李 燕 薛建芳

(包頭市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

Th17細(xì)胞亞群在小鼠呼吸道合胞病毒感染后宿主免疫機(jī)制中的作用

李 燕 薛建芳1

(包頭市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

目的探討輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)17在呼吸道合胞病毒(RSV)感染小鼠肺部炎癥中的變化及其在RSV感染后宿主免疫機(jī)制中的作用。方法30只5周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組各15只。對照組小鼠鼻腔滴入0.1 ml DMEM維持液(含有2.5%滅活的雞血清)，實(shí)驗(yàn)組小鼠鼻腔滴入0.1 ml病毒液(TCID50為107.5/ml)。在處理后的第1、3、7天分別處死小鼠，取其外周血并留取小鼠脾臟和肺臟組織。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠外周血中白細(xì)胞介素(IL)-17A和IL-23p19的濃度。通過蘇木素-伊紅(HE)染色觀察RSV感染后肺組織病理變化。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞亞群的含量變化。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組小鼠在RSV病毒感染后1、3、7 d，血清IL-17A濃度較對照組明顯升高(Plt;0.05)。在RSV病毒感染的第3天和第7天，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中IL-23p19的濃度較對照組明顯升高(Plt;0.05)；在RSV病毒感染后第1、3、7天，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞Th17亞群比例顯著高于對照組(Plt;0.05)，且RSV病毒感染后第7天明顯高于第1、3天(Plt;0.05)；在RSV感染后第3天小鼠肺組織出現(xiàn)典型間質(zhì)性肺炎表現(xiàn)，第7天炎性細(xì)胞明顯減少。實(shí)驗(yàn)組第3、7天小鼠肺組織病理改變評分高于對照組(Plt;0.05)。結(jié)論在RSV感染小鼠導(dǎo)致的肺部炎癥反應(yīng)過程中，脾淋巴細(xì)胞Th17細(xì)胞亞群水平升高并且外周血血清中IL-17A的表達(dá)增加，推測Th17細(xì)胞可能參與宿主的抗病毒免疫過程。

呼吸道合胞病毒；輔助性T淋巴細(xì)胞；白細(xì)胞介素-17A

呼吸道感染是臨床常見疾病，呼吸道合胞病毒(RSV)是眾多病原體中導(dǎo)致呼吸道急性炎癥并具有較高致病率和致死率的病毒之一〔1〕。RSV是具有包膜、非節(jié)段性、單股負(fù)鏈的RNA病毒，屬于副黏病毒科、肺病毒屬，只有一個血清型，A和B兩個亞型〔2〕。引起全球嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原體是RSV，感染此種病毒后能夠引起嬰幼兒反復(fù)喘息、持續(xù)性的氣道功能紊亂、缺氧等癥狀，更能誘發(fā)嚴(yán)重的肺炎毛細(xì)支氣管炎〔3〕。輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)17作為CD4+Th細(xì)胞亞群，主要分泌白細(xì)胞介素(IL)-17A，此外還分泌IL-6、IL-23、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子都是強(qiáng)效的炎性細(xì)胞趨化因子，能募集炎性細(xì)胞到達(dá)炎癥部位〔4〕。本研究旨在探討RSV感染后Th17細(xì)胞在宿主免疫反應(yīng)過程中的變化情況及其作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 0.25%胰酶細(xì)胞消化液(北京達(dá)科為生物工程有限公司，中國)；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(BD公司，美國)；小鼠脾淋巴細(xì)胞分離試劑盒(天津?yàn)笥邢薰?，中?；胎牛血清、雞血清(杭州四季青生物科技有限公司，中國)；淋巴細(xì)胞刺激物PMA和lonomycin，臺盼蘭細(xì)胞染色液，淋巴細(xì)胞高爾基體阻斷劑Brefedin A(BFA)(Sigma公司，美國)；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)；PerCP/Cy5標(biāo)記抗小鼠CD3單克隆抗體及同型對照抗體、PE標(biāo)記抗小鼠IL-17A單克隆抗體及同型對照抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗小鼠CD4單克隆抗體以及同型對照抗體(BD公司，美國)；流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur，美國)。

1.2細(xì)胞和病毒 在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中利用包含10%胎牛血清和100 U/ml青鏈霉素的改良型RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞(包頭醫(yī)學(xué)院遺傳教研室提供)，然后進(jìn)行細(xì)胞傳代，待細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)滴入RSV A亞型Long株(包頭醫(yī)學(xué)院病原教研室饋贈)病毒原液，然后在DMEM維持液(含2.5%滅活雞血清)中培養(yǎng)，經(jīng)過3次細(xì)胞傳代，待Hep-2細(xì)胞病變達(dá) 80%時(shí)收獲病毒。具體步驟：首先收集Hep-2細(xì)胞，然后在37℃水浴和-80℃冰箱溫度之間反復(fù)凍融3次，4 000 r/min離心10 min后，收集上清液，運(yùn)用96孔板組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50)測定并計(jì)算病毒滴度為107.5/ml，分裝后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3建模 5周齡BALB/c小鼠(購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SCXK(軍)2007-007)30只。隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。所有小鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)進(jìn)行完全麻醉后，對照組(n=15)小鼠鼻腔緩慢滴入0.1 ml的2.5%滅活雞血清的DMEM維持液。實(shí)驗(yàn)組(n=15)小鼠鼻腔緩慢滴入0.1 ml病毒液(TCID50為107.5/ml)。把種病毒的當(dāng)天，定為第0天，分別在1、3、7 d眼球取血并處死小鼠取脾臟和肺臟。

1.4小鼠外周血IL-17A、IL-23p19細(xì)胞因子的表達(dá) 將小鼠外周血在20℃下靜置2 h，10 000 r/min離心10 min取血清。根據(jù)ELISA試劑盒說明書，首先利用試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后經(jīng)過加樣、溫育、洗滌后用底物顯色，終止顯色等步驟后，利用酶標(biāo)儀(賽默飛，美國)在450 nm波長下測定吸光度(OD)值，計(jì)算樣品濃度。

1.5小鼠脾淋巴細(xì)胞的分離 用無菌眼科剪將脾臟剪成碎塊后置細(xì)胞篩中，用注射器活塞頭研磨組織碎塊，用試劑盒中附帶的組織稀釋液5 ml沖洗細(xì)胞篩，濾液轉(zhuǎn)移至新的15 ml離心管中，在室溫300 r/min離心5 min后棄上清。取含有1%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液3 ml重懸細(xì)胞，重懸的細(xì)胞懸液收集后小心轉(zhuǎn)移至分裝有脾淋巴細(xì)胞分離液的15 ml離心管中，25℃，300 r/min，離心20 min。小心吸取分離出來的白色淋巴細(xì)胞層，磷酸酸緩沖液(PBS)清洗，做細(xì)胞計(jì)數(shù)。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移至透氣細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，按每3 ml含106個細(xì)胞濃度補(bǔ)加含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，添加丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)，添加Ionomycin和BFA至1 μmol/L，再繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)6 h。離心后加入PerCP/Cy5標(biāo)記抗小鼠CD3單克隆抗體及同型對照抗體、PE標(biāo)記抗小鼠IL-17A單克隆抗體及同型對照抗體、FITC標(biāo)記抗小鼠CD4單克隆抗體及同型對照抗體。洗滌后加200 μl的染色緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測，采用FLOWJO 7.6 進(jìn)行分析。

1.6小鼠肺組織病理檢查 脫頸處死小鼠，將剖取的無菌左肺放入裝有10%甲醛溶液的玻璃瓶內(nèi)，在密封真空后肺組織完全沉于瓶底，然后固定充分24 h，最后進(jìn)行石蠟包埋、切片及蘇木素-伊紅(HE)染色，最終通過光學(xué)顯微鏡觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變。在200倍光學(xué)顯微鏡下由病理專業(yè)人員閱片，根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)〔5〕：肺泡壁充血、炎性細(xì)胞浸潤、水腫各計(jì)1分；腔內(nèi)滲出、肺內(nèi)支氣管上皮變性各計(jì)1分；肺氣腫、肺泡腔滲出計(jì)1分。累加所有分?jǐn)?shù)，即為病理得分 。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1外周血中細(xì)胞因子IL-23p19、IL-17A的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組小鼠在RSV感染后1、3、7 d，血清IL-17A濃度分別為(36.31±0.89)pg/ml、(126.31±2.14)pg/ml、(100.10±1.14)pg/ml，分別高于對照組的(24.87±0.91)pg/ml、(26.39±0.88)pg/ml、(25.01±1.02)pg/ml(Plt;0.05)，實(shí)驗(yàn)組感染后第3天顯著高于第1天，而感染后第7天低于第3天(均Plt;0.05)。在RSV感染后第1、3、7天，實(shí)驗(yàn)組血清IL-23p19濃度分別為(38.54±0.94)pg/ml、(80.31±0.98)pg/ml、(60.61±0.34)pg/ml，分別高于對照組的(20.21±0.72)pg/ml、(19.41±0.43)pg/ml、(20.66±0.81)pg/ml，實(shí)驗(yàn)組感染后第3、7天較第1天均顯著升高(Plt;0.05)。

2.2小鼠脾淋巴細(xì)胞Th17細(xì)胞亞群的變化 在RSV感染后第1、3、7天，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞Th17亞群比例分別為(0.37±0.04)%、(0.46±0.08)%和(0.98±0.03)%，顯著高于對照組的(0.22±0.04)%、(0.26±0.03)%、(0.21±0.07)%(均Plt;0.05)，且實(shí)驗(yàn)組RSV感染后第7天明顯高于第1天和第3天(Plt;0.05)。

2.3小鼠肺組織病理學(xué)變化 對照組小鼠肺泡壁光滑，肺間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤，肺組織未見異常變化。實(shí)驗(yàn)組小鼠在病毒感染后第1天肺間質(zhì)已有炎性細(xì)胞浸潤，第3天小鼠肺組織出現(xiàn)典型間質(zhì)性肺炎表現(xiàn)，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔明顯狹窄，炎性細(xì)胞浸潤，第7天可見肺間質(zhì)的炎性細(xì)胞浸潤較第3天明顯減輕。第1、3、7天實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織病理改變評分分別為(3.30±0.76)分、(5.60±0.65)分、(4.00±0.71)分，與對照組的(0.80±0.35)分相比，第3、7天明顯高于對照組(Plt;0.05)。見圖1。

圖1 各組肺組織在RSV 感染后1、3、7 d的病理變化(HE，×400)

3 討 論

RSV感染引起的RSV肺炎是導(dǎo)致嬰幼兒下呼吸道感染的常見原因，患病時(shí)年齡越小，RSV病毒的表達(dá)量越高，其病情會越嚴(yán)重，從而導(dǎo)致住院時(shí)間及臨床反應(yīng)持續(xù)的時(shí)間越長〔6〕。嬰兒時(shí)期有嚴(yán)重RSV肺炎病史的兒童，以后發(fā)展成哮喘等過敏性疾病的概率就會增加，而且可能影響兒童免疫系統(tǒng)的發(fā)育。RSV感染可引起包括Th1和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及T細(xì)胞亞群比例失衡的現(xiàn)象〔7〕。Th1類免疫反應(yīng)是最及時(shí)最有效的抗感染機(jī)制，Th1相關(guān)途徑中任何一個環(huán)節(jié)受制約都會造成感染加重和持續(xù)，例如不能產(chǎn)生高濃度干擾素(IFN)-γ、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF)或活性一氧化氮(NO)及抗感染因子IL-10含量降低，容易形成肺部肉芽腫〔8〕。在以往的研究中〔9〕，Th1、Th2平衡能夠解釋免疫反應(yīng)中的炎癥反應(yīng)機(jī)制，Th1類反應(yīng)一般是對病原導(dǎo)致的急性期炎癥的應(yīng)答，而Th2則是與病原清除和感染恢復(fù)有關(guān)。IL-4是Th2細(xì)胞分化的重要細(xì)胞因子，IFN-γ和IL-4既分別是Th1和Th2類細(xì)胞的自分泌細(xì)胞生長因子，也是有互相抑制作用的細(xì)胞因子〔10〕。

Th17作為一種輔助性T細(xì)胞，由在IL-6和IL-23的刺激下TH0細(xì)胞分化而產(chǎn)生，主要分泌促炎癥因子包括IL-17、IL-22等，在機(jī)體防御反應(yīng)和自身免疫性疾病中具有重要的臨床意義〔11〕。IL-17是一種前炎性細(xì)胞因子，能夠招募中性粒細(xì)胞和促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎性因子的功能，可以增加氣道的高反應(yīng)性，刺激氣道黏液腺大量分泌黏液，在哮喘氣道重塑的過程中起到重要的作用。 IL-23雖然不是啟動初始CD4+T細(xì)胞分化Th17的關(guān)鍵因子，但當(dāng)Th17 細(xì)胞分化處于后期時(shí)能起到穩(wěn)定分化的作用，研究顯示小鼠缺乏IL-23幾乎不能分化出 Th17淋巴細(xì)胞〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明IL-17參與了機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)在RSV感染后第3天血清IL-23p19水平含量到達(dá)峰值，但是第7天有所下降，這可能是因?yàn)镮L-23p19的刺激分化Th17細(xì)胞。在RSV感染后的第3天和第7天，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞水平顯著升高，于第7天處于峰值，然而這時(shí)肺組織中的炎癥反應(yīng)卻有所降低，這可能是病毒感染后機(jī)體受到刺激啟動免疫反應(yīng)，使得 Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)移至脾臟中，參與抗病毒免疫，并在病毒被清理后保持一定的免疫反應(yīng)。胡嬋嬋等〔13〕研究顯示其模型組在感染RSV的第3天，Th17的數(shù)量明顯升高，同本研究結(jié)果一致，用RSV(Long株)滴鼻48 h后檢測肺部病理得分同對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而本研究結(jié)果是在第3和7天有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于研究方法不同或沒有檢測48 h的結(jié)果引起的?？傊?，小鼠在RSV感染后，脾淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞的比例升高且外周血血清中 IL-17A的表達(dá)增高，本次研究表明Th17淋巴細(xì)胞亞群及其分泌的IL-17A和IL-23p19炎性細(xì)胞因子參與了宿主抗病毒的免疫反應(yīng)過程。

1季 健,邵雪君,張學(xué)蘭,等.急性呼吸道感染患兒鼻咽分泌物中呼吸道合胞病毒亞型的檢出分析〔J〕.臨床兒科雜志,2014;32(4):375-8.

2張小瑜,趙 燕,王導(dǎo)新,等.羅格列酮通過減少Th17細(xì)胞極化減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2016;36(7):902-6.

3Sim?es EA,Anderson EJ,Wu X,etal.Effects of chronologic age and young child exposure on respiratory syncytial virus disease among US preterm infants born at 32 to 35 weeks gestation〔J〕.PLoS One,2016;11(11):e0166226.

4劉瑞清,張國成,黃可飛,等.重組人干擾素α1b對呼吸道合胞病毒感染小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群及肺組織病理學(xué)的影響〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013;13(9):1639-44.

5徐欣欣,董楊陽,楊 玲,等.流感嗜血桿菌下氣道定植對哮喘小鼠肺組織TH17細(xì)胞表達(dá)及氣道重塑的影響〔J〕.醫(yī)學(xué)研究雜志,2016;45(10):24-30,47.

6Zhou L,Xiao Q,Zhao Y,etal.The impact of viral dynamics on the clinical severity of infants with respiratory syncytial virus bronchiolitis〔J〕.J Med Virol,2015;87(8):1276-84.

7趙茜葉,周旭華,于艷艷,等.呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎患兒Th17細(xì)胞亞群的變化〔J〕.臨床兒科雜志,2014;32(2):193.

8Kim TH,Lee HK.Innate immune recognition of respiratory syncytial virus infection〔J〕.BMB Rep,2014;47(4):184-91.

9Yoshizaki A,Yanaba K,Iwata Y,etal.Cell adhesion molecules regulate fibrotic process via Th1/Th2/Th17 cell balance in a bleomycin-induced scleroderma model〔J〕.J Immunol,2010;185(4):2502-15.

10Zhang HL,Zheng XY,Zhu J.Th1/Th2/Th17/Treg cytokines in Guillain-Barré syndrome and experimental autoimmune neuritis〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev,2013;24(5):443-53.

11Rodeghero R,Cao Y,Olalekan SA,etal.Location of CD4+ T cell priming regulates the differentiation of Th1 and Th17 cells and their contribution to arthritis〔J〕.J Immunol,2013;190(11):5423-35.

12Feng J,Hu Y,Song Z,etal.Interleukin-23 facilitates Th1 and Th2 cell differentiation in vitro following respiratory syncytial virus infection〔J〕.J Med Virol,2015;87(4):708-15.

13胡嬋嬋,袁 斌,周立華,等.清肺口服液對RSV感染小鼠Treg/Th17及IL-2和IL-17水平的影響〔J〕.中國中醫(yī)急癥,2016;6(25):941-4.

〔2017-03-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

R56

A

1005-9202(2017)21-5271-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.023

1 包頭市中心醫(yī)院兒科

李 燕(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事微生物方面的研究。