胡建英 王雅敏 李嶠坷

(武警四川總隊(duì)醫(yī)院呼吸科，四川 成都 614000)

孟魯司特鈉對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)的影響

胡建英 王雅敏 李嶠坷1

(武警四川總隊(duì)醫(yī)院呼吸科，四川 成都 614000)

目的探討孟魯司特鈉對慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠核因子(NF)-κB、腫瘤壞死因子-α信使核糖核酸(TNF-α mRNA)表達(dá)的影響。方法選購清潔級SD成年雄性大鼠24只，以薰香煙法和氣管注入脂多糖建立COPD大鼠模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和用藥組各12只。模型組給予10 ml/kg生理鹽水灌胃，1次/d；用藥組給予0.2 ml孟魯司特鈉灌胃，1次/d，兩組均連續(xù)灌胃4 w。末次給藥結(jié)束，檢測兩組支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞(PMN)、單核巨噬細(xì)胞(AM)絕對計數(shù)及NF-κB、TNF-α、TNF-α mRNA表達(dá)情況。結(jié)果與模型組相比，用藥組白細(xì)胞總數(shù)、PMN、AM計數(shù)較低(Plt;0.05)；模型組與用藥組TNF-α表達(dá)強(qiáng)度分別為(3.30±0.51)、(2.70±0.67)，NF-κB表達(dá)強(qiáng)度分別為(2.90±0.61)、(2.30±0.71)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)；用藥組TNF-α mRNA表達(dá)(0.50±0.07)低于模型組(0.63±0.09)(Plt;0.05)。結(jié)論孟魯司特鈉治療COPD模型大鼠，能抑制NF-κB、TNF-α活性和TNF-α mRNA表達(dá)，孟魯司特鈉對COPD具有一定的療效。

慢性阻塞性肺疾??；孟魯司特鈉；腫瘤壞死因子-α mRNA；核因子-κB

目前尚不十分明確慢性阻塞性肺疾病(COPD)的發(fā)病機(jī)制，其以肺血管、肺實(shí)質(zhì)、氣道的慢性炎癥為特征，肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞增加，造成炎癥細(xì)胞激活而釋放多種細(xì)胞因子和介質(zhì)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)和破壞肺結(jié)構(gòu)〔1〕。有害氣體或顆粒、煙霧等均會造成肺部抗氧化、氧化及抗蛋白酶、蛋白酶的失衡，吸煙能誘導(dǎo)炎癥，造成肺臟損傷，吸入有害氣體或顆粒會引起肺部炎癥，與COPD的發(fā)病有密切聯(lián)系〔2〕。孟魯司特鈉為白三烯受體拮抗劑，能避免白三烯和受體相結(jié)合，能緩解氣道痙攣，抑制氣道炎癥，減輕氣道阻塞，降低氣道高反應(yīng)性；能促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡，對氣道淋巴細(xì)胞核因子(NF)-κB的激活起到抑制作用〔3〕。本研究探討孟魯司特鈉對COPD模型大鼠NF-κB、腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)器材 上海精益醫(yī)用器材廠提供的血球計數(shù)板；購自香港華粵企業(yè)公司的UNIVERSAL 16R低溫離心機(jī)；Olympus顯微鏡；鄭大二附院氣管鏡室提供的灌肺氣管插管針。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品、試劑 北京中杉金橋公司的鼠抗NF-κB克隆抗體；武漢博士德生物工程有限公司的兔抗鼠TNF-α多克隆抗體；瑞氏(Wright)染液；Solarbio 公司的磷酸鹽緩沖液；沙河牌香煙購自鄭州卷煙廠，煙堿量為12 mg，焦油量為15 mg；脂多糖購：美國Sigma公司，貨號：Sigma-L2880，規(guī)格：10 mg，純度：≥99%；孟魯司特鈉購自魯南貝特制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20083330，規(guī)格：5 mg，純度：99%。

1.3實(shí)驗(yàn)動物 選取清潔級SD成年雄性大鼠24只，12周齡，體重210～250 g，平均(230.21±13.75)g，合格證號SCXK(京)2009-0007，均購自北京華阜康生物科技有限公司。飼養(yǎng)于溫度為19℃～25℃、濕度為55%～65%的環(huán)境下，每日光照10～12 h，噪音lt;60 dB，每周進(jìn)行2次清洗消毒鼠籠，自由飲食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已通過動物研究委員會同意。

1.4分組和制備模型 采用隨機(jī)數(shù)字表法將常規(guī)喂養(yǎng)1 w的24只大鼠分為模型組和用藥組各12只。在實(shí)驗(yàn)第1天和第15天將200 μg脂多糖向大鼠器官內(nèi)緩慢注入，實(shí)驗(yàn)第2～14天和第16～32天分別將大鼠置于自制的600 cm×30 cm×40 cm的煙熏箱中進(jìn)行被動吸煙，2次/d，10支/次，60 min/次，兩次之間需間隔≥2 h。被動吸煙完成后，將大鼠放回原飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)，待大鼠出現(xiàn)活動明顯減少、偶有咳嗽、食欲下降、喘息等癥狀時，即造模成功。

1.5給藥方法 模型組大鼠在造模后每日接受10 ml/kg生理鹽水灌胃，1次/d，不給予其他任何處理。在25 ml注射用生理鹽水中加入1 g孟魯司特鈉中進(jìn)行稀釋，備用。用藥組大鼠在造模后每日給予0.2 ml(6 mg/kg)孟魯司特鈉灌胃，1次/d，兩組均連續(xù)灌胃4 w。

1.6檢測方法

1.6.1支氣管肺泡灌洗液的制備 所有動物在最后一次用藥后48 h內(nèi)進(jìn)行頸椎脫臼法處死，分離氣管，將右肺支氣管結(jié)扎，以“T”形切口將氣管插管插入左肺支氣管，并將3 ml生理鹽水經(jīng)氣管插管緩慢注入，保留3 min后將其吸出，以單層紗布過濾，反復(fù)4次，回收支氣管肺泡灌洗液。

1.6.2細(xì)胞計數(shù)及分類 擦拭干凈血球計數(shù)板，將蓋玻片蓋上，用毛細(xì)血管吸取制備的支氣管肺泡灌洗液，經(jīng)上側(cè)面加入血球計數(shù)板，放入顯微鏡下，計數(shù)全部細(xì)胞。計數(shù)的全部×2×1/4×10 000=細(xì)胞數(shù)；細(xì)胞數(shù)×支氣管肺泡灌洗液毫升數(shù)=支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)。取支氣管肺泡灌洗液12 ml，4℃ 2 000 r/min離心8 min，取適量沉渣涂片。以瑞氏染色法染色：在灌洗液涂片區(qū)滴滿染液，2 min后滴加pH6.4磷酸鹽緩沖液，切勿溢出染色區(qū)，染色5～10 min后，將染液以流水沖洗掉，將玻片晾干。鏡檢300個細(xì)胞分類計數(shù)，計算中粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞所占百分比，在計算出某種細(xì)胞在支氣管肺泡灌洗液中的總數(shù)。

1.6.3肺組織標(biāo)本制作 將左主支氣管夾閉，在右主支氣管內(nèi)固定硅膠管，在右肺內(nèi)注入10%甲醛，至其膨脹、邊緣變銳。結(jié)扎右主支氣管扎并浸入10%甲醛、固定。14 d內(nèi)實(shí)施脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.6.4SP法免疫組化檢測 將浸泡玻片以清潔劑刷洗，以流水沖凈后烤干，泡酸1 d并再次沖凈、烤干，以95%酒精浸泡12 h后烤干，再采用多聚賴氨酸浸泡并烤干。苯脫蠟，梯度酒精脫苯，并用蒸餾水清洗3 min，重復(fù)3次，以磷酸鹽緩沖液清洗5 min，滴加3%氧化氫試劑A。將其置于室溫下30 min，將內(nèi)源性過氧化物酶去除，以磷酸鹽緩沖液清洗3 min，重復(fù)3次。在抗原修復(fù)液的容器中浸入切片，在溫度為98℃～100℃的微波爐中加熱7 min，操作2次，加熱后冷卻30 min于室溫環(huán)境下，用磷酸鹽緩沖液清洗3 min，重復(fù)3次。滴加正常山羊血清封閉液試劑B，置于室溫下孵育30 min。將多余液體甩去，滴加1∶50稀釋的一抗(兔抗鼠TNF-α多克隆抗體或鼠抗NF-κB克隆抗體)，于4℃下過夜。而后將其置于37℃下復(fù)溫45 min，用磷酸鹽緩沖液清洗3 min，重復(fù)3次。滴加50 μl Ⅱ抗試劑C，用磷酸鹽緩沖液清洗3 min，重復(fù)3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素染色試劑盒內(nèi)試劑D，用磷酸鹽緩沖液清洗3 min，重復(fù)3次。DAB顯色，時間5～10 min，隨后將其置于流水下沖洗10 min，終止反應(yīng)。蘇木素襯染90 s，蘭化5 min，鹽酸酒精分化10 s(30%鹽酸與75%酒精，體積比為1∶100)，水沖5 min，脫水、透明、封片。將其置于顯微鏡下觀察。以已知陽切片為陽性對照；以磷酸鹽緩沖液為陰性對照。以定位明確都的背景清晰、棕黃色細(xì)胞為陽性細(xì)胞計數(shù)，以連續(xù)切片400倍視野的HE染色結(jié)果計數(shù)視野細(xì)胞數(shù)10個，參考切片免疫組化結(jié)果，記錄NF-κB和TNF-α表達(dá)情況。每張切片隨機(jī)選擇5個視野于高倍鏡下，半定量分析表達(dá)強(qiáng)度。0分：未著色，1分：陽性細(xì)胞lt;總數(shù)25%，2分：彌漫性著為色弱陽性，3分：彌漫性著色為中等強(qiáng)度，4分：彌漫性著色為強(qiáng)陽性。

1.6.5RT-PCR法檢測 按美國Tripure RNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行總RNA提取，按大連寶生物RT-PCR劑盒操作說明進(jìn)行RT-PCR提取。PCR擴(kuò)增條件：2 min 94℃預(yù)變性，0.5 min 94℃變性，55℃退火0.5 min，72℃延伸1 min。循環(huán)28個后，72℃再延伸8 min。經(jīng)瓊脂糖電泳PCR產(chǎn)物后，以凝膠掃描儀進(jìn)行NDA電泳條帶光量子強(qiáng)度分析，以β-actin DNA電泳條帶光量子強(qiáng)度和TNF-α電泳條帶光量子強(qiáng)度比值為TNF-α mRNA 表達(dá)水平參數(shù)。由上海博亞公司合成引物。β-actin上游引物：5′-ATCATGTTTCAGACCTTCA-3′，下游引物：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，PCR擴(kuò)增片段長度312 bp；TNF-α上游引物：5′-ACCCAAGCTTATGCACGGAAAGCATGATC-3′，下游引物：5′-CCCAAGCTTCACAGAGCAATGACTCCAA-3′，PCR擴(kuò)增片段長度725 bp。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和PMN、AM計數(shù)比較 與模型組相比，用藥組白細(xì)胞總數(shù)、PMN、AM計數(shù)顯著降低(Plt;0.001)。見表1。

2.2兩組TNF-α、NF-κB表達(dá)強(qiáng)度比較 與模型組相比，用藥組TNF-α、NF-κB表達(dá)強(qiáng)度顯著降低(Plt;0.001)。見表2，圖1。

2.3兩組TNF-α mRNA表達(dá)比較 與模型組(0.63±0.09)相比，用藥組TNF-α mRNA表達(dá)(0.50±0.07)顯著降低(t=21.558,P=0.000)。

表1 兩組支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和PMN、AM計數(shù)比較

表2 兩組 TNF-α、NF-κB表達(dá)強(qiáng)度比較

圖1 NF-κB免疫組化染色(×200)

3 討 論

反復(fù)不斷的氣道感染和吸煙史是COPD發(fā)生與發(fā)展的主要原因，煙霧中含有大量的有害物質(zhì)，如甲醛、氫氰酸、丙烯醛等，是氧化物的主要來源〔4〕。氧化物能促使組織產(chǎn)生炎癥細(xì)胞，會直接損傷肺組織，促使多種炎癥細(xì)胞浸潤肺間質(zhì)和肺泡腔，而炎癥細(xì)胞能產(chǎn)生氧化物，誘導(dǎo)肺組織分泌、合成炎癥介質(zhì)并損傷肺組織，形成惡性循環(huán)〔5,6〕。此外，香煙中的煙霧能造成下呼吸道對細(xì)菌感染的易感性增加，加重支氣管和肺損傷，對病變進(jìn)展起到促進(jìn)作用。脂多糖在內(nèi)毒素對機(jī)體起致病性方面發(fā)揮重要的作用，其能促使中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等釋放炎癥因子，介導(dǎo)肺組織和氣道炎癥反應(yīng)〔7,8〕。

TNF-α為炎性介質(zhì)，能經(jīng)誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子并與其相互協(xié)同，促進(jìn)炎癥反應(yīng)；能造成中性粒細(xì)胞被激活，使其吞噬功能增強(qiáng)〔9〕。TNF-α的大量釋放和慢性刺激會造成組織免疫病理損傷。TNF-α過度表達(dá)會加重肺組織損傷，引起炎癥反應(yīng)的慢性化〔10〕。NF-κB為DNA結(jié)合蛋白，能調(diào)控免疫細(xì)胞、肺炎癥和氣道上皮細(xì)胞中的黏附分子、細(xì)胞因子及趨化因子等的基因表達(dá)，參與肺部的免疫及炎癥反應(yīng)〔11〕。COPD氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展與NF-κB的活化有密切關(guān)系。TNF-α能增強(qiáng)氣道巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和肺組織中NF-κB活性。激活后的NF-κB，會促使炎癥細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄，而合成TNF-α、白介素-8等炎性細(xì)胞因子〔12〕。上述炎癥因子能使炎癥細(xì)胞活化，對炎性細(xì)胞的釋放、合成炎性介質(zhì)發(fā)揮促進(jìn)作用。本研究說明孟魯司特鈉能降低抑制NF-κB、TNF-α活性和TNF-α mRNA表達(dá)，對COPD具有一定的療效。孟魯司特鈉能競爭性的與白三烯受體結(jié)合，能經(jīng)減少激活的淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和細(xì)胞素、肥大細(xì)胞等炎癥標(biāo)志物，降低氣道的高反應(yīng)性〔13〕。其主要作用機(jī)制包括：①對氣道內(nèi)脫顆粒和嗜酸粒細(xì)胞浸潤發(fā)揮抑制作用，避免細(xì)胞-EOS發(fā)揮作用；②對氣道上皮細(xì)胞生長因子受體表達(dá)起抑制作用，避免杯狀細(xì)胞化生；③避免LTD4刺激平滑肌細(xì)胞分裂〔14，15〕。孟魯司特鈉能避免氣道內(nèi)聚集炎癥細(xì)胞，抑制巨噬細(xì)胞過氧化物、嗜酸粒細(xì)胞陽離子蛋白等炎癥介質(zhì)釋放，發(fā)揮改善患者肺功能、減輕氣道炎癥等作用。本研究仍存在一定的不足之處，如研究樣本量較少，未分析孟魯司特鈉的作用強(qiáng)度是否與用藥劑量有關(guān)等，后期仍需深入研究。

1劉圣金，王 瑞，吳德康，等.礦物藥青礞石對AECOPD痰熱證大鼠肺組織NF-κB表達(dá)及血清中相關(guān)因子的干預(yù)作用〔J〕.中成藥，2017；39(2)：404-7.

2Zaitsev AA，Ovchinnikov YV，Bezlepko AV，etal.Clinical guidelines for management of patients with acute chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Voen Med Zh，2015；336(3)：31-7.

3陳曉明，張偉兵，田曉彥，等.鹽酸氨溴索對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織細(xì)胞凋亡和血清炎癥因子的影響〔J〕.臨床肺科雜志，2017；22(3)：526-31.

4Rajanandh MG，Nageswari AD，Ilango K.Pulmonary function assessment in mild to moderate persistent asthma patients receiving montelukast, doxofylline, and tiotropium with budesonide： a randomized controlled study〔J〕.Clin Ther，2014；36(4)：526-33.

5Jameel B，Tran H，Jersmann H，etal.Potential link between the Sphingosine-1-Phosphate (S1P) system and defective alveolar macrophage phagocytic function in chronic obstructive pulmonary disease (COPD)〔J〕.PLoS One，2015；10(10)： e0122771.

6吳成周.孟魯司特鈉治療穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病療效評價〔J〕.中國藥業(yè)，2017；26(2)：47-9.

7尚立芝，王 峰，謝文英，等.愛羅咳喘寧對慢性阻塞性肺疾病大鼠可溶性細(xì)胞間黏附分子1、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6及炎細(xì)胞的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(17)：4762-4.

8Matsuse H，Kohno S.Leukotriene receptor antagonists pranlukast and montelukast for treating asthma〔J〕.Expert Opin Pharmacother，2014；15(3)：353-63.

9鄭少強(qiáng)，劉德綱.慢性阻塞性肺疾病大鼠血清和肺組織中IL-10、TNF-α及IFN-γ的表達(dá)及意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2017；37(7)：1613-5.

10虞玉英，胡克崇，徐慧芳.布地奈德聯(lián)合孟魯司特鈉對慢性阻塞性肺疾病患者肺功能及血清中IL-6、IL-8和TNF-α的影響〔J〕.中國生化藥物雜志，2014；34(7)：153-5.

11王新杰.孟魯司特鈉聯(lián)合BiPAP呼吸機(jī)對COPD合并呼吸衰竭患者CRP、TNF-α、NT-proBNP的影響〔J〕.標(biāo)記免疫分析與臨床，2016；23(9)：1024-6.

12龔 麗，羅百靈，張 姍.COPD患者肺組織中NF-κB和GRP78的表達(dá)水平及意義〔J〕.國際呼吸雜志，2017；37(1)：18-22.

13秦 艷.孟魯司特鈉治療慢性阻塞性肺疾病122例臨床療效觀察〔J〕.國際呼吸雜志，2016；36(9)：658-61.

14Liu JL，Zhao XH，Zhang DL，etal.Effect of montelukast on the expression of interleukin-18, telomerase reverse transcriptase, and Bcl-2 in the brain tissue of neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage〔J〕.Genet Mol Res，2015；14(3)：8901-8.

15屈 磊，龔傳明，章 濤，等.孟魯司特鈉對COPD急性發(fā)作患者肺功能及炎性介質(zhì)的影響〔J〕.西南國防醫(yī)藥，2015；25(10)：1058-61.

〔2017-04-26修回〕

(編輯 滕欣航)

R563

A

1005-9202(2017)21-5264-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.020

1 武警四川總隊(duì)醫(yī)院ICU

胡建英(1967-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病的研究。