陳傳綺 羅千軍 鄢燕瓊 鐘曉紅

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518067)

甘精胰島素對(duì)初診2型糖尿病Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路的影響

陳傳綺 羅千軍 鄢燕瓊 鐘曉紅

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518067)

目的探討甘精胰島素對(duì)初診2型糖尿病(T2DM)患者核因子E2相關(guān)因子2-kelch樣ECH連接蛋白1-抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2-Keap1-ARE)信號(hào)通路的影響。方法將50例糖尿病患者作為實(shí)驗(yàn)組，并且每晚睡前皮下注射甘精胰島素；同時(shí)選取年齡、性別相匹配的健康者50人為對(duì)照組。收集所有人血液，檢測(cè)血液生化指標(biāo)：空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)甘精胰島素治療前后及對(duì)照組Nrf2、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、血紅素單加氧酶(HO)-1和醌氧化還原酶〔NAD(P)H：NQO1〕含量。結(jié)果與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組治療前FPG、TC、TG、LDL-C和HbA1c顯著升高(Plt;0.05)，實(shí)驗(yàn)組治療后較本組治療前FPG、TC、TG、LDL-C和HbA1c顯著下降(Plt;0.05)；實(shí)驗(yàn)組治療前SOD與GST水平明顯低于對(duì)照組(Plt;0.05)，Nrf2、HO-1和NQO1顯著高于對(duì)照組(Plt;0.05)；實(shí)驗(yàn)組治療后較本組治療前SOD與GST水平增加，Nrf2、HO-1與NQO1水平顯著減少(Plt;0.05)。結(jié)論糖尿病時(shí)Nrf2表達(dá)升高，其靶基因下游蛋白HO-1和NQO1也隨之上升。甘精胰島素通過抑制 Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路改善胰島素抵抗，其機(jī)制可能與改善氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)，該信號(hào)通路可能成為治療T2DM的潛在靶點(diǎn)。

甘精胰島素；2型糖尿??；Nrf2/Keap

目前糖尿病(DM)有年輕化的趨勢(shì)〔1〕，且往往導(dǎo)致心血管并發(fā)癥〔2〕。研究表明DM與氧化應(yīng)激有著密切的聯(lián)系〔3〕。核因子E2相關(guān)因子2-kelch樣ECH連接蛋白(Keap)1-抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2-Keap1-ARE)信號(hào)通路是近年來抗氧化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)〔4〕。大部分DM患者是以胰島素抵抗(IR)和胰島β細(xì)胞衰竭為主的2型糖尿病(T2DM)〔5〕，對(duì)口服降血糖藥物控制不好的T2DM患者首選胰島素治療。本文旨在探討甘精胰島素對(duì)T2DM患者Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料 實(shí)驗(yàn)組：收集2014年6月至 2016年6月在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院深圳醫(yī)院糖尿病中心門診和住院部初診的T2DM患者50例，其中男29例，女21例；年齡58～72〔平均(65.4±5.9)〕歲；病程2～11年，平均(6.6±2.4)年；所有患者符合世界衛(wèi)生組織(WHO)DM診斷標(biāo)準(zhǔn)(1999年)，入院前未口服降血糖藥與胰島素治療，并且未出現(xiàn)嚴(yán)重DM并發(fā)癥與嚴(yán)重腦、心、肝、腎疾病。對(duì)照組：在本院體檢中心另選年齡相匹配的健康者50人，其中男26人，女 24人，年齡54～67〔平均(64.2±4.1)歲〕。兩組一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)，具有可比性。

1.2檢測(cè)指標(biāo)及方法 (1)臨床生化指標(biāo)檢查：治療前后收集兩組血液10 ml，測(cè)定空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和糖化血紅蛋白(HbA1c)。其中，DM患者每晚注射一次甘精胰島素控制血糖，劑量根據(jù)體重計(jì)算并根據(jù)血糖情況調(diào)整。(2)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)：以雙抗夾心ELISA檢測(cè)兩組血清中Nrf2及抗氧化酶水平：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、血紅素單加氧酶(HO)-1，醌氧化還原酶(NAD(P)H:NQO1)。

1.3血清樣品準(zhǔn)備 抽取患者靜脈血標(biāo)本5 ml，12 000 r/min離心25 min，吸取上清后，分裝，保存于-70℃；將倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品各100 μl依次加入1排7孔中，另一孔只加樣品稀釋液作為對(duì)照；待測(cè)樣品均用樣品稀釋液作2倍稀釋，100 μl/孔依次加入酶標(biāo)包被板中，37℃孵育90 min；反應(yīng)后洗板3次，加入生物素抗體工作液(100 μl/孔)，37℃孵育60 min；洗板3次，加入酶結(jié)合物親和素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)工作液(100 μl/孔，除空白孔外)，37℃孵育30 min；洗板5次，加入TMB顯色工作液(100 μl/孔，包括空白孔)，37℃避光孵育；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品前3～4個(gè)孔有明顯的梯度藍(lán)色時(shí)加入TMB終止液100 μl/孔；用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度(A)值(10 min內(nèi))。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品孔對(duì)應(yīng)的A值和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的A值在坐標(biāo)上找出相對(duì)應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)(2倍)即為待測(cè)樣品的終濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組治療前后生化指標(biāo)比較 治療前實(shí)驗(yàn)組TG、TC、LDL-C與HbA1c、FPG水平明顯高于對(duì)照組(Plt;0.05，Plt;0.01)；HDL-C水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。實(shí)驗(yàn)組治療后與治療前相比，F(xiàn)PG、TG、TC、LDL-C以及HbA1c水平顯著下降(Plt;0.05)，HDL-C水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。見表1。

2.2兩組ELISA檢測(cè)結(jié)果比較 治療前實(shí)驗(yàn)組SOD與GST水平明顯低于對(duì)照組，Nrf2、HO-1和NQO1水平顯著高于對(duì)照組(均Plt;0.05)；實(shí)驗(yàn)組SOD、GST，Nrf2、HO-1和NQO1在治療后明顯改善，但仍與對(duì)照組有顯著差異(Plt;0.05)。實(shí)驗(yàn)組治療后與治療前相比，SOD與GST水平顯著增加，Nrf2、HO-1與NQO1水平顯著減少(Plt;0.05)。見表2。

表1 兩組血清生化指標(biāo)比較

1)實(shí)驗(yàn)組治療前與治療后比較；2)實(shí)驗(yàn)組治療前與對(duì)照組比較；3)實(shí)驗(yàn)組治療后與對(duì)照組比較；下表同

表2 兩組Nrf2、GST、SOD、HO-1和NQO1水平比較

3 討 論

Nrf2是亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，并且調(diào)節(jié)內(nèi)源性以及外源性親電性和氧化應(yīng)激〔6〕。在非應(yīng)激條件下，Nrf2與Keap1在漿膜結(jié)合。在漿膜中，Keap1促進(jìn)Ntf2蛋白酶體降解通過Cul/Rbx E3配基系統(tǒng)〔7〕。一旦接觸應(yīng)激或者化學(xué)誘導(dǎo)劑(三萜類、異硫氰酸酯等)，Keap1的半胱氨酸被修飾導(dǎo)致Keap1/Nrf2復(fù)合物降解，避免Nrf2蛋白酶體降解，致Nrf2聚集進(jìn)而轉(zhuǎn)入核內(nèi)，在核內(nèi)結(jié)合ARE的調(diào)節(jié)靶基因的區(qū)域，從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。經(jīng)典的Nrf2靶基因包括GST調(diào)控位點(diǎn)，NQO1在抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用〔8〕。HO-1屬于熱休克蛋白家族，同時(shí)也是Nrf2調(diào)節(jié)的下游，是血紅素代謝的限速酶，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下增高，具有抗氧化的作用〔9〕。甘精胰島素是一種長效胰島素，使用DNA重組技術(shù)制備的胰島素類似物〔10〕。經(jīng)皮下注射可以緩慢吸收，有效作用可以達(dá)到24 h，能夠很好地模擬內(nèi)源性胰島素分泌，有效控制血糖還能夠減少夜間低血糖發(fā)生〔11〕。老人應(yīng)用會(huì)更加安全。甘精胰島素除具有降糖作用外,還有顯著的抗感染效果,能改善IR、保護(hù)胰島β細(xì)胞以及顯著的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用,并減少氧自由基對(duì)靶器官的損害〔12〕。甘精胰島素可以通過調(diào)整抗氧化酶的濃度抑制氧化應(yīng)激,也可能通過抑制NADPH氧化酶的表達(dá)直接抑制脂質(zhì)過氧化。

研究發(fā)現(xiàn)，使用胰島素對(duì)T2DM患者進(jìn)行降糖治療,隨著時(shí)間推移可以降低氧化應(yīng)激。本研究結(jié)果表明甘精胰島素可以升高氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)源性SOD和GST抗氧化酶的降低，從而減少全身炎癥反應(yīng)。表明DM時(shí)發(fā)生氧化應(yīng)激，刺激Nrf2與它的分子伴侶蛋白Keap1解離，進(jìn)入核內(nèi)結(jié)合ARE，從而刺激HO-1和NQO1表達(dá)。當(dāng)使用甘精胰島素治療，氧化應(yīng)激減少，與治療前Nrf2、NQO1和HO-1相比，治療后表達(dá)顯著降低。

Nrf2在活性氧環(huán)境中保護(hù)胰島β細(xì)胞〔13〕。本研究發(fā)現(xiàn)，DM時(shí)Nrf2表達(dá)升高，其靶基因下游的蛋白HO-1和NQO1也隨之上升，可能與提高抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)，Nrf2活化劑和Keap1抑制劑可能成為治療T2DM新的策略?？傊示葝u素通過抑制 Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路改善IR，其機(jī)制可能與改善氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)，該信號(hào)通路可能成為治療T2DM的潛在靶點(diǎn)。

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〔2017-01-09修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R587.1

A

1005-9202(2017)21-5285-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.029

深圳市科技創(chuàng)新委基金課題 (No.JCYJ20160428101710597)

陳傳綺(1969-)，女，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事內(nèi)分泌及代謝疾病研究。