李 芹 沈飛揚 賈筱琴 王成海

(揚州市職業(yè)大學醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009)

uc.189 在宮頸癌組織中的表達及意義

李 芹 沈飛揚1賈筱琴1王成海1

(揚州市職業(yè)大學醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009)

目的研究超保守序列uc.189 在宮頸癌組織中的表達及其與病理分級及臨床分期的關(guān)系。方法從40例宮頸癌及40例宮頸正常組織中提取總RNA，運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測uc.189 mRNA水平表達變化，分析其與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果與癌旁正常組織相比，uc.189 mRNA在宮頸癌組織中的表達明顯增高(Plt;0.05)，其高表達與宮頸癌的病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。結(jié)論宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與uc.189的高表達密切相關(guān)。

uc.189；超保守RNA；宮頸癌；病理分級；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

近年研究表明宮頸癌的發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢，且腺癌比例也逐漸增加〔1〕。超保守RNA(UCR)是一類生物進化中絕對高度保守的非編碼DNA分子，由超過200個核苷酸的基因序列組成。目前研究發(fā)現(xiàn)481種UCR的基因序列，它們廣泛存在于人、小鼠和大鼠等生物中〔2,3〕，在不同的動物物種中UCR基因序列一模一樣。這些UCR中許多都能轉(zhuǎn)錄成RNA，其功能主要是通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)RNA分子來調(diào)控編碼和其他非編碼基因的表達，進一步影響細胞的生長、分化、侵襲轉(zhuǎn)移及細胞凋亡，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生物學過程，其與癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系更是當前腫瘤研究新熱點之一〔4～6〕。本研究檢測uc.189的表達與宮頸癌病理特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取揚州大學臨床醫(yī)學院婦產(chǎn)科2014年6月至2015年5月手術(shù)患者40例，經(jīng)術(shù)后病理證實宮頸癌，年齡33～76(平均58.6)歲，所有患者術(shù)前未經(jīng)過放療、化療處理，并簽署知情同意書。新鮮組織標本采集后立即放入液氮罐里，-80℃冰箱長期保存。

1.2引物設(shè)計與合成 uc.189與內(nèi)參U6的qRT-PCR 引物序列由本實驗組設(shè)計提供，合成的引物購買于上海生工生物工程公司。uc.189上游引物5′-CAGAGTCACCATCATGTCTC-3′，下游引物5′-AAGGCTGCTGCTGTAGTTGT-3′；U6-上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，U6-下游引物5′- CGCTTCAC GAATTTGCGTGT-3′。

1.3提取總RNA 實驗步驟如下：稱取0.1 g新鮮標本放入研缽(經(jīng)液氮預(yù)冷)中研磨成細粉狀；迅速用藥匙取細粉加入含1 ml TRizol離心管中；室溫下10 min劇烈振蕩，讓細粉充分裂解，靜止數(shù)秒；4℃ 12 000 r/min，離心10 min；將上清液取入新離心管，加入200 μl 氯仿；室溫下振蕩5 min 期間不斷振蕩，靜置2 min；4℃ 12 000 r/min，離心10 min；將上清液迅速加入新離心管，取500 μl 異丙醇緩慢顛倒入離心管。室溫沉淀20 min，然后4℃ 12 000 r/min，離心10 min，棄上清；離心管加入1 ml 75%乙醇，小心棄上清，再加入1 ml 75%乙醇振蕩器振蕩使沉淀懸浮，4℃ 10 000 r/min，離心5 min，棄上清。超凈臺中自然干燥2 min，加入16 μl DEPC 處理的雙蒸水溶解。提取總RNA 1 μl后檢測 OD 值，A260/280比值在1.8～2.2之間，為高純度RNA，并調(diào)整RNA濃度，或進行下一步實驗或保存于-80℃。

1.4合成cDNA 使用Takara生物公司PrimeScript RT試劑盒Perfect Real Time試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。反應(yīng)體系共10 μl，RNA約40 ng，5倍上樣緩沖液2μl，PrimeScript RT酶混合物Ⅰ0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，添加DEPC水調(diào)整體系至10 μl。反應(yīng)條件37℃ 15 min，85℃ 5 s，反應(yīng)產(chǎn)物保存于4℃。

1.5qRT-PCR 使用Takara生物公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Perfect Real Time 試劑盒，反應(yīng)體系為20 μl，具體包括 1 μl cDNA，10 μl 2×SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，上下游引物各0.5 μl，加DEPC水調(diào)整反應(yīng)體系至20 μl，每組樣本有3個復(fù)孔，小分子RNA-U6被設(shè)置為內(nèi)參；實驗在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR儀器上進行。最后讀取定量PCR反應(yīng) Ct 值，計算2-ΔΔCt。

1.6統(tǒng)計學方法 采用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件和GraphPad Prism 5軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1qRT-PCR 結(jié)果分析 宮頸癌組與癌旁正常組uc.189 mRNA表達差異顯著〔(9.76±4.112)vs (4.76±1.426),Plt;0.05〕。

2.2宮頸癌組織中uc.189 mRNA的表達水平與臨床病理特征之間的關(guān)系 宮頸癌組織uc.189 mRNA的表達量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)(Plt;0.05)，與年齡、腫瘤分型、腫瘤大小、浸潤深度、遠端轉(zhuǎn)移和病理分期均無相關(guān)性(Pgt;0.05)。見表1。

表1 宮頸癌組織中uc.189 mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

女性第一位最常見的惡性腫瘤是乳腺癌，第二位常見的惡性腫瘤是宮頸癌，而且宮頸癌是女性第四位病死的原因〔7〕。目前在全球范圍宮頸癌的發(fā)病率有所下降，但在發(fā)展中國家仍呈上升的趨勢〔8〕。研究表明我國每年新增宮頸癌的病例約10萬例，局部地區(qū)的發(fā)病率和死亡率都有增長趨勢，而且還呈現(xiàn)年輕化的趨勢〔9〕。

目前與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)的因素包括細菌和病毒等微生物的感染、宮頸的損傷及早婚早育早產(chǎn)。已有研究證實，p53和k-ras基因的突變〔10,11〕，c-myc、HER-2 和EGFR基因的過表達以及PTEN基因低表達均與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔12～14〕。總之，多種致病因素相互疊加綜合作用與正常的宮頸細胞，最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

目前認為非編碼蛋白的RNA分子包括微小RNA、長鏈非編碼RNA和超保守RNA等，它們可以轉(zhuǎn)錄成RNA，但不能翻譯成蛋白質(zhì)；主要功能是調(diào)控相關(guān)的RNA分子從而進一步調(diào)節(jié)編碼基因或非編碼基因的表達。當前的研究熱點集中于微小RNA和長鏈非編碼RNA。比如在microRNA與宮頸癌的關(guān)系中，microRNA124、microRNA218和microRNA101在宮頸癌組織和細胞中低表達，其調(diào)控的信號通路抑制了腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲轉(zhuǎn)移和增強對化療的敏感性等過程中發(fā)揮重要作用〔15～17〕，而microRNA155和microRNA10a卻在宮頸癌組織中高表達進而促進了腫瘤細胞的增殖、分化和浸潤轉(zhuǎn)移〔18,19〕；另外在長鏈非編碼RNA與宮頸癌的關(guān)系研究中，長鏈非編碼RNA-HOTAIR在宮頸癌組織中顯著高表達，因此HOTAIR被認為是一種癌基因，其與宮頸癌的惡性進展與預(yù)后不佳密切相關(guān)〔20,21〕；而作為抑癌基因的長鏈非編碼RNA：GAS5和LET則在宮頸癌中低表達，它們的作用是抑制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展〔22,23〕。

UCR是第3類非編碼RNA分子，是由超過200個的堿基序列組成，目前發(fā)現(xiàn)了481種UCR的正鏈DNA及同樣數(shù)量的反鏈DNA的UCR，它們存在于小鼠、大鼠和人等生物中〔2,3〕，其基因序列絕對保守而一模一樣。他們可以轉(zhuǎn)錄成RNA分子，調(diào)控其他的RNA分子影響DNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯等，從而進一步影響腫瘤細胞的分化發(fā)育、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后，并且參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，因此UCR與癌癥發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系越來越成為腫瘤研究新的熱點。目前UCR科學家們已經(jīng)在肝癌，大腸癌 白血病和膠質(zhì)瘤進行了大量的科學研究〔4～6〕。

本研究提示uc.189可能作為一個促癌基因，參與了宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程，為宮頸癌的臨床診斷治療提供了一個潛在的生物學靶點。

1Holtz DO,Dunton C.Traditional management of invasive cervical cancer〔J〕.Obstet Gynecol Clin North Am,2002;29(4):645-57.

2Bejerano G,Lowe CB,Ahituv N,etal.A distal enhancer and an ultraconserved exon are derived from a novel retroposon〔J〕.Nature,2006;441(7089):87-90.

3Katzman S,Kern AD,Bejerano G,etal.Human genome ultraconserved elements are ultraselected〔J〕.Science,2007;317(5840):915.

4Calin GA,Liu CG,Ferracin M,etal.Ultraconserved regions encoding ncRNAs are altered in human leukemias and carcinomas〔J〕.Cancer Cell,2007;12(3):215-29.

5Mestdagh P,Fredlund E,Pattyn F,etal.An integrative genomics screen uncovers ncRNA T-UCR functions in neuroblastoma tumours〔J〕.Oncogene,2010;29(24):3583-92.

6Braconi C,Valeri N,Kogure T,etal.Expression and functional role of a transcribed noncoding RNA with an ultraconserved element in hepatocellular carcinoma〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2011;108(2):786-91.

7Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2011;61:69-90.

8Kent A.HPV vaccination and testing〔J〕.Rev Obstet Gynecol,2010;3(1):33-4.

9張一嬌，丁曉萍.宮頸癌組織中Has-miRNA-199a-5p 的表達變化〔J〕.山東醫(yī)藥，2012;52(6):40-2.

10Ito S,Tase T,Satoh K,etal.Gastric-type endocervical glandular neoplasms associated with aberrant p16 expression and K-RAS gene mutation in Peutz-Jeghers syndrome〔J〕.Pathol Int,2014;64(6):283-8.

11Myllynen L,Rieckmann T,Dahm-Daphi J,etal.In tumor cells regulation of DNA double strand break repair through EGF receptor involves both NHEJ and HR and is independent of p53 and K-Ras status〔J〕.Radiother Oncol,2011;101(1):147-51.

12Gasparian NA,Pozharisskii KM,Zharinov GM,etal.Immunohistochemical study of the predictive value of oncoproteins p53,HER-2 and c-myc during radiotherapy for squamous cell carcinoma of the cervix〔J〕.Vopr Onkol,2007;53(4):439-44.

13Bumrungthai S,Munjal K,Nandekar S,etal.Epidermal growth factor receptor pathway mutation and expression profiles in cervical squamous cell carcinoma:therapeutic implications〔J〕.J Transl Med,2015;25(13):244.

14Lee PMS,Jeong MH,Lee HW,etal.I3K/AKT activation induces PTEN ubiquitination and destabilization accelerating tumourigenesis〔J〕.Nat Commun,2015;17(6):7769.

15Wan HY,Li QQ,Zhang Y,etal.MiR-124 represses vasculogenic mimicry and cell motility by targeting amotL1 in cervical cancer cells〔J〕.Cancer Lett,2014;355(1):148-58.

16Dong R,Qiu H,Du G,etal.Restoration of microRNA 218 increases cellular chemosensitivity to cervical cancer by inhibiting cell cycle progression〔J〕.Mol Med Rep,2014;10(6):3289-95.

17Liang X,Liu Y,Zeng L,etal.miR-101 inhibits the G1-to-S phase transition of cervical cancer cells by targeting Fos〔J〕.Int J Gynecol Cancer,2014;24(7):1165-72.

18Liu P,Wu Q,Zhang W,etal.Mir-155 promotes cervical cancer cell proliferation through suppression of its target gene LKB1〔J〕.Tumour Biol,2014;35(12):11933-8.

19Zeng T,Li G.MicroRNA 10a enhances the metastatic potential of cervical cancer cells by targeting phosphatase and tensin homologue〔J〕.Mol Med Rep,2014;10(3):1377-82.

20Li J,Wang Y,Yu J,etal.A high level of circulating HOTAIR is associated with progression and poor prognosis of cervical cancer〔J〕.Tumour Biol,2015;36(3):1661-5.

21Kim HJ,Lee DW,Yim GW,etal.Long non-coding RNA HOTAIR is associated with human cervical cancer progression〔J〕.Int J Oncol,2015;46(2):521-30.

22Cao S,Liu W,Li F,etal.Decreased expression of lncRNA GAS5 predicts a poor prognosis in cervical cancer〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2014;7(10):6776-83.

23Jiang S,Wang HL,Yang J.Expression of long non-coding RNA LET inhibits carcinogenesis of cervical cancer〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2015;8(1):806-11.

〔2016-08-26修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R737.33

A

1005-9202(2017)21-5342-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.056

江蘇省高?！扒嗨{工程”資助項目(2012～2015)；揚州市重點研發(fā)計劃-社會發(fā)展(YZ2016065)

1 揚州大學附屬醫(yī)院

王成海(1967-)，男，博士，副教授，主要從事腫瘤與中藥干預(yù)治療研究。

李 芹(1973-)，女，碩士，副教授，主要從事婦產(chǎn)科基礎(chǔ)研究。