張浩亮 趙 松

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

食管鱗狀細(xì)胞癌患者血漿α-2-HS-糖蛋白和S100A9蛋白水平及意義

張浩亮 趙 松

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

目的評估食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)血漿外泌體中表達(dá)上調(diào)的α-2-HS-糖蛋白(AHSG)和S100A9蛋白是否有潛力作為ESCC早期診斷的血漿外泌體腫瘤標(biāo)志物。方法通過對46例ESCC血漿標(biāo)本及46例健康對照組血漿標(biāo)本差異蛋白進(jìn)行Western印跡驗證，如果結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，接著再利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗進(jìn)行大樣本的蛋白定量驗證。結(jié)果Western印跡實驗結(jié)果表明，AHSG和S100A9在ESCC患者血漿外泌體中表達(dá)量與對照組相比明顯升高。ELISA驗證結(jié)果表明，ESCC組和對照組血漿外泌體中AGSH和S100A9濃度存在顯著差異。結(jié)論兩種蛋白可以作為ESCC早期診斷的血漿外泌體腫瘤標(biāo)志物，但尚需進(jìn)行更大批次臨床樣本的實驗驗證，同時還需要對這兩種蛋白的特異性進(jìn)行分析。

食管癌；鱗狀細(xì)胞癌；α-2-HS-糖蛋白(AHSG)；S100A9蛋白

約90%的食管癌(EC)患者病理類型屬于食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)。大多數(shù)ESCC病人被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)屬于腫瘤晚期。早期診斷和早期治療可獲得較好的預(yù)后效果。Western印跡通過分析著色的位置及著色深度進(jìn)而獲得特定蛋白質(zhì)在待分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況〔1〕。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗首先將待測物與酶進(jìn)行耦聯(lián)反應(yīng)，利用抗原與抗體的發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)的屬性使酶與底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，用于蛋白的定量測定〔2〕。本研究擬選取在ESCC血漿外泌體中表達(dá)上調(diào)的α-2-HS-糖蛋白(AHSG)和S100A9蛋白〔3〕，評估其是否有潛力作為ESCC早期診斷的血漿外泌體腫瘤標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 46例ESCC血漿標(biāo)本均來自2015年1～5月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科住院患者，且均為患者手術(shù)時獲得，未經(jīng)放化療等治療。ESCC組男26例，女20例，年齡40～60歲，TNM分期T3～T4 N0M0，病理學(xué)類型均為ESCC。46例對照組血漿標(biāo)本來自2015年5月本院體檢科的健康體檢者，男26例，女20例，年齡40～60歲。本實驗經(jīng)本院倫理委員會同意，且受試者知情同意。血漿處理步驟：取抗凝全血4℃，4 000 r/min離心10 min，上清即為血漿標(biāo)本，分裝后凍存于-80℃冰箱中備用。

1.2主要試劑 丙烯酰胺、溴酚藍(lán)、甲叉雙丙烯酰胺、N-三羥基氨甲烷苯甲基磺酰氟、甘氨酸、二硫蘇糖醇、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉、乙二胺四乙酸等均購自Sigma公司；聚偏氟乙烯膜(PVDF)購自德國Whatman公司；EttanTM 2-D Quant Kit 試劑盒購自GE Healthcare公司。AHSG兔源性多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，羊抗兔HRP、S100A9小鼠源性單克隆抗體購自美國Abcam公司。脫脂奶粉及羊抗鼠HRP均購自美國Santa Cruz公司。檢測HRP化學(xué)發(fā)光底物的試劑盒購自Asbio Technology公司。 AHSG和S100A9 ELISA Kit、購自武漢華美生物工程有限公司。所有溶液均用超純水配制，其他試劑為國產(chǎn)分析純級別。

1.3主要儀器設(shè)備 電熱恒溫干燥箱購自上海躍進(jìn)醫(yī)療電器廠。-80℃低溫冰箱以及恒溫?fù)u床購自美國New Brunseick Scientific公司。電子分析天平購自德國Meilteler公司。電熱恒溫金屬水浴箱購自杭州大和熱磁電子有限公司。Hoefer Mini VE垂直電泳系統(tǒng)購自美國GE公司。IS2000R圖像采集工作站購自美國Kodak公司。Mimi Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.4血漿標(biāo)本的蛋白定量 按照Bradford蛋白定量試劑盒說明書的操作步驟測定樣本蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)待測蛋白樣品的OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的蛋白質(zhì)濃度。

1.5Western印跡檢測 隨機(jī)選取4例ESCC患者血漿標(biāo)本(男女各2例)、4例健康人血漿標(biāo)本(男女各2例)，分別提取血漿外泌體進(jìn)行Western印跡驗證。配制12%下層膠或分離膠，配制5%上層膠或濃縮膠；取相等總蛋白量的蛋白與5倍上樣緩沖液混勻后，98℃金屬浴加熱5 min，冷卻后上樣；30 mA恒電流電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)膠下緣約0.5 cm時，結(jié)束電泳。取出SDS-PAGE膠，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，所用參數(shù)設(shè)置是250 mA恒流15 min，350 mA恒流60 min；封閉使用1∶1 000稀釋比例的抗AHSG及抗S100A9抗體，4℃孵育過夜；室溫下將膜與1/5 000稀釋的HPR標(biāo)記的二抗混合，孵育1 h，用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，利用IS2000R圖像工作站來進(jìn)行WB圖像采集；PVDF膜經(jīng)全自動圖像分析系統(tǒng)掃描后，通過條帶灰度值的變化可以間接定量分析蛋白質(zhì)條帶的相對含量的變化。

1.6ELISA檢測 隨機(jī)抽取40例ESCC患者血漿(男27例，女13例)及40例健康人血漿(男22例，女18例)ELISA實驗驗證。首先分別設(shè)置空白樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)樣品孔及待測樣品孔。按說明書進(jìn)行操作?？瞻卓准尤?00 μl的樣品稀釋緩沖液，其他孔分別加入100 μl的標(biāo)準(zhǔn)品或者待檢測樣品。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS17.0軟件進(jìn)行Levene檢驗、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Western印跡檢測結(jié)果 AHSG在ESCC組血漿外泌體中表達(dá)量與對照組相比，呈現(xiàn)明顯升高，AHSG灰度值的平均值在ESCC組升高約2.9倍左右。見圖1。S100A9在ESCC組血漿外泌體中表達(dá)量與對照組相比較，呈現(xiàn)明顯的升高，S100A9灰度值的平均值在ESCC組升高約2.8倍，見圖1。

圖1 AHSG、S100A9蛋白Western印跡分析

2.2ELISA檢測結(jié)果 在對照組血漿外泌體中，AHSG的濃度為(70.3±2.2)μg/ml，在ESCC組血漿外泌體中濃度為(150.1±4.6)μg/ml，二者差異顯著(Plt;0.05)。S100A9在對照組血漿外泌體的濃度為(46.9±1.4)μg/ml，在ESCC組血漿外泌體中濃度為(112.5±2.9)μg/ml，兩組有顯著差異(Plt;0.05)。

3 討 論

腫瘤標(biāo)志物是在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中能夠反映腫瘤進(jìn)程的一些差異變化的分子。要確定一個分子是否可以作為腫瘤標(biāo)志物，需要進(jìn)行大樣本的臨床驗證，需要對該分子的可靠性、重復(fù)性和特異性等進(jìn)行觀察和統(tǒng)計學(xué)分析，才能得出可信的結(jié)論〔4〕。隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，研究熱點已經(jīng)逐步由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)向功能基因組學(xué)發(fā)生轉(zhuǎn)移〔5，6〕。然而蛋白質(zhì)組屬于功能基因組學(xué)的一個重要組成部分，廣泛應(yīng)用在藥物靶標(biāo)篩選、疾病的診療、疾病的發(fā)病機(jī)制的研究中，產(chǎn)生了一批非常有價值的研究成果〔7〕。蛋白組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在惡性腫瘤的早期檢測中找到新的分子標(biāo)志物，例如，頭頸腫瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等，并且這些標(biāo)志物具有高度的敏感性和特異性〔8～10〕。由于大部分候選腫瘤標(biāo)志物的敏感度和特異性達(dá)不到要求，導(dǎo)致大量候選腫瘤標(biāo)記物被放棄〔4〕。ESCC患者血漿外泌體相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)研究國內(nèi)外研究相對較少，目前尚沒有應(yīng)用于臨床的特異性血漿外泌體腫瘤標(biāo)志物〔11〕。本研究與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致〔3〕。進(jìn)一步證實了蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性，同時也提示這兩種蛋白可以作為ESCC早期診斷的血漿外泌體腫瘤標(biāo)志物。但是，尚需要進(jìn)行更大批次臨床樣本的實驗驗證，同時還需要對這兩種蛋白的特異性進(jìn)行分析。AHSG也稱為熱穩(wěn)定性糖蛋白，胎兒期的多種組織均能合成此蛋白，然而對于成年人來說，該蛋白主要是由肝臟合成，AHSG屬于骨基質(zhì)的一種重要組成成分，半衰期為4～5 d〔12，13〕。多項研究表明，AHSG是一個多功能性蛋白，在多種癌癥血漿中的表達(dá)水平不同〔12～15〕。同時，它也是一種負(fù)急性時相反應(yīng)蛋白，在惡性腫瘤、感染、大手術(shù)后或者營養(yǎng)不良時，血清AHSG水平明顯下降。另外，AHSG還參與骨代謝調(diào)節(jié)、血管鈣化、胰島素抵抗、蛋白酶活性調(diào)控、角質(zhì)形成細(xì)胞遷移及乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等病理生理過程，是一種神經(jīng)退行性疾病的生物標(biāo)志物〔16〕。有報道表明，AHSG可能是通過阻斷TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制腸道腫瘤的進(jìn)展〔17〕。然而，本研究結(jié)果表明，在ESCC患者血漿外泌體中發(fā)現(xiàn)AHSG的表達(dá)上調(diào)，與以往癌癥血漿中AHSG表達(dá)下調(diào)相比較而言，AHSG在血漿外泌體的表達(dá)量與血漿種AHSG的水平不太一致。推測AHSG蛋白有可能會成為與ESCC密切相關(guān)的特異性血漿外泌體腫瘤標(biāo)志物。

S100A9是一種鈣離子結(jié)合蛋白，常以同源二聚體的形式存在，或者與S100A8形成異源二聚體，具有EF手型結(jié)構(gòu)〔18〕。S100A9是一種高豐度的脊髓源性質(zhì)漿蛋白，表達(dá)S100A8/A9的巨噬細(xì)胞能夠被募集到很多癌癥的炎癥部位，例如，胰腺癌、胃癌、小細(xì)胞肺癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等〔19〕。S100A9在細(xì)胞膜上的受體是Toll樣受體4和RAGE，其介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在炎癥的級聯(lián)信號放大中扮演重要角色〔20〕。亞硝?；腟100A9能夠降低炎癥的反應(yīng)程度，并且S100A9還能調(diào)控著骨髓細(xì)胞的成熟〔21〕。另外，S100A9在很多癌癥中表達(dá)上調(diào)〔22〕。本實驗結(jié)果表明，在ESCC組血漿外泌體中表達(dá)明顯上調(diào)，S100A9可能是一個ESCC潛在的血漿外泌體腫瘤標(biāo)志物。

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〔2017-01-10修回〕

(編輯 李相軍)

R655.4

A

1005-9202(2017)21-5351-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.060

趙 松(1963-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事胸部疾病研究。

張浩亮(1981-)，男，主治醫(yī)師，主要從事胸部疾病研究。