馬佐鵬 王曉巍 郝麗娟 龐懷霞 葛 塬

(青海紅十字醫(yī)院耳鼻喉科，青海 西寧 810000)

SLC52A3基因多態(tài)性與鼻咽癌易感性的關(guān)系

馬佐鵬 王曉巍1郝麗娟 龐懷霞 葛 塬

(青海紅十字醫(yī)院耳鼻喉科，青海 西寧 810000)

目的探討核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC52A3基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與鼻咽癌易感性的關(guān)系。方法采用Haploview 軟件從國際人類基因組單體型圖計(jì)劃(Hap Map)公布的北京漢族人群基因型數(shù)據(jù)庫中篩選出SLC52A3基因3個(gè)標(biāo)簽SNPs(rs13042395、rs3746803及rs3746804)，收集147例鼻咽癌患者外周血標(biāo)本并采用直接測序法進(jìn)行基因分型，選取159例健康體檢者的外周血作對比，采用Hardy-Weinberg平衡分析3個(gè)SNPs位點(diǎn)的遺傳平衡情況，比較鼻咽癌患者與健康對照rs13042395、rs3746803及rs3746804基因型和等位基因的分布差異并計(jì)算比值比(OR)及其95%置信區(qū)間(CI)來評價(jià)以上SNPs與鼻咽癌易感性的關(guān)系，同時(shí)分析SLC52A3 SNPs與常見臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果147例鼻咽癌患者rs13042395、rs3746803及rs3746804基因型和等位基因的分布符合Hardy-Weinberg平衡。疾病組與對照組rs13042395基因型分布的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，但疾病組等位基因C的比例高于對照組(Plt;0.05)，其中以CC基因型為參照，TT及CT+TT基因型發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)降低至0.522、0.575倍(Plt;0.05)，T相對于C等位基因發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)降低至0.719倍(Plt;0.05)。rs3746804分布上，疾病組TT基因型及等位基因T的比例均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，其中以CC基因型為參照，CT、TT及CT+TT基因型發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)降低至0.501、0.400和0.466倍(Plt;0.05)；以C等位基因?yàn)閰⒄眨琓發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)降低至0.588倍(Plt;0.05)。rs3746803基因型及等位基因分布與鼻咽癌易感性無關(guān)。結(jié)論SLC52A3 rs13042395、rs3746804與鼻咽癌易感性及臨床分期有關(guān)，其中攜帶等位基因T的鼻咽癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低，在鼻咽癌早期篩查中有一定價(jià)值。

鼻咽癌；SLC52A3；單核苷酸多態(tài)性；易感性

鼻咽癌是一種Epstein Barr病毒(EBV)相關(guān)的惡性腫瘤，發(fā)病具有明顯的地域和種族差異，在我國南方地區(qū)高發(fā)〔1〕。對于早期鼻咽癌，放療是一種有效的治愈手段，但晚期患者的治療效果較差〔2〕。鼻咽癌的發(fā)病過程涉及多個(gè)基因，且基因與環(huán)境間的作用亦參與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展〔3〕。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)被認(rèn)為是預(yù)測各種癌癥的易感性及預(yù)后的穩(wěn)定和有效的生物標(biāo)志物〔4〕。SLC52A3也稱為C20orf54，定位于人20號染色體上，編碼人類核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(RFT)2，可以特異性跨膜的方式將核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，在核黃素平衡中發(fā)揮作用〔5〕。SLC52A3基因的SNPs與食管鱗狀細(xì)胞癌的易感性相關(guān)〔6〕，目前尚未見該基因SNPs與鼻咽癌易感性的研究。本研究探討SLC52A3基因的SNPs與鼻咽癌易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1對象 收集2013年1月至2016年6月青海紅十字醫(yī)院經(jīng)病理確診的鼻咽癌患者147例，均為漢族，男85例，女62例，年齡29～71歲，中位年齡58.0歲，lt;60歲94例，≥60歲53例；ECOG評分0～1分77例，2分70例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期91例，Ⅲ、Ⅳ期56例；病理類型：鱗癌126例，腺癌21例；T分期：T1、T2期88例，T3、T4期59例；N分期：N0～N2期86例，N3期61例。本研究患者未合并其他腫瘤且均簽署知情同意書。選取同期的159例健康體檢者作對照，男91例，女68例，年齡31～74歲，中位年齡58.0歲。兩組例數(shù)、性別及年齡的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(Pgt;0.05)。

1.2樣本收集及處理 147例鼻咽癌患者均于入院后第2天治療前抽取外周靜脈血5 ml，置于含EDTA的抗凝真空采血管中，3 000 r/min離心10 min后，取上清200 μl分裝，采用天根血液基因組DNA提取試劑盒，依據(jù)說明書提取基因組DNA，要求DNA純度和完整性較好，OD260/OD280值1.8～2.0，DNA無降解現(xiàn)象，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)樣本取20 ng 樣本DNA采用Applied Biosystems進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3SNPs位點(diǎn)篩選及基因分型 采用Haploview 軟件從國際人類基因組單體型圖計(jì)劃(Hap Map)公布的北京漢族人群基因型數(shù)據(jù)庫(URL:http://www.hapmap.org/index.html.en)中篩選出SLC52A3基因3個(gè)標(biāo)簽SNPs(rs13042395、rs3746803及rs3746804)，要求最小等位基因頻率 MAFgt;0.05和連鎖不平衡參數(shù)r2gt;0.8。針對篩選的以上3個(gè)SNPs，由蘇州金唯智公司設(shè)計(jì)并合成PCR擴(kuò)增及延伸引物，采用直接測序法進(jìn)行基因分型。

1.4評價(jià)指標(biāo) (1)采用Hardy-Weinberg平衡分析3個(gè)SNPs位點(diǎn)的遺傳平衡情況；(2)比較鼻咽癌患者與健康對照rs13042395、rs3746803及rs3746804基因型和等位基因的分布差異并計(jì)算比值比(OR)及其95%置信區(qū)間(CI)來評價(jià)以上SNPs與鼻咽癌易感性的關(guān)系；(3)分析SLC52A3 SNPs與常見臨床病理參數(shù)(性別、年齡、ECOG評分、病理類型、臨床分期、N分期和T分期)的關(guān)系。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件，SNP基因型及等位基因型分布比較采用χ2檢驗(yàn)，試驗(yàn)樣本群體SNP位點(diǎn)多樣性進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，計(jì)算OR及其95%CI。

2 結(jié) 果

2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 147例鼻咽癌患者rs13042395、rs3746803及rs3746804基因型和等位基因的分布與預(yù)測值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，表明本研究選取的鼻咽癌人群具有代表性，分布符合Hardy-Weinberg平衡。見表1、表2。

2.2兩組SLC52A3基因SNP的分布情況 疾病組與對照組rs13042395基因型分布的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，但疾病組等位基因C的比例顯著高于對照組(Plt;0.05)；兩組rs3746803基因型及等位基因分布的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；rs3746804分布上，疾病組TT基因型及等位基因T的比例均顯著低于對照組(Plt;0.01)。見表3。

2.3SLC52A3基因SNP位點(diǎn)與鼻咽癌易感性的關(guān)系 (1)rs13042395：以CC基因型為參照，TT及CT+TT基因型發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)降低至0.522、0.575倍(Plt;0.05)，而CT發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)未改變(Pgt;0.05)；以C等位基因?yàn)閰⒄?，T發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)降低至0.719倍(Plt;0.05)。(2)rs3746803：以GG基因型為參照，GA、AA及GA+AA基因型發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)未改

變(Pgt;0.05)；以G等位基因?yàn)閰⒄眨珹發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)亦未發(fā)生明顯改變(Pgt;0.05)。(3)rs3746804：以CC基因型為參照，CT、TT及CT+TT基因型發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)降低至0.501、0.400和0.466倍(Plt;0.01)；以C等位基因?yàn)閰⒄眨琓發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)降低至0.588倍(Plt;0.01)。見表4。

表1 147例鼻咽癌患者SLC52A3基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

表2 147例鼻咽癌患者SLC52A3等位基因的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

表3 兩組SLC52A3基因SNP位點(diǎn)的分布情況〔n(%)〕

表4 SLC52A3基因SNP位點(diǎn)與鼻咽癌易感性的關(guān)系〔n(%)〕

續(xù)表4 SLC52A3基因SNP位點(diǎn)與鼻咽癌易感性的關(guān)系〔n(%)〕

2.4鼻咽癌SLC52A3基因多態(tài)性與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 rs13042395：鼻咽癌rs13042395基因多態(tài)性分布與性別、年齡、ECOG評分、病理類型及N分期均無關(guān)(Pgt;0.05)，而與臨床分期和T分期均有關(guān)(Plt;0.05)。見表5。rs3746804：鼻咽癌rs3746804基因多態(tài)性分布與性別、年齡、ECOG評分、病理類型、T分期及N分期均無關(guān)(Pgt;0.05)，而與臨床分期有關(guān)(Plt;0.05)。見表6。

表5 鼻咽癌rs13042395基因多態(tài)性與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表6 鼻咽癌rs3746804基因多態(tài)性與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討 論

SLC52A3在機(jī)體核黃素吸收中發(fā)揮重要作用，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔7〕。SLC52A3在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如食管鱗狀細(xì)胞癌組織的SLC52A3高于癌旁組織，且在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中下調(diào)SLC52A3表達(dá)可達(dá)到抑制細(xì)胞增殖和集落形成，而當(dāng)SLC52A3過表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及對順鉑的耐藥過程〔8〕。核黃素可維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，是葉酸代謝的重要物質(zhì)，同時(shí)參與了氧化還原反應(yīng)過程，其水平異?？纱龠M(jìn)亞硝胺類致癌物誘發(fā)食管的癌變，而補(bǔ)充核黃素可降低食管癌高發(fā)區(qū)域的風(fēng)險(xiǎn)〔9〕。目前已證實(shí)SLC52A3存在多個(gè)SNPs位點(diǎn)，直接影響了核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的過程，從而導(dǎo)致膳食補(bǔ)充核黃素的療效存在個(gè)體差異〔10,11〕。以上證據(jù)提示SLC52A3基因多態(tài)性可能對于鼻咽癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有一定影響。

本研究根據(jù)已報(bào)道的與惡性腫瘤易感性有關(guān)的SNPs位點(diǎn)，同時(shí)遵循最小等位基因頻率 MAFgt;0.05和連鎖不平衡參數(shù)r2gt;0.8的篩選策略，通過構(gòu)建單體型挑選出覆蓋SLC52A3的3個(gè)標(biāo)簽SNPs(rs13042395、rs3746803及rs3746804)。本研究通過Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所選取147例鼻咽癌患者在這3個(gè)SNPs的基因型和等位基因分布整體上符合孟德爾遺傳平衡法則，該鼻咽癌群體具有一定的代表性。研究表明攜帶rs13042395 T發(fā)揮保護(hù)作用，推測可能原因?yàn)镃等位基因可能促進(jìn)SLC52A3過表達(dá)，可能通過與某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合有關(guān)，但具體起效因子尚不清楚。與本研究推測一致，Tan等〔12〕的研究發(fā)現(xiàn)攜帶rs13042395 C者的SLC52A3蛋白水平高于未攜帶者。rs3746803基因型及等位基因分布與鼻咽癌易感性無關(guān)。另一項(xiàng)研究同樣也發(fā)現(xiàn)rs3746803與口腔鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)〔13〕。SNP rs3746804位于該基因的外顯子3區(qū)域，其C→T突變可導(dǎo)致第267位氨基酸由脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?，可能會通過影響該蛋白的空間構(gòu)型，繼而影響SLC52A3對核黃素的轉(zhuǎn)運(yùn)效果〔14〕。本研究發(fā)現(xiàn)rs3746803亦與鼻咽癌易感性有關(guān)，進(jìn)一步分析顯示rs13042395及rs3746804與臨床分期有關(guān)，且rs13042395還與T分期有關(guān)，更加強(qiáng)調(diào)SLC52A3 SNPs在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用。綜上所述，SLC52A3 rs13042395、rs3746804與鼻咽癌易感性及臨床分期有關(guān)，其中攜帶等位基因T的鼻咽癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低，在鼻咽癌早期篩查中有一定價(jià)值。

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〔2017-01-15修回〕

(編輯 徐 杰)

R73

A

1005-9202(2017)21-5346-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.058

西寧市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2015B01024)

1 北京協(xié)和醫(yī)院耳鼻喉科

馬佐鵬(1980-)，男，主治醫(yī)師，主要從事耳鼻喉科、眩暈、甲狀腺外科研究。