念 馨 劉 凱 張旭祥 李 紅 劉 華

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，云南 昆明 650032)

·心、腦血管及代謝性疾病·

金屬硫蛋白基因G-201A多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性

念 馨 劉 凱1張旭祥 李 紅 劉 華2

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，云南 昆明 650032)

目的探討金屬硫蛋白(MT)基因家族中的MT4基因G-201A位點單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與云南地區(qū)漢族人群中原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。方法選取原發(fā)性高血壓患者301例，正常對照組301例。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析技術(shù)檢測MT4基因G-201A位點的基因多態(tài)性。結(jié)果原發(fā)性高血壓組、正常對照組MT4 G-201A基因型GG、GA、AA的頻率分別為42.2%、48.5%、9.3%；42.5%、51.5%、6.0%；基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(Pgt;0.05)。MT4 G-201A多態(tài)性：原發(fā)性高血壓組和正常對照組比較分布無顯著差異(Pgt;0.05)；等位基因頻率分布無顯著差異(Pgt;0.05)。兩組男性基因型及等位基因頻率分布均有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)；回歸分析示年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、尿酸(UA)與原發(fā)性高血壓的發(fā)生相關(guān)(Plt;0.05)，等位基因A攜帶者(GA+AA型)與原發(fā)性高血壓的發(fā)生無相關(guān)性(Pgt;0.05)。原發(fā)性高血壓組與正常對照組比較，年齡、BMI、甘油三酯(TG)、HDL-C、LDL-C、UA有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。原發(fā)性高血壓組中GG組與AA組比較，性別、TC有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。結(jié)論MT基因G-210A多態(tài)性與原發(fā)性高血壓無相關(guān)性；等位基因A攜帶者與原發(fā)性高血壓的發(fā)生無相關(guān)性；MT基因G-201A多態(tài)性與脂代謝相關(guān)，GG組有較高的TC。

金屬硫蛋白基因;多態(tài)性;原發(fā)性高血壓

原發(fā)性高血壓(EH)都是由遺傳因素和環(huán)境因素共同所致，如遺傳因素、氧化應(yīng)激、肥胖、胰島素抵抗。EH易感基因關(guān)聯(lián)是近20年來人類高血壓研究的主要方向之一〔1,2〕，雖然EH易感基因效應(yīng)一般都很小，但其研究結(jié)果對闡釋EH病因和提高防治手段均有非常重要意義。目前發(fā)現(xiàn)了血管緊張素原、醛固酮合成酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶等〔3～5〕易感基因通過腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)、內(nèi)皮系統(tǒng)等影響EH的發(fā)生發(fā)展。金屬硫蛋白(MT)具有多樣生理功能，包括體內(nèi)必需金屬元素的儲存、代謝和轉(zhuǎn)運及重金屬的解毒、自由基的清除并參與機體的應(yīng)激反應(yīng)、胚胎發(fā)育和細胞代謝調(diào)控、內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、腫瘤的形成等。Beattie等〔6,7〕研究表明MT與能量代謝有關(guān)。國外研究〔8,9〕顯示，對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)模型進行游泳訓(xùn)練8 w后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)過游泳訓(xùn)練的SHR主動脈MT含量升高，且心臟收縮壓下降，提示內(nèi)源性MT具有降低血壓的作用。本文采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析技術(shù)，分析MT基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與EH的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1一般資料 2012年10月至2013年12月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心的體檢人群，正常對照組301例，平均年齡(48.94±16.37)歲，無糖尿病、高血壓家族史，無糖、脂代謝異常。EH組301例，平均年齡(62.87±12.61)歲，無糖尿病，選自心臟內(nèi)科住院患者，均為云南地區(qū)長期居住(gt;10年)的漢族人群，無血緣關(guān)系。

1.2標本采集及DNA提取 研究對象禁食8～10 h后清晨空腹采集靜脈血液樣本用于測定空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、尿酸(UA)等生化指標；EDTA抗凝管采集4 ml靜脈血保存于-20℃冰箱用于基因組DNA提取。采用小量全血基因組DNA快速提取制劑盒(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)提取，收集到的DNA放置在-20℃。使用紫外光分光光度計，自動計算出所提取的DNA的純度。

1.3臨床資料采集 收集研究對象的姓名、性別、年齡及病史，并測量以下項目：身高、體重、腰圍、臀圍、血壓，計算體重指數(shù)(BMI)。

1.4目的基因的擴增

1.4.1MT4引物設(shè)計 上游引物：5′-ACTCCATCTCCATCCTCACG-3′；下游引物：5′-TTACAGACGTGAGCCACTGC-3′(上海捷瑞生物工程有限公司)。擴增片段長度：198 bp。

1.4.2PCR反應(yīng)體系的組成 總體系25 μl，模板DNA4.5 μl，上游引物(20 mmol/L)1.0 μl，下游引物(20 mmol/L)1.0 μl，2倍Taq PCR Master Mix(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)12.5 μl，滅菌純水6.0 μl。將反應(yīng)體系點離心2 s后放在基因擴增儀中(美國Bio-Rad公司)。PCR反應(yīng)條件：①94℃、5 min；②96℃、45 s，60℃、55 s，72℃、40 s，共5個周期；③95℃、45 s，58℃、55 s，72℃、40 s，共10個周期；④94℃、45 s，56℃、55 s，72℃、40 s，共30個周期；⑤72℃、10 min。

1.4.3PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定 凝膠槽放入裝有緩沖液的電泳槽中，將PCR產(chǎn)物10 μl和6倍上樣緩沖液2 μl均勻混合，小心加入加樣孔中，以5 μl 50 bp Marker作為分子量標準，加樣端連接負極。在100 mV電壓下電泳30 min。電泳結(jié)束后用Tanon 3500紫外圖像分析系統(tǒng)觀察198 bp的產(chǎn)物片段。

1.4.4PCR 產(chǎn)物的酶切 限制性內(nèi)切酶Xcel(Nspl)(Thermo公司)的酶切位點為：5′…R C A T G↓Y…3′；3′…Y↑G T A C R…5′，MT4 201G-A由于 MT4基因201位點由A代替G，Xcel限制性內(nèi)切酶位點消失。PCR擴增目的基因為198 bp，經(jīng)Xcel限制性內(nèi)切酶消化后，獲得的酶切片段長度分別為107 bp和91 bp，可產(chǎn)生三種基因型，分別為純和切開型(GG),純和未切開型(AA)，雜合切開型(GA)。

1.4.5酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定及測序 凝膠槽放入

裝有緩沖液的電泳槽中，將酶切產(chǎn)物10 μl小心加入加樣孔中，以5 μl 50 bp Marker作為分子量標準，加樣端連接負極。在90 mV電壓下電泳50 min。電泳結(jié)束后用Tanon 3500紫外圖像分析系統(tǒng)(天能科技上海有限公司)觀察107 bp、91 bp的產(chǎn)物片段，由此判斷基因型。抽取樣本各2份進行測序分析，驗證其基因型。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行χ2及t檢驗，Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1MT 4基因分析 目的基因MT4的PCR擴增產(chǎn)物片段長度198 bp，擴增產(chǎn)物的量、純度及特異性均好，適合下一步進行PCR產(chǎn)物的酶切及瓊脂糖凝膠電泳測定，見圖1。

2.2MT4基因G-201A酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果 MT4基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Xcel限制性內(nèi)切酶酶切后，獲得的酶切片段長度分別為107 bp和91 bp，可產(chǎn)生三種基因型，分別為GG、AA及GA，見圖2，圖3。

M：Marker；1～6：MT4的PCR擴增產(chǎn)物圖1 MT4基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

M：Marker;1～3：GA；4、6：GG；5：AA圖2 MT4基因G-201A酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

GA基因型

GG基因型

AA基因型

2.3MT4基因G-201A基因型和等位基因分布頻率比較 MT4基因G-201A位點檢測到GG、GA和AA 3種基因型，基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg 平衡檢驗。EH組和正常對照組GG、GA和AA基因型及G和A等位基因頻率分布均無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)。同性別EH組和正常對照組間GG、GA和AA基因型及G和A等位基因頻率分布也均無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)。見表1。

2.4Logistic回歸分析 年齡、性別、BMI、HDL-C、LDL-C、TC、UA與EH的發(fā)生有明顯相關(guān)性(Plt;0.05)；年齡越大，女性，

表1 兩組G-201A基因型及等位基因頻率比較〔n(%),n=301〕

BMI、LDL-C、UA越高，HDL-C越低，患EH的危險性越大；等位基因A攜帶者(GA+AA型)、TG與EH的發(fā)生無相關(guān)性(Pgt;0.05)。見表2。

2.5各組臨床特點和生化指標比較 EH組HDL-C明顯低于正常對照組，BMI、TG、LDL-C、CA明顯高于正常對照組(Plt;0.05)，性別、FPG、TC兩組無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)。EH中GG組與(GA+AA)組、GA組相比，年齡、性別、BMI、FPG、TC 、TG、HDL-C、LDL-C、UA無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)；GG組與AA組比較，性別、TC有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。見表3。

表2 EH發(fā)生相關(guān)危險因素的Logistic回歸分析

表3 兩組臨床特點和生化指標比較

與正常對照組比較：1)Plt;0.001，2)P=0.038，3)Plt;0.001，4)P=0.001，5)Plt;0.001；與GG組比較：6)P=0.027,7)P=0.046

3 討 論

目前已知的與兒茶酚胺代謝有關(guān)的酶類及調(diào)節(jié)血壓的某些生物活性物質(zhì)均含有金屬元素，并與銅、鋅在體內(nèi)的平衡有關(guān)，推測MT可作為銅、鋅等金屬的供體，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)微量金屬平衡的作用，調(diào)節(jié)高血壓的發(fā)生發(fā)展。MT相對分子質(zhì)量為7 kU左右，為低分子量蛋白質(zhì)，是由60～63個氨基酸殘基組成一條多肽單鏈，不含芳香族氨基酸及組氨酸，富含半胱氨酸。根據(jù)其部分氨基酸及所帶電荷不同，MT分為4種亞型，即MT1、MT2、MT3和MT4。MT1和MT2在大多數(shù)哺乳動物的器官中廣泛存在，是MT在體內(nèi)的主要形式，發(fā)揮重要作用〔10〕。MT3特異性分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及雄性小鼠的生殖系統(tǒng)；MT4僅在復(fù)層鱗狀上皮中表達〔7〕，目前對MT4的研究資料較少。MT分子具有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分子中還原狀態(tài)的巰基具有親和性，其中的金屬具有動力學(xué)不穩(wěn)定性，這使得MT極易與某些親電性物質(zhì)作用，特別是能與自由基結(jié)合，對羥自由基、氧自由基及一氧化氮(NO)等自由基有較強的清除作用，其清除羥自由基能力是還原性谷胱甘肽(GSH)的300倍〔11〕。MT還可以顯著抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛的生成〔12〕。研究表明幾乎在所有過氧化狀態(tài)下，MT基因的表達均上調(diào)，這些都表明MT參與機體的抗氧化應(yīng)激和細胞保護〔13，14〕。

本研究發(fā)現(xiàn)MT基因G-201A多態(tài)性與EH無相關(guān)性；且等位基因A攜帶者與EH的發(fā)生無相關(guān)性，MT基因G-201A多態(tài)性與脂代謝相關(guān)。

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〔2016-05-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R544.1

A

1005-9202(2017)21-5275-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.025

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目(81660153)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究(昆醫(yī)聯(lián)合專項)〔2017FE468(-197)〕；云南省衛(wèi)生廳內(nèi)設(shè)機構(gòu)項目(No.2012WS0030)

1 鄭州市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科

2 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科

張旭祥(1972-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機制研究。

念 馨(1975-)，女，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事糖尿病發(fā)病機制及相關(guān)并發(fā)癥研究。