李 芹 沈飛揚(yáng) 賈筱琴 王成海

(揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

uc.189 在宮頸癌組織中的表達(dá)及意義

李 芹 沈飛揚(yáng)1賈筱琴1王成海1

(揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

目的研究超保守序列uc.189 在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與病理分級(jí)及臨床分期的關(guān)系。方法從40例宮頸癌及40例宮頸正常組織中提取總RNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)uc.189 mRNA水平表達(dá)變化，分析其與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果與癌旁正常組織相比，uc.189 mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯增高(Plt;0.05)，其高表達(dá)與宮頸癌的病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。結(jié)論宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與uc.189的高表達(dá)密切相關(guān)。

uc.189；超保守RNA；宮頸癌；病理分級(jí)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

近年研究表明宮頸癌的發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，且腺癌比例也逐漸增加〔1〕。超保守RNA(UCR)是一類(lèi)生物進(jìn)化中絕對(duì)高度保守的非編碼DNA分子，由超過(guò)200個(gè)核苷酸的基因序列組成。目前研究發(fā)現(xiàn)481種UCR的基因序列，它們廣泛存在于人、小鼠和大鼠等生物中〔2,3〕，在不同的動(dòng)物物種中UCR基因序列一模一樣。這些UCR中許多都能轉(zhuǎn)錄成RNA，其功能主要是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)RNA分子來(lái)調(diào)控編碼和其他非編碼基因的表達(dá)，進(jìn)一步影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、侵襲轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)過(guò)程，其與癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系更是當(dāng)前腫瘤研究新熱點(diǎn)之一〔4～6〕。本研究檢測(cè)uc.189的表達(dá)與宮頸癌病理特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科2014年6月至2015年5月手術(shù)患者40例，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)宮頸癌，年齡33～76(平均58.6)歲，所有患者術(shù)前未經(jīng)過(guò)放療、化療處理，并簽署知情同意書(shū)。新鮮組織標(biāo)本采集后立即放入液氮罐里，-80℃冰箱長(zhǎng)期保存。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成 uc.189與內(nèi)參U6的qRT-PCR 引物序列由本實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)提供，合成的引物購(gòu)買(mǎi)于上海生工生物工程公司。uc.189上游引物5′-CAGAGTCACCATCATGTCTC-3′，下游引物5′-AAGGCTGCTGCTGTAGTTGT-3′；U6-上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，U6-下游引物5′- CGCTTCAC GAATTTGCGTGT-3′。

1.3提取總RNA 實(shí)驗(yàn)步驟如下：稱(chēng)取0.1 g新鮮標(biāo)本放入研缽(經(jīng)液氮預(yù)冷)中研磨成細(xì)粉狀；迅速用藥匙取細(xì)粉加入含1 ml TRizol離心管中；室溫下10 min劇烈振蕩，讓細(xì)粉充分裂解，靜止數(shù)秒；4℃ 12 000 r/min，離心10 min；將上清液取入新離心管，加入200 μl 氯仿；室溫下振蕩5 min 期間不斷振蕩，靜置2 min；4℃ 12 000 r/min，離心10 min；將上清液迅速加入新離心管，取500 μl 異丙醇緩慢顛倒入離心管。室溫沉淀20 min，然后4℃ 12 000 r/min，離心10 min，棄上清；離心管加入1 ml 75%乙醇，小心棄上清，再加入1 ml 75%乙醇振蕩器振蕩使沉淀懸浮，4℃ 10 000 r/min，離心5 min，棄上清。超凈臺(tái)中自然干燥2 min，加入16 μl DEPC 處理的雙蒸水溶解。提取總RNA 1 μl后檢測(cè) OD 值，A260/280比值在1.8～2.2之間，為高純度RNA，并調(diào)整RNA濃度，或進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或保存于-80℃。

1.4合成cDNA 使用Takara生物公司PrimeScript RT試劑盒Perfect Real Time試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。反應(yīng)體系共10 μl，RNA約40 ng，5倍上樣緩沖液2μl，PrimeScript RT酶混合物Ⅰ0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，添加DEPC水調(diào)整體系至10 μl。反應(yīng)條件37℃ 15 min，85℃ 5 s，反應(yīng)產(chǎn)物保存于4℃。

1.5qRT-PCR 使用Takara生物公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Perfect Real Time 試劑盒，反應(yīng)體系為20 μl，具體包括 1 μl cDNA，10 μl 2×SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，上下游引物各0.5 μl，加DEPC水調(diào)整反應(yīng)體系至20 μl，每組樣本有3個(gè)復(fù)孔，小分子RNA-U6被設(shè)置為內(nèi)參；實(shí)驗(yàn)在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR儀器上進(jìn)行。最后讀取定量PCR反應(yīng) Ct 值，計(jì)算2-ΔΔCt。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1qRT-PCR 結(jié)果分析 宮頸癌組與癌旁正常組uc.189 mRNA表達(dá)差異顯著〔(9.76±4.112)vs (4.76±1.426),Plt;0.05〕。

2.2宮頸癌組織中uc.189 mRNA的表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系 宮頸癌組織uc.189 mRNA的表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)(Plt;0.05)，與年齡、腫瘤分型、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和病理分期均無(wú)相關(guān)性(Pgt;0.05)。見(jiàn)表1。

表1 宮頸癌組織中uc.189 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

女性第一位最常見(jiàn)的惡性腫瘤是乳腺癌，第二位常見(jiàn)的惡性腫瘤是宮頸癌，而且宮頸癌是女性第四位病死的原因〔7〕。目前在全球范圍宮頸癌的發(fā)病率有所下降，但在發(fā)展中國(guó)家仍呈上升的趨勢(shì)〔8〕。研究表明我國(guó)每年新增宮頸癌的病例約10萬(wàn)例，局部地區(qū)的發(fā)病率和死亡率都有增長(zhǎng)趨勢(shì)，而且還呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)〔9〕。

目前與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)的因素包括細(xì)菌和病毒等微生物的感染、宮頸的損傷及早婚早育早產(chǎn)。已有研究證實(shí)，p53和k-ras基因的突變〔10,11〕，c-myc、HER-2 和EGFR基因的過(guò)表達(dá)以及PTEN基因低表達(dá)均與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔12～14〕?？傊?，多種致病因素相互疊加綜合作用與正常的宮頸細(xì)胞，最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

目前認(rèn)為非編碼蛋白的RNA分子包括微小RNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA和超保守RNA等，它們可以轉(zhuǎn)錄成RNA，但不能翻譯成蛋白質(zhì)；主要功能是調(diào)控相關(guān)的RNA分子從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)編碼基因或非編碼基因的表達(dá)。當(dāng)前的研究熱點(diǎn)集中于微小RNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA。比如在microRNA與宮頸癌的關(guān)系中，microRNA124、microRNA218和microRNA101在宮頸癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，其調(diào)控的信號(hào)通路抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲轉(zhuǎn)移和增強(qiáng)對(duì)化療的敏感性等過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔15～17〕，而microRNA155和microRNA10a卻在宮頸癌組織中高表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移〔18,19〕；另外在長(zhǎng)鏈非編碼RNA與宮頸癌的關(guān)系研究中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA-HOTAIR在宮頸癌組織中顯著高表達(dá)，因此HOTAIR被認(rèn)為是一種癌基因，其與宮頸癌的惡性進(jìn)展與預(yù)后不佳密切相關(guān)〔20,21〕；而作為抑癌基因的長(zhǎng)鏈非編碼RNA：GAS5和LET則在宮頸癌中低表達(dá)，它們的作用是抑制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展〔22,23〕。

UCR是第3類(lèi)非編碼RNA分子，是由超過(guò)200個(gè)的堿基序列組成，目前發(fā)現(xiàn)了481種UCR的正鏈DNA及同樣數(shù)量的反鏈DNA的UCR，它們存在于小鼠、大鼠和人等生物中〔2,3〕，其基因序列絕對(duì)保守而一模一樣。他們可以轉(zhuǎn)錄成RNA分子，調(diào)控其他的RNA分子影響DNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯等，從而進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞的分化發(fā)育、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后，并且參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，因此UCR與癌癥發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系越來(lái)越成為腫瘤研究新的熱點(diǎn)。目前UCR科學(xué)家們已經(jīng)在肝癌，大腸癌 白血病和膠質(zhì)瘤進(jìn)行了大量的科學(xué)研究〔4～6〕。

本研究提示uc.189可能作為一個(gè)促癌基因，參與了宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，為宮頸癌的臨床診斷治療提供了一個(gè)潛在的生物學(xué)靶點(diǎn)。

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〔2016-08-26修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

R737.33

A

1005-9202(2017)21-5342-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.056

江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”資助項(xiàng)目(2012～2015)；揚(yáng)州市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃-社會(huì)發(fā)展(YZ2016065)

1 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院

王成海(1967-)，男，博士，副教授，主要從事腫瘤與中藥干預(yù)治療研究。

李 芹(1973-)，女，碩士，副教授，主要從事婦產(chǎn)科基礎(chǔ)研究。