葉富躍 楊 堃 王子珍 馬春陽(yáng) 陳政剛 吳 然 周 健 王 艷

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 海口 571199)

核因子-κB激活調(diào)控蛋白PRDX4在腦膜瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義

葉富躍 楊 堃 王子珍 馬春陽(yáng) 陳政剛 吳 然 周 健 王 艷

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 ?？?571199)

目的探討腦膜瘤組織中PRDX4的表達(dá)差異及其與臨床病理的相關(guān)性。方法采用Western印跡和免疫組化(SP法)分析68例腦膜瘤組織、59例配對(duì)的瘤旁腦膜組織及45例正常腦膜組織中PRDX4的表達(dá)情況，并分析腦膜瘤組織中PRDX4與核因子(NF)-κB活化產(chǎn)物p65的相關(guān)性，進(jìn)一步應(yīng)用分層分析、生存分析和Cox多元回歸分析腦膜瘤患者PRDX4的表達(dá)與臨床病理及其預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果腦膜瘤組織PRDX4蛋白條帶灰度值較瘤旁和正常腦膜組織顯著增高(Plt;0.001)，且瘤旁腦膜組織PRDX4蛋白表達(dá)較正常腦膜組織高(Plt;0.05)；腦膜瘤PRDX4與NF-κB p65蛋白表達(dá)具有顯著正相關(guān)性(Plt;0.05)；且腦膜瘤患者中PRDX4陽(yáng)性表達(dá)與臨床分期有顯著相關(guān)性(Plt;0.01)；進(jìn)一步生存分析發(fā)現(xiàn)PRDX4表達(dá)陽(yáng)性者5年無(wú)瘤生存期和生存率顯著低于陰性者(Plt;0.05)，且Cox分析示PRDX4可能是腦膜瘤患者5年無(wú)瘤生存預(yù)后的獨(dú)立影響因素(Plt;0.05；RR=1.484；95%CI：1.077～2.260)。結(jié)論NF-κB激活調(diào)控蛋白PRDX4可能為早期診斷腦膜瘤的生物學(xué)標(biāo)志，且與腦腫瘤臨床分期密切相關(guān)，可能具有獨(dú)立預(yù)測(cè)腦膜瘤患者5年無(wú)瘤生存預(yù)后的重要臨床價(jià)值。

PRDX4；腦膜瘤；早期診斷；預(yù)后

核因子(NF)-κB作為調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一，可能在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展或進(jìn)展過(guò)程中起重要生物學(xué)作用〔1〕。腦膜瘤是顱內(nèi)最為常見(jiàn)的良性腫瘤，但如果未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)或未得到有效控制，同樣會(huì)有預(yù)后惡化風(fēng)險(xiǎn)〔2〕。隨著腦膜瘤分子生物學(xué)研究的不斷進(jìn)展，其發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制也不斷被人們所揭示，但尚待進(jìn)一步探索具有重要臨床意義的分子水平研究〔3〕。PRDX-4蛋白由PRDX4基因編碼，為一種抗氧化物酶，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，有效還原過(guò)氧化氫或烷基氫過(guò)氧化物使其變成水和乙醇。目前已有研究表明PRDX4可調(diào)控NF-κB的激活進(jìn)而可能參與生物學(xué)過(guò)程〔4〕。本研究通過(guò)對(duì)腦膜瘤相關(guān)臨床組織標(biāo)本進(jìn)行PRDX4和NF-κB p65的綜合性分析，進(jìn)而揭示可能的其在患者臨床病理及其預(yù)后方面的重要臨床意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2008年11月至2013年4月接受顱內(nèi)腫瘤摘除術(shù)的68例患者，均經(jīng)外檢病理學(xué)及臨床相關(guān)資料確診為腦膜瘤，給予個(gè)體化手術(shù)和(或)輔助治療；同時(shí)成功收集配對(duì)的腦膜瘤瘤旁組織59例，同期顱腦外傷患者的正常腦膜組織45例為正常組(男20例，女25例)，每例的組織樣本均為兩份(用于Western印跡和免疫組化分析)。腦膜瘤患者的KPS評(píng)分均60～80分。正常組≥60歲21例，lt;60歲24例；且3組平均年齡分別為(59.1±10.9)歲、(57.2±11.5)歲和(54.9±14.8)歲，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)?；颊呔橥獠⒔?jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床病理等基線資料見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床病理參數(shù)(n)

1.2Western印跡檢測(cè) 將術(shù)中獲得的腦膜瘤、瘤旁或腦膜組織在液氮中充分研磨，SDS蛋白裂解液處理后得到的上清液移入EP管中。制作蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線并分析得到不同樣本的蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白分子量按需配制PAGE膠，將玻璃板固定于垂直電泳槽中，將蛋白樣品濃度調(diào)至一致后等量加入點(diǎn)樣孔，待溴酚藍(lán)指示線跑至膠底部時(shí)終止電泳；甲醇浸泡預(yù)處理PVDF膜1～2 min，從底層依次黑色板-海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-白色板組裝三明治結(jié)構(gòu)并放入轉(zhuǎn)膜儀中，電壓100 V和100 min后終止轉(zhuǎn)膜；將膜放于TBST液中清洗2～3次，TBST配制的5%脫脂牛奶封閉處理膜(搖床1 h)，后加入一抗孵育(β-actin 1∶1 000購(gòu)于聯(lián)科生物有限公司；PRDX4 1∶1 000和NF-κB p65 1∶1 000均購(gòu)于CST公司)，搖床4℃過(guò)夜，TBST液搖床漂洗3次，每次10 min，再加入適量5%脫脂牛奶和二抗混勻孵育，室溫1 h，TBST液搖床漂洗3～5次，每次10 min，最后取顯影液A和B按1∶1比例適量混勻加于膜上，并立即采用凝膠圖像分析儀進(jìn)行曝光和圖像保存。采用image pro-plus軟件對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.3免疫組化(SP法)檢測(cè) 免疫組化PRDX4單克隆抗體購(gòu)于Abcam公司；SP法免疫組化試劑盒購(gòu)于中杉金橋公司。將三組不同臨床樣本經(jīng)甲醛固定、脫水、包埋和切片后，再經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇透明，三蒸水和磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3～5次后滴加甲醇H2O2室溫10 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶，高壓抗原修復(fù)(0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液)處理20 min后自然冷卻，PBS漂洗3次后滴加免疫組化封閉液室溫孵育20 min，甩去并滴加一抗(PRDX4 1∶500)放于4℃過(guò)夜，PBS漂洗3次后滴加二抗37℃孵育60 min，漂洗3次后滴加SP復(fù)合物37℃孵育30 min，PBS漂洗3次后DAB顯色，自來(lái)水終止染色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明和封片。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照則用陽(yáng)性組織片。

1.4免疫組化結(jié)果評(píng)定 PRDX4蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)中，按細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)定得分：無(wú)著色0分；淺黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。按陽(yáng)性染色百分比：陰性0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%1分；gt;10%且lt;51%2分；≥51%且≤75%3分；gt;75%4分。最后按染色強(qiáng)度得分和陽(yáng)性染色百分比得分的乘積結(jié)果分4個(gè)等級(jí)：“-”，0～2分；“+”，3～5分；“”，6～8分；“”，9～12分；其中≥3分均為陽(yáng)性。

1.5隨訪 腦膜瘤患者先后進(jìn)行了為期5年的臨床預(yù)后監(jiān)測(cè)，主要觀察內(nèi)容是術(shù)后和(或)輔助治療后5年無(wú)瘤不良事件發(fā)生情況(包括復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡)，并記為生存終點(diǎn)事件，以分析患者5年無(wú)瘤生存，主要采用門(mén)診隨訪方式進(jìn)行，隨訪過(guò)程中無(wú)失訪者出現(xiàn)，隨訪率達(dá)100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，臨床參數(shù)資料與無(wú)瘤生存的歸因分析采用Cox生存風(fēng)險(xiǎn)模型方法；Kaplan-Meier壽命表法分析無(wú)瘤生存并繪制生存曲線，組間比較用Log-rank檢驗(yàn)；采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1腦膜瘤組織PRDX4表達(dá)差異 腦膜瘤組織中PRDX4蛋白表達(dá)條帶灰度為(165.14±40.77)，蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為75.0%(51/68)，較瘤旁腦膜和正常腦膜組織〔(96.23±26.45)、(46.11±20.89)和44.1%(26/59)、22.2%(10/45)〕均顯著增高(均Plt;0.001)，瘤旁腦膜組織中PRDX4表達(dá)和陽(yáng)性率也顯著高于正常腦膜組織(P=0.000，0.020)。

2.2腦膜瘤PRDX4與NF-κB p65的蛋白表達(dá) NF-κB p65蛋白表達(dá)：腦膜瘤組(244.39±69.40)gt;瘤旁組(171.51±45.11)gt;正常組(90.87±39.22)；PRDX4蛋白表達(dá)：腦膜瘤組(165.14±40.77)gt;瘤旁組(96.23±26.45)gt;正常組(46.11±20.89)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.001)；且PRDX4和NF-κB p65的蛋白表達(dá)呈顯著性正相關(guān)(腦膜瘤組、瘤旁組及正常組分別為r=0.623，0.522，0.513，均Plt;0.05)。

2.3腦膜瘤PRDX4與臨床病理參數(shù)的分層比較 僅腦膜瘤臨床分期與PRDX4表達(dá)密切相關(guān)(P=0.002)，見(jiàn)表2。

2.4腦膜瘤PRDX4與臨床預(yù)后 (1)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)PRDX4陽(yáng)性表達(dá)者的5年無(wú)瘤生存期和生存率分別為(48.1±2.3)個(gè)月和60.8%，明顯低于PRDX4陰性者的(58.3±1.4)個(gè)月和88.2%，經(jīng)Logrank檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036，lt;0.05)，見(jiàn)圖1。(2)COX分析發(fā)現(xiàn)PRDX4蛋白表達(dá)水平與腦膜瘤患者5年無(wú)瘤生存密切相關(guān)(P=0.049；RR=1.484；95%CI：1.002～2.197)，見(jiàn)表3。

表2 腦膜瘤患者PRDX4蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析(n)

圖1 PRDX4陽(yáng)性者和陰性者的5年無(wú)瘤生存曲線比較

因素回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差Waldχ2值P值RR(95%CI)年齡-0.449-1.1570.1510.6980.638(6.156～0.066)性別-0.023-0.0360.4190.5170.977(1.048～0.911)病理類(lèi)型-0.879-1.2180.5210.4700.415(4.521～0.038)WHO分級(jí)0.2270.1951.3550.2441.255(0.856～1.840)腫瘤繼發(fā)變化-0.691-0.8530.6570.4180.501(2.665～0.094)腦腫瘤分期0.1790.1152.4320.1191.196(0.955～1.498)PRDX40.3950.2003.8890.0491.484(1.002～2.197)

3 討 論

NF-κB又稱(chēng)為κ基因結(jié)合核因子(NF)-κB，機(jī)體多種激酶、細(xì)胞因子和早期反應(yīng)蛋白基因啟動(dòng)子均包含其結(jié)合部位，進(jìn)而可能促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，參與機(jī)體炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡等多種調(diào)控過(guò)程〔5〕。NF-κB/Rel家族由ReLA(P65)、RelB、C-Rel、V-Rel、NF-κB1(P50/P105)、NF-κB2(P52/P100)等組成，不同結(jié)合形成不同轉(zhuǎn)錄因子。目前已經(jīng)證實(shí)NF-κB在乳腺癌、大腸癌中表達(dá)明顯增高，且與肝癌、白血病和淋巴瘤等的發(fā)生相關(guān)。有報(bào)道顯示NF-κB在腦膜瘤組織中存在過(guò)度表達(dá)〔6，7〕，且可能通過(guò)其抗細(xì)胞凋亡和直接促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用形成腫瘤生長(zhǎng)〔8〕，尤為重要的是某些致癌基因也可通過(guò)NF-κB的分子信號(hào)通路介導(dǎo)腦膜瘤的發(fā)生發(fā)展〔9〕。

近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)某些特異性蛋白質(zhì)組或蛋白表達(dá)方式可用于區(qū)分腦部腫瘤的不同亞型或等級(jí)〔10〕。腦膜瘤是顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率最高的腫瘤之一，因其有惡性轉(zhuǎn)化可能常影響患者生存預(yù)后，是目前腦部腫瘤的研究熱點(diǎn)之一。崔廣強(qiáng)等〔11〕通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)了包括PRDX4蛋白在內(nèi)的4種蛋白在腦膜瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào)，但尚缺乏進(jìn)一步臨床相關(guān)性分析探討其生物學(xué)作用和臨床指導(dǎo)意義。目前有研究提示，PRDX4可能調(diào)控了NF-κB的激活進(jìn)而可能參與腦膜瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔4〕。本研究結(jié)果表明PRDX4可能作為致癌基因參與了腦膜瘤的發(fā)生，PRDX4基因可能作為一種生物學(xué)標(biāo)志物具有早期診斷腦膜瘤的臨床預(yù)測(cè)意義。而且PRDX4可能參與了NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而參與了腦膜瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，但由于本研究未能分析NF-κB家族其他蛋白的表達(dá)及與NF-κB信號(hào)通路激活相關(guān)關(guān)系，因此尚待進(jìn)一步深入研究二者間的直接互作或間接作用關(guān)系。另外本研究結(jié)果提示，PRDX4可能成為腦膜瘤的獨(dú)立預(yù)后影響因素，具有重要的臨床預(yù)測(cè)意義，但尚待多中心、大樣本臨床研究證實(shí)。

1Vlahopoulos SA，Cen O，Hengen N，etal.Dynamic aberrant NF-κB spurs tumorigenesis：A new model encompassing the microenvironment〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev，2015；26(4)：389-403.

2Whittle IR，Smith C，Navoo P，etal.Meningiomas〔J〕.Lancet，2004；363(9420)：1535-43.

3Wrobel G，Roerig P，Kokocinski F，etal.Microarray-based gene expression profiling of benign，atypical and anaplastic meningiomas identifies novel genes associated with meningioma progression〔J〕.Int J Cancer，2005；114(2)：249-56.

4Zhang Y，Emmanuel N，Kamboj G，etal.PRDX4，a member of the peroxiredoxin family，is fused to AML1 (RUNX1) in an acute myeloid leukemia patient with a t(X；21)(p22；q22)〔J〕.Genes Chromosomes Cancer，2004；40(4)：365-70.

5Karin M.Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression〔J〕.Nature，2006；441(7092)：431-6.

6夏祥國(guó)，劉增進(jìn)，王 丹，等.核因子-κB與腦膜瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系〔J〕.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008；35(16)：3208-13.

7夏祥國(guó)，支興剛，陳禮剛，等.核因子-κB在腦膜瘤組織中的表達(dá)及意義〔J〕.中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)，2005；13(2)：156-60.

8潘 雷，王英華，曾錦旗，等.核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2002；14(4)：205-7.

9Ammoun S，Provenzano L，Zhou L，etal.Axl/Gas6/NFκB signalling in schwannoma pathological proliferation，adhesion and survival 〔J〕.Oncogene，2014；33(3)：336-46.

10Vankalakunti M，Vasishta RK，Das Radotra B，etal.MIB-1 immunolabeling：a valuable marker in prediction of benign recurring meningiomas〔J〕.Neuropathology，2007；27(5)：407-12.

11崔廣強(qiáng)，矯愛(ài)紅，劉愛(ài)娜，等.HSD17B10、ALDH9A1、ALDH2、PRDX4在腦膜瘤蛋白質(zhì)組學(xué)中的上調(diào)表達(dá)〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2015；35(2)：441-3.

〔2017-03-11修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)

R73

A

1005-9202(2017)21-5331-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.051

海南省社會(huì)發(fā)展科技專(zhuān)項(xiàng)基金(SF201407)

葉富躍(1983-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)腫瘤及顱腦損傷研究。