楊明非 蘇雯 王海英

(北日本制藥株式會社產(chǎn)品研發(fā)室，日本富山縣，930-0314) (廣東省珠海市斗門區(qū)公立醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)管理中心) (東北林業(yè)大學(xué))

尿素包合法富集紅松子油脂肪酸成分分析

楊明非 蘇雯 王海英

(北日本制藥株式會社產(chǎn)品研發(fā)室，日本富山縣，930-0314) (廣東省珠海市斗門區(qū)公立醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)管理中心) (東北林業(yè)大學(xué))

采用尿素包合法(液料比為m(脂肪酸)∶V(乙醇)=1 g∶12 mL，m(脂肪酸)∶m(尿素)=1.0∶1.5)，將紅松子油中的皮諾斂酸進行富集純化；利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析富集后混合脂肪酸中各個成分質(zhì)量分數(shù)。結(jié)果表明：經(jīng)尿素包合法富集后的混合脂肪酸中，皮諾斂酸(C18∶3)甲酯質(zhì)量分數(shù)最高達到45.8%，其次亞麻酸質(zhì)量分數(shù)為16.32%、亞油酸質(zhì)量分數(shù)4.88%。經(jīng)純化富集后的脂肪酸收率雖然較低，但對人體有益的多不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)明顯增加。

紅松子油；皮諾斂酸；脂肪酸；尿素包合法

紅松(Pinuskoraiensis)，又名海松、果松、朝鮮松，是松杉綱松科松屬植物，主要分布在黑龍江、吉林，遼寧及河北等地[1]。紅松松子為紅松的種子，脂肪含量豐富，松子中脂肪質(zhì)量分數(shù)在70%左右[2]，含有多種不飽和脂肪酸，其中包括亞麻酸、亞油酸、花生酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等人體不能合成的脂肪酸；還包括紅松子油中特有的皮諾斂酸[3-4]。皮諾斂酸具有降低膽固醇、減肥、升高高密度脂蛋白的功效[5]；有文獻提出，補充松油酸能將人肝癌細胞HepG2細胞磷脂酰肌醇部分花生四烯酸的質(zhì)量分數(shù)從15.9%降到8.7%，因此，這種物質(zhì)有成為研究磷脂酰肌醇基源生物活性脂類功能試驗工具的可能性[6-7]。

尿素包合法是常見的分離純化脂肪酸的方法之一，原理是利用強堿催化水解的方法，即皂化反應(yīng)，生成脂肪酸鹽和甘油，再加入鹽酸酸化水解、水洗分離得松子油混合脂肪酸。

尿素是一個四面體的結(jié)晶，當(dāng)它與脂肪酸化合物生成包合物后，包合物呈六面體結(jié)晶。尿素分子以螺旋狀的方式構(gòu)成包合物框架，脂肪族化合物被包合在該框架內(nèi)。飽和脂肪酸較不飽和脂肪酸更容易與尿素形成穩(wěn)定的包合物，單一雙鍵，較含有兩個或更多雙鍵的脂肪酸更容易形成穩(wěn)定的包合物。尿素分子在結(jié)晶過程中，能夠與飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸形成較穩(wěn)定的晶體包合物析出；而多不飽和脂肪酸由于雙鍵較多，碳鏈彎曲，具有一定的空間構(gòu)型，不易被尿素包合，采用過濾的方法除去飽和脂肪酸與單不飽和脂肪酸的尿素包合化合物，可以獲得較高純度的多不飽和脂肪酸[8-9]。本實驗通過尿素包合法[10]將紅松子油中的皮諾斂酸進行富集純化，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析富集后混合脂肪酸中各個成分質(zhì)量分數(shù)，為紅松子油皮諾斂酸的純化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

紅松子油，來源于黑龍江宏泰松果有限公司。尿素、95%乙醇、氫氧化鉀、鹽酸、正己烷、無水硫酸鈉等，均為分析純。甲醇為色譜純，為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

儀器設(shè)備主要為RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；7890A-7000B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司生產(chǎn)。

1.2 混合脂肪酸的制備

在20 g松子油中加入50 mL 2% KOH-乙醇溶液，80～90 ℃回流1 h使其水解，蒸干乙醇，冷卻后，加入1 mol/L鹽酸酸化，調(diào)節(jié)pH為2～3，用500 mL正己烷萃取3次，除去下層不皂化物。合并正己烷層，用水洗滌直至中性，正己烷層加入20 g無水硫酸鈉干燥后，抽濾除去硫酸鈉晶體，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以50 ℃、45 r/min、0.9 MPa條件回收正己烷，制得混合脂肪酸。粗脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)=((W-W0)/樣品質(zhì)量)×100%；W為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后反應(yīng)容器與粗脂肪酸的質(zhì)量，W0為反應(yīng)容器的質(zhì)量。

1.3 皮諾斂酸的甲酯化

尿素包合法[10]富集皮諾斂酸，根據(jù)孫宇[9]實驗結(jié)果確定本次實驗脂肪酸尿素比和尿素乙醇比。取混合脂肪酸5 g溶于60 mL乙醇中，然后向脂肪酸醇溶液中加入7.5 g尿素，回流20 min使其混勻，室溫冷卻。放入冰箱中0 ℃結(jié)晶24 h。抽濾，除去晶體后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，少量鹽酸酸化，溶液用125 mL正己烷萃取3次。正己烷層合并后用水中和，無水硫酸鈉干燥，抽濾，去除硫酸鈉晶體。上述條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去正己烷，得到富集不飽和脂肪酸?；旌现舅崾章?(m/m0)×100%；m為尿素包合反應(yīng)后所得混合脂肪酸的質(zhì)量，m0為尿素包合反應(yīng)前所用混合脂肪酸的質(zhì)量。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

以色譜純甲醇稀釋混合脂肪酸樣品取上清液，裝入色譜進樣瓶，密封。

色譜分析條件：HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID檢測器；初始溫度40 ℃(保持2 min)，以10 ℃/min的升溫速率升到280 ℃(保持2 min)；進樣口溫度250 ℃，進樣量1.0 μL；不分流，氦氣載氣，流速1 mL/min。

質(zhì)譜分析條件：EI電離源，接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍30～500 u。

2 結(jié)果與分析

按照公式計算粗脂肪質(zhì)量分數(shù)為66.4%，混合脂肪酸收率為27.3%；富集脂肪酸樣品的總離子流色譜圖如圖1所示，共鑒定出30種化合物，通過面積歸一化法計算出各組分的質(zhì)量分數(shù)(見表1)。

圖1 富集皮諾斂酸脂肪酸總離子流色譜圖

從圖1和表1分析可知：皮諾斂酸(C18∶3)甲酯質(zhì)量分數(shù)最高達到45.8%，其次亞麻酸質(zhì)量分數(shù)為16.32%、亞油酸質(zhì)量分數(shù)4.88%、油酸質(zhì)量分數(shù)0.52%。國內(nèi)外學(xué)者對松子油的成分進行分析，朱雪梅等[11]測定松仁油中主要成分包括亞油酸、油酸和松油酸，其中亞油酸質(zhì)量分數(shù)46.29%、油酸質(zhì)量分數(shù)26.68%、松油酸質(zhì)量分數(shù)13.84%。張彧等[6]測定松油酸質(zhì)量占脂肪酸總質(zhì)量的第三位，質(zhì)量分數(shù)為14.8%；通過尿素包合法多次包合后，多不飽和脂肪酸收率為11.69%、松油酸質(zhì)量分數(shù)最高可達85.92%。孫宇[9]實驗中發(fā)現(xiàn)，尿素用量對松油酸富集情況影響較大，在乙醇比例、反應(yīng)溫度、結(jié)晶時間等條件不變的情況下，脂肪酸與尿素質(zhì)量分數(shù)在1∶1時，富集后脂肪酸中松油酸質(zhì)量分數(shù)為63.11%、收率為32.69%。Lee et al.[10]的實驗中也記載了通過尿素包合法富集后的脂肪酸中，皮諾斂酸的質(zhì)量分數(shù)由原先的14.1%提高到45.1%，皮諾斂酸質(zhì)量分數(shù)提高了3倍左右，飽和脂肪酸棕櫚酸結(jié)晶后幾乎被消除，油酸質(zhì)量分數(shù)也有效降低。劉靜波等[3]從冷榨法的紅松子油中，鑒定出了棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、二十碳三烯酸、二十碳二烯酸、二十碳烯酸、二十碳酸等8種脂肪酸。常晨等[12]通過GC-MS分析，鑒定出松子油中棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生酸等成分的質(zhì)量分數(shù)。

3 結(jié)論

氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)成分分析結(jié)果表明：經(jīng)過尿素包合法(液料比為m(脂肪酸)∶V(乙醇)=1 g∶12 mL，m(脂肪酸)∶m(尿素)=1.0∶1.5)富集后的混合脂肪酸中，皮諾斂酸(C18∶3)甲酯質(zhì)量分數(shù)最高達到45.8%，其次亞麻酸質(zhì)量分數(shù)為16.32%、亞油酸質(zhì)量分數(shù)4.88%、油酸質(zhì)量分數(shù)0.52%。從脂肪酸質(zhì)量分數(shù)可以看出，經(jīng)本方法純化富集后的脂肪酸收率雖然較低，但對人體有益的多不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)明顯增加，大部分飽和脂肪酸以及單不飽和脂肪酸與尿素形成穩(wěn)定的包合物，從而被過濾析出，多不飽和脂肪酸因其空間構(gòu)型較大不易形成包合物，得到較高純度的混合脂肪酸，說明尿素包合法是富集多不飽和脂肪酸的有效方法。

表1 混合脂肪酸GC-MS成分分析結(jié)果

[1] 陳寶，南江，王星，等.松子的開發(fā)與利用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010(20)：160.

[2] 董越，劉會平，劉易坤，等.松子油提取工藝及3種松子油脂肪酸組成分析[J].中國油脂，2017，42(4)：8-11.

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[4] 李哲敏.松子仁的營養(yǎng)保健功能[J].農(nóng)牧產(chǎn)品開發(fā)，2001(7)：23-24.

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[6] 張彧，李清光，萬惠萍，等.尿素包合法富集松油酸的研究[J].食品與機械，2008，24(4)：53-55，64.

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[11] 朱雪梅，阮霞，胡蔣寧，等.松籽油脂肪酸組成及分布特征分析[J].食品工業(yè)科技，2012，33(10)：65-68.

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EnrichmentAnalysisofFattyAcidsinPinuskoraiensisSeedOilbyUreaInclusionFractionation//

Yang Mingfei

(Research and Development Department of Kitanihon Pharmaceutical CO., Toyama 9300314, Japan);

Su Wen

(Public Medical Institutions Management Center, Doumen District, Zhuhai, Guangdong Province, P. R. China);

Wang Haiying

(Northeast Forestry University)//

Pinuskoraiensisseed oil； Pinolenic acid； Fatty acid； Urea inclusion fractionation

楊明非，男，1989年10月生，北日本制藥株式會社產(chǎn)品研發(fā)室，臨床醫(yī)學(xué)碩士。E-mail：ymfarcher@163.com。

王海英，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，副教授。E-mail：haiyingwang908@126.com。

2017年7月28日。

責(zé)任編輯：張 玉。

S789.7

Journal of Northeast Forestry University，2017,45(11)：111-113.

Pinolenic acid inPinuskoraiensisseed oil was enriched and purified by urea inclusion fractionation, liquid material ratiom(fatty acid)∶V(ethanol)=1 g∶12 mL,m(fatty acid)∶m(urea)=1.0∶1.5). The content of each component in the mixed fatty acid was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Under the optimum conditions, the content of enriched pinolenic acid was increased obviously. The content of pinolenic acid (C18∶3) methyl ester in the mixed fatty acids after enrichment was up to 45.8%, followed by gamolenic acid of 16.32%, 9,12-octadecadienoic acid of 4.88%. The content of fatty acids after enrichment by urea inclusion fractionation is lower, but that of polyunsaturated fatty acids beneficial to the human body is significantly increased.