì)多菌靈和乙霉威產(chǎn)生了抗性,抗性頻率高達(dá)90%以上;葉佳等[11]分別對(duì)遼寧和浙江的葡萄炭疽病菌群體Colletotrichumspp.對(duì)多菌靈及甲基硫菌靈的敏感性進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)病菌已產(chǎn)生一定程度抗性。

啶氧菌酯(picoxystrobin)于2001年由先正達(dá)在歐洲首次推出,并于2006年被杜邦公司收購(gòu),之后在拉美、北美市場(chǎng)登記,在中國(guó)于2012年7月獲得臨時(shí)登記并于同年11月正式登記,是甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑中內(nèi)吸活性最強(qiáng)的品種,主要用于防治蔬菜灰霉病菌Botrytiscinerea、黃瓜霜霉病菌Pseudoperonosporacubensis、香蕉黑星病菌Macrophomamusae、辣椒炭疽病菌Colletotrichumspp.和葡萄黑痘病菌Sphacelomaampelinum等。甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑的作用位點(diǎn)主要是線粒體上的細(xì)胞色素b,通過(guò)抑制線粒體氧化呼吸所必經(jīng)的細(xì)胞色素b和c1 之間的電子轉(zhuǎn)移來(lái)阻斷生物的呼吸路徑,從而起到殺菌效果[12-13]。啶氧菌酯可用于防治已對(duì)14α-脫甲基抑制劑和苯并咪唑類(lèi)殺菌劑產(chǎn)生抗性的植物病原菌。炭疽菌屬Colletotrichumspp.對(duì)啶氧菌酯抗性的相關(guān)報(bào)道還很少見(jiàn),但不同病原真菌對(duì)QoI類(lèi)殺菌劑的抗性分子機(jī)理顯示,抗性突變位點(diǎn)單一,抗性風(fēng)險(xiǎn)較高[14-17]。

山西省氣候干燥、陽(yáng)光充足、熱量豐富,是中國(guó)華北地區(qū)主要的辣椒種植和生產(chǎn)區(qū)域。據(jù)我們調(diào)查,截至2015年,山西省辣椒種植面積近4萬(wàn) hm2。在發(fā)病較為嚴(yán)重的山西省朔州市應(yīng)縣的辣椒產(chǎn)區(qū),辣椒炭疽病的發(fā)病率高達(dá)30%,該病害的防治不利給生產(chǎn)上帶來(lái)較為嚴(yán)重的損失。啶氧菌酯在山西省辣椒產(chǎn)區(qū)還未廣泛應(yīng)用。本研究于2014-2016年從山西省各地區(qū)的辣椒上采集并分離了炭疽病菌菌株,通過(guò)建立敏感基線,檢測(cè)未使用啶氧菌酯的辣椒產(chǎn)區(qū)辣椒炭疽病菌的敏感性,對(duì)比抗感菌株適合度及其他生物學(xué)特性,評(píng)估辣椒炭疽病菌對(duì)啶氧菌酯的抗性風(fēng)險(xiǎn),為生產(chǎn)上指導(dǎo)用藥,延緩抗藥性產(chǎn)生、延長(zhǎng)藥劑使用壽命提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

用于建立敏感基線的辣椒炭疽病菌菌株采自山西省晉中市3個(gè)未使用過(guò)啶氧菌酯及QoI類(lèi)殺菌劑的辣椒種植地。將具有典型辣椒炭疽病病狀的辣椒果實(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室,用無(wú)菌去離子水沖洗表面3次后,挑取病組織接種于PDA培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)3 d,分離純化菌種至新的PDA平板,25℃培養(yǎng)5 d后進(jìn)行單孢分離,共獲得68株辣椒炭疽病菌菌株,經(jīng)鑒定,其中45株為C.gloeosporioides,23株為C.capsici,菌株以采集地首字母+數(shù)字分別命名。本研究檢測(cè)了其中45株C.gloeosporioides對(duì)啶氧菌酯的敏感性。

1.2 供試藥劑

95%啶氧菌酯(picoxystrobin)原藥,湖北健源化工有限公司生產(chǎn)。用丙酮制成10 000 μg/mL母液,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

99%水楊羥肟酸(salicylhydroxamic acid,簡(jiǎn)稱(chēng)SHAM)分析試劑,上海伊卡生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。用丙酮制成10 000 μg/mL母液,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 含藥培養(yǎng)基制備

配制10 mg/mL啶氧菌酯及10 mg/mL水楊羥肟酸,用無(wú)菌水分別稀釋成所需濃度,按照藥劑與加熱后冷卻至50℃左右的熔融狀態(tài)PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～17 g、水1 000 mL)1∶9比例混合均勻。

1.4 辣椒炭疽病菌對(duì)啶氧菌酯及對(duì)啶氧菌酯+SHAM的敏感性測(cè)定

根據(jù)Rebollar-Alviter等[18]及Zhou等[19]的試驗(yàn)結(jié)果,培養(yǎng)基中加入SHAM可抑制病原菌的旁路氧化途徑,從而更有效抑制病菌菌絲的生長(zhǎng)。因此本研究參照Rebollar-Alviter等[18]及Markoglou等[16]的方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果(未提供數(shù)據(jù))配制含藥PDA培養(yǎng)基,其中啶氧菌酯的終濃度分別為0、1、2、4、8、10和50 μg/mL,SHAM的終濃度為100 μg/mL。對(duì)照只在PDA培養(yǎng)基中加入相同濃度的SHAM。

將保存?zhèn)溆玫木杲臃N到PDA平板中培養(yǎng)5 d,用打孔器從菌落邊緣打取5 mm菌餅接種到含不同濃度啶氧菌酯和SHAM的PDA平板上,每濃度重復(fù)處理3次。放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,計(jì)算各個(gè)濃度藥劑對(duì)辣椒炭疽病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率。菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=[1-(待測(cè)菌落直徑-5 mm)/(對(duì)照菌落直徑-5 mm)]×100。對(duì)抑菌率進(jìn)行線性回歸分析,求出回歸方程及有效抑制中濃度EC50。將啶氧菌酯單獨(dú)作用下測(cè)得的敏感性記為EC50;啶氧菌酯與SHAM(100 μg/mL)共同作用下得到的EC50記為EC50+S。計(jì)算出旁路氧化的貢獻(xiàn)值F=EC50/EC50+S。

1.5 啶氧菌酯抗性突變體的獲得

在室內(nèi),采用紫外誘導(dǎo)和藥劑馴化篩選辣椒炭疽病菌對(duì)啶氧菌酯的抗性突變菌株。紫外誘導(dǎo):從來(lái)源于3個(gè)采集地的辣椒炭疽病菌中隨機(jī)挑選3株敏感菌株SN13、JX3、YZ6,接種于PDA平板上培養(yǎng)3 d,在距20 W紫外燈10 cm距離下照射20、40、60 min后在黑暗環(huán)境下接種到含亞致死劑量(50 μg/mL)的啶氧菌酯PDA平板上,每處理重復(fù)3次,在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)3～4 d,將能夠在含藥PDA平板上形成扇形菌落的角變區(qū),用相同方法連續(xù)紫外照射及黑暗培養(yǎng),增加啶氧菌酯的濃度,直到其可以在500 μg/mL啶氧菌酯平板上生長(zhǎng),測(cè)定其敏感性,確定其抗性倍數(shù)。

藥劑馴化:隨機(jī)選取辣椒炭疽病菌敏感菌株SN1、JX1、YZ1在PDA平板上培養(yǎng)5 d,在菌落邊緣打取5 mm的菌餅,接種到含20 μg/mL啶氧菌酯的平板上,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d后,采用相同的方法將菌餅接種到更高濃度的含藥平板上,濃度每次增加10 μg/mL,且每增加一次算作一代,直到其可以在500 μg/mL啶氧菌酯濃度含藥平板生長(zhǎng),測(cè)定其敏感性,確定其抗性倍數(shù)。

抗性倍數(shù)(resistance factor, RF)=抗性菌株EC50/敏感菌株EC50。當(dāng)菌株抗性水平達(dá)到5倍,則表明有抗性產(chǎn)生,抗性水平大于5倍的菌株在整個(gè)群體中所占的比例即為抗性頻率?？剐苑旨?jí)標(biāo)準(zhǔn):抗性倍數(shù)<5倍為敏感;5倍≤抗性倍數(shù)<10倍為低抗;10～40倍為中抗;40倍以上為高抗[20]。

1.6 抗性突變體遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

將抗性突變體在無(wú)藥PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗條件下培養(yǎng)10代,每5 d將菌株轉(zhuǎn)到新的無(wú)藥培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)接10次,分別測(cè)其第2、4、6、8、10代菌株的EC50值。

1.7 抗性突變體生物學(xué)特性測(cè)定

選取敏感菌株JX3、SN13、YZ6與抗性突變體JX3R2、SN13R1、YZ6R2、JX3MR3、YZ6MR4進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.7.1 抗性突變體生長(zhǎng)速率及產(chǎn)孢量測(cè)定

將培養(yǎng)5 d的敏感菌株與抗性突變體,用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣相同位置打取菌塊,接種于無(wú)藥PDA培養(yǎng)基上,25℃下恒溫黑暗培養(yǎng),每處理重復(fù)3次,每24 h用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。培養(yǎng)10 d后,在每個(gè)平板中加入約10 mL滅菌水,用玻璃棒輕輕在菌落表面不斷地?fù)軇?dòng),用4層紗布過(guò)濾,定容至5 mL,充分混勻,在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)算抗感菌株的產(chǎn)孢量。

1.7.2 抗性突變體與敏感菌株致病力測(cè)定

用離體組織法測(cè)定抗性突變體與敏感菌株致病力。取健康的辣椒果實(shí)用水清洗其表面,再用滅菌水沖洗3次,然后切成直徑為3 cm大小的辣椒圓片。將辣椒片在75%乙醇中浸泡2 min左右,然后在濃度為150 μg/mL的啶氧菌酯藥液中浸泡2 min,以無(wú)菌水浸泡為對(duì)照,最后放入帶有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中,采用針刺法將該病菌的孢子懸浮液接種到辣椒片中央,每個(gè)培養(yǎng)皿中4片,每處理4次重復(fù)。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),用潮濕的無(wú)菌濾紙進(jìn)行保濕培養(yǎng),3 d后用坐標(biāo)紙計(jì)算病斑面積。

1.7.3 抗感菌株在不同酸堿度下的生長(zhǎng)狀況

在無(wú)菌操作臺(tái)中,用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的酸堿度,使其pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11。在辣椒炭疽病菌菌落邊緣打取5 mm的菌餅,接入含梯度酸堿度的PDA平板上,每處理3次重復(fù),倒置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),6 d后用十字交叉法測(cè)定菌落直徑。

1.7.4 抗感菌株在不同碳、氮營(yíng)養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)狀況

供試碳源為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、丙三醇和淀粉。供試氮源為蛋白胨、尿素、硫酸銨和硝酸鉀。測(cè)定碳源對(duì)抗感菌株的影響時(shí),將理查培養(yǎng)基(氯化鐵FeCl30.02 g、硫酸鎂MgSO42.5 g、硝酸鉀KNO310 g、磷酸二氫鉀KH2PO45 g、蔗糖50 g、瓊脂17 g、無(wú)菌水1 000 mL)中的蔗糖換成待測(cè)碳源,研究氮源時(shí),將理查培養(yǎng)基中的硝酸鉀置換成待測(cè)氮源,取直徑為5 mm的抗感菌株的菌餅接到不同碳、氮源平板上,每處理3次重復(fù),25℃培養(yǎng)6 d后測(cè)定菌落直徑。

1.7.5 抗感菌株在不同溫度下的生長(zhǎng)狀況

從抗感菌株菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅于無(wú)藥PDA平板中,分別放置于15、20、25、30、35℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),每處理設(shè)置3次重復(fù),6 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒炭疽病菌對(duì)啶氧菌酯、啶氧菌酯+SHAM的敏感性

45株C.gloeosporioides的敏感性測(cè)定結(jié)果表明,在啶氧菌酯單獨(dú)作用下,其EC50介于1.404～16.650 μg/mL,平均值為(6.783±3.499)μg/mL,EC50呈連續(xù)性變化(圖1a)。在啶氧菌酯與SHAM共同作用下,其EC50+S的范圍在0.022～0.275 μg/mL(圖1b),平均值為(0.109±0.058)μg/mL,最大與最小值相差12.5倍,亦呈連續(xù)性變化。菌株對(duì)啶氧菌酯+SHAM的敏感性頻率分布呈單峰曲線(圖2),以S-W法對(duì)45株菌株的敏感性分布進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),其W值為0.973,P=0.635>P0.05,表明病原菌對(duì)啶氧菌酯的敏感性分布呈近似正態(tài)分布,未出現(xiàn)敏感性明顯下降的群體。因此,其EC50+S均值可作為辣椒炭疽病菌對(duì)啶氧菌酯的敏感基線。

圖1 啶氧菌酯(a)和啶氧菌酯+SHAM(b)對(duì)45株辣椒炭疽病菌的EC50值Fig.1 EC50 values of picoxystrobin (a) and picoxystrobin+ SHAM (b) to 45 Colletotrichum gloeosporioides isolates

圖2 辣椒炭疽病菌對(duì)啶氧菌酯的敏感性頻率分布Fig.2 Frequency distribution of Colletotrichum gloeosporioides isolates with different sensitivities to picoxystrobin

與啶氧菌酯單獨(dú)作用相比較,啶氧菌酯與SHAM共同作用下,EC50下降明顯,表明旁路氧化抑制劑SHAM對(duì)啶氧菌酯抑制C.gloeosporioides菌絲生長(zhǎng)的活性表現(xiàn)出補(bǔ)償作用,即增效作用,使得啶氧菌酯的抑菌活性大大加強(qiáng)。且旁路氧化貢獻(xiàn)值F[F=EC50/(EC50+S)]最低為6.039,最高為301.441,平均78.026(圖3),而且從圖中可以明顯看到4個(gè)尾點(diǎn),這主要是由于SHAM在不同菌株中的旁路氧化貢獻(xiàn)值不同所造成的。

圖3 水楊肟酸旁路氧化貢獻(xiàn)值(F值)Fig.3 Compensation efficiency value in the bypass oxidation (F values)

2.2 啶氧菌酯抗性突變體的抗性水平

在室內(nèi)通過(guò)紫外誘導(dǎo)和藥劑馴化共獲得8株抗性突變體,分別為SN13R1、JX3R1、JX3R2、JX3MR3、YZ6R1、YZ6R2、YZ6R3、YZ6MR4,其中6株為低抗菌株,2株為中抗菌株(表1)。

表1室內(nèi)紫外誘導(dǎo)及藥劑馴化抗性突變體抗性水平

Table1Resistanceleveltopicoxystrobinofpicoxystrobin-resistantmutantsofColletotrichumgloeosporioidesobtainedinthelaboratoryviaUVradiationandfungicideselection

菌株Isolate毒力回歸方程RegressionequationEC50/μg·mL-1抗性倍數(shù)Resistancefactor抗性水平ResistancelevelSN13R1y=4．0910+0．4832x76．069512．6563低抗JX3R1y=3．6429+0．8342x42．34536．9008低抗JX3R2y=4．2772+0．4143x55．52689．0489低抗YZ6R1y=4．2140+0．5256x31．28745．1200低抗YZ6R2y=4．2804+0．4780x32．02005．2399低抗YZ6R3y=4．4665+0．2910x68．163311．1546低抗JX3MR3y=4．3871+0．2726x177．191228．8759中抗YZ6MR4y=3．8934+0．4741x215．870935．3261中抗

2.3 抗性突變體遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

從表2中可以看出,低抗菌株JX3R1、YZ6R2經(jīng)過(guò)10代的無(wú)性繁殖后,抗性倍數(shù)下降較為明顯,抗藥性不能穩(wěn)定遺傳。低抗菌株SN13R1、中抗菌株JX3MR3、YZ6MR4的抗性倍數(shù)雖略有下降,但其菌絲生長(zhǎng)良好,且經(jīng)過(guò)10代的連續(xù)培養(yǎng)后,其抗性倍數(shù)仍然比較穩(wěn)定,表明其抗藥性能夠遺傳,不會(huì)喪失。

表2抗性突變體遺傳穩(wěn)定性

Table2StabilityoftheresistantmutantsofColletotrichumgloeosporioides

菌株IsolateEC50/μg·mL-1 EC50valueafterdifferenttransfercultivations第0代第2代第4代第6代第8代第10代JX3R142．345342．013335．421930．131528．730320．1681SN13R176．069575．945874．636173．321471．283470．6372YZ6R232．020031．490229．834530．751125．335420．5716JX3MR3177．1912175．3215170．8321168．8694171．3824161．5210YZ6MR4215．8709208．0728210．3421206．4891208．5243201．0324

2.4 抗性突變體生物學(xué)特性

2.4.1 抗性突變體與敏感菌株菌絲生長(zhǎng)速率及產(chǎn)孢量

表3結(jié)果顯示，低抗突變體菌絲生長(zhǎng)速率略低于敏感菌株，但差異不顯著；其中，YZ6R2、SN13R1菌絲生長(zhǎng)與產(chǎn)孢量均與其敏感菌株YZ6和SN13沒(méi)有顯著差異。而中抗突變體JX3MR3、YZ6MR4菌絲生長(zhǎng)速率顯著低于敏感菌株JX3和YZ6；其中，JX3MR3的產(chǎn)孢量與其親本敏感菌株JX3差異顯著。

表3抗性突變體與敏感菌株生長(zhǎng)速率與產(chǎn)孢量1)

Table3Myceliumgrowthandsporeproductionofsensitiveisolatesandresistantmutants

菌株Isolate菌落直徑/cm Colonydiameter1d2d3d4d5d6d7d8d平均速率/cm·d-1Average產(chǎn)孢量/×106SporenumberJX31．59002．76003．92004．65005．58006．85007．85007．9800(1．03±0．43)a(5．80±0．20)cSN131．41672．95003．72174．58335．60677．25007．97008．5367(1．07±0．41)a(5．53±0．12)cdYZ61．94333．23334．00835．01006．06677．06507．97008．2417(1．03±0．47)a(6．75±0．22)aJX3R21．33332．33833．40174．25835．23336．33337．29177．5750(0．95±0．30)a(4．40±0．20)eSN13R11．23332．52173．33174．01675．19176．76177．50508．3617(1．05±0．32)a(4．96±0．32)dYZ6R21．95603．28334．06335．00506．04507．04677．94178．1333(1．02±0．50)a(6．27±0．12)aJX3MR31．55831．85172．59833．38834．78335．18676．20837．1333(0．89±0．44)b(4．00±0．10)fYZ6MR41．25501．65502．50173．29504．17504．80675．56006．2683(0．78±0．24)b(6．00±0．10)ab

1) 表中同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同字母者表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P<0.05水平差異顯著。下同。

Data followed by different lowercase letters indicate significant difference atP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test. The same below.

2.4.2 抗性突變體與敏感菌株致病力

從表4中可知,在不含藥的情況下,接種敏感菌株的所有辣椒圓盤(pán)均會(huì)產(chǎn)生病斑,侵染率分別為62.35%、62.63%、58.32%;抗性突變體在不含藥圓盤(pán)上侵染率較敏感菌株低,接種后引起的發(fā)病面積較小,且突變體抗性倍數(shù)越高,所致發(fā)病面積及侵染率越低。低抗菌株JX3R2和YZ6R2致病力與親本菌株差異不顯著,但SN13R1與敏感菌株SN13差異明顯;而中抗菌株致病力較親本敏感菌株均顯著降低。

在含50 μg/mL啶氧菌酯的辣椒圓盤(pán)上,接種敏感菌株的發(fā)病面積與侵染率均顯著低于接種抗性突變體,說(shuō)明抗性突變體均表現(xiàn)出一定的抗藥性,其中，中抗菌株JX3MR3、YZ6MR4侵染率達(dá)到16.14%、34.01%。

表4抗性突變體及敏感菌株致病性

Table4Pathogenicityofresistantandsensitiveisolates

菌株Isolate發(fā)病面積/cm2 LesionareaCK50μg/mL侵染率/% InfectionfrequencyCK50μg/mLJX3(17．62±0．38)a(0．95±0．07)e62．35a3．36eSN13(17．70±0．29)a(0．96±0．07)e62．63a3．40eYZ6(16．48±0．68)b(0．96±0．07)e58．32b3．40eJX3R2(17．16±0．05)ab(2．51±0．11)d60．72ab8．89dSN13R1(16．82±1．33)b(2．95±0．28)c59．52b10．44cYZ6R2(15．75±0．19)b(2．81±0．22)c55．73b9．94cJX3MR3(16．83±0．08)b(4．56±0．04)b59．55b16．14bYZ6MR4(15．54±0．08)c(9．61±0．21)a54．99c34．01a

2.4.3 抗感菌株在不同酸堿度下的生長(zhǎng)狀況

抗感菌株在pH為5和6時(shí)生長(zhǎng)狀況均最好(表5)。敏感菌株與低抗菌株在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下生長(zhǎng)較差,且敏感菌株與低抗菌株間差異顯著,說(shuō)明低抗菌株在不同pH生長(zhǎng)條件下的適應(yīng)能力低于敏感菌株。中抗菌株JX3MR3、YX6MR4在pH 3時(shí)均不能生長(zhǎng),但偏酸偏堿條件下,JX3MR3、YX6MR4菌落直徑均大于其親本敏感菌株,說(shuō)明中抗菌株對(duì)偏酸偏堿條件的適應(yīng)性均優(yōu)于敏感菌株。

2.4.4 抗感菌株在不同碳、氮營(yíng)養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)狀況

從表6中可以看出,抗感菌株在幾種供試碳源下均能正常生長(zhǎng),其中低抗菌株SN13R1在含有甘露糖的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)最快,而其余菌株均在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快。敏感菌株JX3、SN13及抗性突變體JX3R2、SN13R1、YZ6R2、YX6MR4在以丙三醇作為碳源的條件下生長(zhǎng)最慢,敏感菌株YZ6在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率最低,中抗菌株JX3MR3在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的最慢。說(shuō)明不同病原菌對(duì)不同碳源的利用率有差異。

表5不同pH下抗感菌株的菌落直徑

Table5ColonydiameterofsensitiveisolatesandresistantmutantsunderdifferentpHvalues

pH菌落直徑/cm ColonydiameterJX3SN13YZ6JX3R2SN13R1YZ6R2JX3MR3YZ6MR43(1．07±0．19)f -(1．34±0．07)f -----4(3．14±0．12)cd(3．05±0．45)d(2．04±0．43)e(1．74±0．04)b(1．74±0．01)bc(1．30±0．02)g(3．71±0．33)b (2．24±0．10)d 5(4．40±0．07)a(4．63+0．26)a(4．00±0．08)a(1．86±0．09)b(2．01±0．03)b(1．68±0．02)f(4．94±0．06)a(4．93±0．16)a6(3．94±0．19)ab(4．09±0．32)b(3．71±0．12)ab(4．05±0．21)a(4．12±0．15)a(4．02±0．04)a(4．62±0．06)a(4．37±0．15)a7(3．40±0．46)c(3．59±0．04)c(3．19±0．19)bc(1．98±0．30)b(2．07±0．33)b(2．98±0．07)b(3．55±0．07)c(2．95±0．33)c8(3．13±0．32)cd(3．07±0．07)d(2．70±0．22)cd(1．86±0．49)b(1．98±0．62)b(2．49±0．01)c(4．59±0．16)a(4．30±0．43)abc9(3．58±0．21)bc(2．38±0．08)e(2．42±0．43)de(2．03±0．16)b(2．11±0．17)b(2．24±0．16)d(4．28±0．59)ab(4．61±0．15)ab10(2．64±0．10)d(1．98±0．01)e(2．16±0．07)de(1．94±0．01)b(1．96±0．01)b(2．05±0．05)e(4．34±0．03)ab(4．01±0．44)bc11(1．77±0．07)e(1．29±0．05)f(1．27±0．06)f(1．82±0．01)b(1．20±0．01)cd(1．11±0．12)h(3．75±1．07)b(3．75±0．45)c

表6不同碳源條件下敏感菌株和抗性突變菌落直徑

Table6Colonydiametersofsensitiveisolatesandresistantmutantsindifferentcarbonsources

碳源Carbonsource菌落直徑/cm ColonydiameterJX3SN13YZ6JX3R2SN13R1YZ6R2JX3MR3YX6MR4葡萄糖Glucose(5．42±0．08)b(4．92±0．19)b(5．49±0．71)b(5．06±0．10)c (4．92±0．07)c (4．84±0．06)d(4．84±0．06)c(4．98±0．08)b麥芽糖Maltose(4．79±0．11)c(4．04±0．13)c(4．27±0．26)c(4．44±0．44)d(4．29±0．01)d(4．20±0．04)e(4．28±0．04)d(4．33±0．50)c蔗糖Sucrose(4．75±0．10)c(4．05±0．05)c(4．37±0．07)c(4．13±0．11)de(4．05±0．002)d(4．02±0．03)e(3．98±0．15)d(4．30±0．03)c甘露糖Mannitol(6．18±0．09)a(5．94±0．22)a(6．04±0．07)a(5．77±0．03)b(6．66±0．05)b(5．68±0．06)b(5．68±0．05)a(5．96±0．19)a丙三醇Glycerol(4．72±0．10)a(3．73±0．34)c(4．45±0．07)c(4．03±0．03)e(3．43±0．38)e(3．71±0．26)f(4．05±0．54)d(4．03±0．26)c淀粉Starch(6．32±0．12)c(6．04±0．04)a(6．18±0．15)a(6．33±0．18)a(6．15±0．09)a(6．08±0．07)a(6．01±0．19)a(6．27±0．01)a

由表7可知,菌株在蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鉀4種氮源培養(yǎng)基上都可生長(zhǎng),但生長(zhǎng)差異明顯。其中硝酸鉀為最適氮源,且與其他氮源處理差異顯著。其次是蛋白胨;而在以尿素、硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢?？垢芯暝诓煌刺幚淼呐囵B(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況一致,說(shuō)明抗感菌株對(duì)不同氮源環(huán)境的適應(yīng)性沒(méi)有顯著差異。

表7不同氮源條件下敏感菌株和抗性突變體的菌落直徑

Table7Colonydiametersofsensitiveisolatesandresistantmutantsindifferentnitrogensources

氮源Nitrogensource菌落直徑/cm ColonydiameterJX3SN13YZ6JX3R2SN13R1YZ6R2JX3MR3YX6MR4蛋白胨Peptone(4．31±0．24)b(3．54±0．16)b(3．64±0．32)b(3．57±0．20)b(3．57±0．19)b(3．51±0．09)b(6．01±0．12)a(3．89±0．18)b尿素Urea(2．37±0．34)c(1．99±0．11)c(2．04±0．08)c(1．81±0．03)c(1．86±0．29)c(1．98±0．05)c(3．27±0．10)b(1．98±0．20)c硫酸銨Ammoniumsulfate(0．65±0．03)d(0．81±0．08)d(0．74±0．07)d(0．87±0．08)d(0．68±0．04)d(0．80±0．01)d(1．46±0．09)c(0．78±0．01)d硝酸鉀Nitrate(5．36±0．07)a(4．87±0．19)a(5．08±0．12)a(4．68±0．27)a(5．06±0．14)a(4．98±0．15)a(6．24±0．17)a(5．25±0．15)a

2.4.5 抗感菌株在不同溫度下的生長(zhǎng)狀況

試驗(yàn)結(jié)果(表8)表明,抗感菌株在15～35℃下均可生長(zhǎng),但最適溫度均為25℃,與其他處理溫度相比差異顯著。在溫度為15℃、35℃時(shí),抗感菌絲生長(zhǎng)速率均顯著下降。

表8不同溫度處理下抗感菌株的菌落直徑差異

Table8Colonydiametersofsensitiveisolatesandresistantmutantsatdifferenttemperatures

溫度/℃Temperature菌落直徑/cm ColonydiameterJX3SN13YZ6JX3R2SN13R1YZ6R2JX3MR3YX6MR415(1．65±0．05)cd(1．43±0．18)d(1．83±0．17)c(1．40±0．10)cd(1．67±0．21)c(1．81±0．10)c(1．75±0．05)c(1．38±0．18)d20(3．48±0．05)b(3．19±0．12)b(3．23±0．04)b(3．25±0．03)b(3．20±0．18)b(3．65±0．18)b(4．02±0．12)b(3．86±0．19)b25(5．58±0．65)a(5．62±0．04)a(6．07±0．48)a(5．24±0．52)a(5．19±0．33)a(6．04±0．30)a(4．49±0．02)a(4．12±0．12)a30(1．97±0．05)c(1．73±0．08)c(1．79±0．04)c(1．74±0．21)c(1．59±0．39)cd(2．00±0．12)c(1．75±0．07)c(1．74±0．09)c35(1．32±0．01)d(1．19±0．05)e(1．22±0．01)d(1．15±0．10)d(1．15±0．13)d(1．36±0．14)d(1．17±0．05)d(1．20±0．04)d

3 結(jié)論與討論

啶氧菌酯在中國(guó)被用于防治多種病害,但在山西省該藥劑目前還未被廣泛用于辣椒炭疽病的防治。本試驗(yàn)用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了從山西省晉中市3個(gè)未使用過(guò)QoI類(lèi)殺菌劑的辣椒種植區(qū)分離的45株C.gloeosporioides對(duì)啶氧菌酯的敏感性。在啶氧菌酯及SHAM共同作用下,EC50+S平均值為(0.109±0.058)μg/mL,正態(tài)性檢驗(yàn)顯示敏感性分布呈近似正態(tài)分布,未出現(xiàn)敏感性明顯下降的群體,其EC50+S平均值可作為C.gloeosporioides對(duì)啶氧菌酯的敏感基線,作為田間抗藥性監(jiān)測(cè)的參考標(biāo)準(zhǔn)。

由于QoI類(lèi)殺菌劑獨(dú)特的作用位點(diǎn),一些病原菌可以通過(guò)旁路氧化補(bǔ)償作用來(lái)降低對(duì)殺菌劑的敏感性[21]。旁路氧化途徑可以在電子傳遞主路被阻斷時(shí),交替運(yùn)行,以維持生物的活性。因此,病原菌體內(nèi)所存在的旁路氧化補(bǔ)償機(jī)制使離體條件下病原菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)QoI類(lèi)殺菌劑敏感性下降。SHAM是旁路氧化途徑中的交替氧化酶抑制劑,它可以阻斷病菌體內(nèi)的旁路氧化途徑。在用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定該類(lèi)藥劑敏感性時(shí),加入SHAM可提高抑菌活性[22-23]。從SHAM+啶氧菌酯的聯(lián)合毒力測(cè)定可知,其EC50+S的范圍在0.022～0.275 μg/mL,旁路氧化的平均貢獻(xiàn)值為78.026,說(shuō)明旁路氧化途徑在C.gloeosporioides菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要作用。陳聃所報(bào)道的葡萄炭疽病對(duì)吡唑醚菌酯旁路氧化平均貢獻(xiàn)值為3.78[24],葉佳等報(bào)道的葡萄炭疽病菌對(duì)醚菌酯旁路氧化途徑平均貢獻(xiàn)值為20.09[11],明顯低于本文中的78.026,推斷旁路氧化作用在不同甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑對(duì)不同病原菌中的貢獻(xiàn)值存在較大差異。

QoI類(lèi)殺菌劑通常被認(rèn)為具有高的抗性風(fēng)險(xiǎn)[12,14,23], Zheng 等[25]和De Miccolis等[26]的研究也證實(shí),在室內(nèi)采用紫外線照射和藥劑馴化的方式很容易得到抗性水平較高的抗性突變體。但低抗菌株抗藥穩(wěn)定性較差,推測(cè)可能是由于病原菌在藥劑選擇壓下暫時(shí)表現(xiàn)出的耐藥性反應(yīng),但在生產(chǎn)中有可能在持續(xù)用藥的情況下,進(jìn)一步突變?yōu)楦呖咕?加劇了病原菌產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)。另外,突變位點(diǎn)不同的抗性突變體抗性水平和適合度差異很大,如F129L點(diǎn)突變表現(xiàn)為中等抗性,G143A點(diǎn)突變表現(xiàn)為高抗;又如Magnaporthegrisea和MycosphaerellagraminicolaG143A突變體與敏感菌株相比,適合度沒(méi)有顯著差異[19, 27],但G143S突變體的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量與敏感菌株差異顯著[28]。本研究比較了C.gloeosporioides抗感菌株的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量,發(fā)現(xiàn)與敏感菌株相比,低抗突變體均沒(méi)有顯著差異。但在無(wú)藥條件下,接種抗性突變體所產(chǎn)生的病斑面積以及侵染率明顯低于敏感菌株,表明無(wú)藥情況下,敏感菌株的致病能力強(qiáng)于抗性突變體;在藥劑存在下,抗性突變體表現(xiàn)出一定的耐藥性仍能使果實(shí)產(chǎn)生病斑面積。

抗感菌株在不同營(yíng)養(yǎng)條件、溫度、酸堿度下菌絲生長(zhǎng)速率結(jié)果表明:在不同碳源條件下,抗感菌株均能正常生長(zhǎng),且淀粉為抗感菌株最佳碳源。在不同氮源條件下,抗感菌株均在以硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快,而在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中幾乎不生長(zhǎng),說(shuō)明抗感菌株對(duì)不同氮源適應(yīng)性沒(méi)有明顯差別。在不同溫度下,抗感菌株的最適溫度均為25℃,溫度偏高和偏低抗感菌株的菌絲生長(zhǎng)速率均會(huì)下降。不同酸堿度下低抗菌株與敏感菌株菌絲生長(zhǎng)狀況差異不明顯,但中抗菌株較敏感菌株對(duì)不同酸堿度的調(diào)節(jié)能力表現(xiàn)出一定優(yōu)越性。總的來(lái)說(shuō),辣椒炭疽病菌C.gloeosporioides對(duì)啶氧菌酯產(chǎn)生抗性后,與敏感菌株相比,抗性突變體適合度沒(méi)有明顯下降,說(shuō)明其對(duì)啶氧菌酯具有較高的抗性風(fēng)險(xiǎn),因此,在生產(chǎn)中建議輪換使用不同作用機(jī)制的殺菌劑,使得C.gloeosporioides對(duì)啶氧菌酯始終保持低水平抗性頻率,即能很大程度上延緩抗藥性的產(chǎn)生。

今后,將進(jìn)一步研究和比較Colletotrichum屬不同種之間對(duì)啶氧菌酯敏感性的差異,探索Colletotrichum屬中不同種的抗性突變體適合度及對(duì)啶氧菌酯的抗性風(fēng)險(xiǎn)。并針對(duì)高效藥劑建立敏感基線,加強(qiáng)田間抗藥性監(jiān)測(cè),根據(jù)抗性出現(xiàn)頻率制定科學(xué)的用藥策略,延長(zhǎng)藥劑的使用壽命。

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(責(zé)任編輯： 田 喆)

BaselinesensitivityofColletotrichumgloeosporioidestopicoxystrobinandbiologicalcharacteristicsofresistantmutants

Ren Lu1,2, Zhou Jianbo1,3, Liu Huiping2, Cao Junyu2, Yin Hui1,3, Zhao Xiaojun1,3

(1.ShanxiKeyLaboratoryofIntegratedPestManagementinAgriculture,Taiyuan030031,China; 2.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 3.InstituteofPlantProtection,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan030006,China)

To evaluate the resistance risk ofColletotrichumgloeosporioidesto picoxystrobin, the baseline sensitivity ofC.gloeosporioidesto this fungicide was established, and the biological characteristics of the picoxystrobin-resistant mutants obtained in the laboratory were studied. Forty-fiveC.gloeosporioidesisolates were collected from three areas of Jinzhong, Shanxi Province, where picoxystrobin and the other fungicides with the same mode of action had not been used before. The sensitivities of 45C.gloeosporioidesto picoxystrobin were determined by growth rate method. The results showed that the EC50values ranged from 1.404 μg/mL to 16.650 μg/mL, with a mean of (6.783±3.499)μg/mL. The EC50+Svalues of 45C.gloeosporioidesto picoxystrobin combined with 100 μg/mL salicylic acid oxime (SHAM) ranged from 0.022 μg/mL to 0.275 μg/mL, with a mean of (0.109±0.058)μg/mL. The frequency of EC50+Svalues was distributed as a unimodal curve, and the frequency of sensitivity was in approximately normal distribution, and the mean EC50+Svalues could be used as the relative baseline sensitivity ofC.gloeosporioidesto picoxystrobin. The compensation efficiency value in the bypass oxidation way showed that the lowest value was 6.039, and the highest was 301.441, with a mean value of 78.026. Eight picoxystrobin-resistant mutants were obtained, of which 6 were low resistance and 2 medium resistance to picoxystrobin. The resistance of moderately resistant mutants was stable after 10 generations of asexual cultivation. The mycelium growth rates, spore germination rates of mutants were similar with those of sensitive isolates, but the pathogenicity of the mutants was lower than that of the sensitive ones in absence of fungicides. The best carbon source of both sensitive and resistant isolates was starch and best nitrogen source was potassium nitrate; the optimum pH values were 5 and 6 and the optimum temperature was 25℃ for the mycelial growth of both sensitive and resistant isolates. The results showed that theC.gloeosporioidesresistant mutants were in high fitness and in high risk of resistance to picoxystrobin. The conclusion provides the theoretical basis for guiding fungicide use and the strategic buildup of delaying resistance development.

Colletotrichumgloeosporioides; picoxystrobin; baseline sensitivity; resistance risk; biological characteristics

2016-12-21

2017-02-04

山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(201603D21110-2)；農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(YHSW2015002)；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特色農(nóng)業(yè)技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目(YGG17114)；山西省農(nóng)科院重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(YGG1603)

* 通信作者 E-mail：zhaoxiaojun0218@163.com

S 481.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.005