郭紅艷 李淑艷 衣同輝 張春晶

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

內(nèi)皮抑素30肽抑制HepG2細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制

郭紅艷 李淑艷 衣同輝 張春晶

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的探討RGD修飾的人內(nèi)皮抑素30肽抑制HepG2細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制。方法以人內(nèi)皮抑素27肽作為對(duì)照，采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)30肽對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，同時(shí)篩選與侵襲作用相關(guān)的整合素；免疫熒光檢測(cè)30肽對(duì)HepG2細(xì)胞表面αvβ3整合素的聚集作用；RT-PCR及Western印跡檢測(cè)30肽對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶(iCOX-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果30肽能明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖、侵襲，對(duì)侵襲作用的影響與整合素αvβ3相關(guān)，同時(shí)30肽能下調(diào)HepG2細(xì)胞中iCox-2、MMP-2 和MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)，30肽加入αvβ3抗體后，上述作用明顯增強(qiáng)。結(jié)論30肽可通過整合素αvβ3發(fā)揮其抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用。

內(nèi)皮抑素；RGD序列；細(xì)胞侵襲；基質(zhì)金屬蛋白酶；環(huán)氧合酶

內(nèi)皮抑素是一種內(nèi)源性血管生成抑制劑〔1〕，由膠原蛋白ΧⅧ羧基端的184個(gè)氨基酸殘基組成，近年發(fā)現(xiàn)其具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、改善肺纖維化作用，且與其他多種疾病相關(guān)〔2,3〕。已有研究證實(shí)，內(nèi)皮抑素活性區(qū)主要在N端的27個(gè)氨基酸上，且30肽具有比內(nèi)皮抑素更強(qiáng)的抑制血管生成和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性〔4〕，前期研究證明，30肽具有抑制人SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲的能力〔5〕，本文擬在前期研究的基礎(chǔ)上，研究其發(fā)揮抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco)、新生牛血清(PAA)、胰酶(DIFCO)購于Invitrogen (USA)公司。Matrigel(E1270)、葡聚糖凝膠G15(Pamacia)購買于Sigma公司，幾丁質(zhì)親和層析樹脂(NEB)購買于NEB公司，WST-1細(xì)胞增殖試劑盒購于瑞士Roche公司，抗體(抗-α5、抗-β1、抗-β3及抗-αvβ3)、抗基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、抗環(huán)氧合酶(Cox-2)、抗β-actin抗體及二抗購自美國Santa Cruz公司，抗MMP-9購自美國cell signaling公司。Transwell小室購自美國Corning Costar公司，RNA提取試劑盒購于美國Promega公司，RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.230肽對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的影響 人肝癌細(xì)胞株HepG2(購于中國上海細(xì)胞生物所)，常規(guī)方法培養(yǎng)。取HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml，每孔100 μl分別加到96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后向各孔中分別加入30肽和27肽(濃度分別為0，20，40，60，80和100 μg/ml，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔)。分別培養(yǎng)24和48 h后棄去加肽培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每孔加入100 μl無血清培養(yǎng)基，10 μl WST-1，繼續(xù)在5%CO237℃孵箱中培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀(Bio-Rad)測(cè)定各孔光吸收值，選擇450 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，630 nm為參考波長(zhǎng)，以肽濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值(%)為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.330肽對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響 30肽分離及純化方法見參考文獻(xiàn)〔5〕。設(shè)立對(duì)照組、27肽組和30肽組，對(duì)照組細(xì)胞未經(jīng)肽處理，27肽組和30肽組細(xì)胞分別經(jīng)50 μg/ml 27肽和30肽處理24 h。將細(xì)胞懸液加到Transwell小室中(1×105個(gè))，孔板下室加入含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，吸棄上室中的溶液，用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)側(cè)壁未轉(zhuǎn)膜的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染小室膜20 min，晾干，在100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，拍照保存，每膜計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，每組設(shè)3個(gè)平行孔。同時(shí)，我們選用幾種常見的整合素α5、β1、β3和αvβ3，以單獨(dú)30肽為對(duì)照組，30肽分別加入整合素為實(shí)驗(yàn)組，檢測(cè)整合素對(duì)30肽作用的影響。

1.4免疫熒光檢測(cè)30肽對(duì)αvβ3整合素的聚集作用 設(shè)立對(duì)照組、27肽組和30肽組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種24孔培養(yǎng)板，孵育24 h，給藥組分別加入終濃度為50 μg/ml的27肽和30肽，對(duì)照組加入相同體積PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，5%BSA封閉30 min，每孔加入αvβ3一抗，置于4℃濕盒內(nèi)過夜，PBS振洗3次，每孔加入FITC標(biāo)記的二抗，37℃1 h，PBS沖洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5RT-PCR檢測(cè)30肽對(duì)誘導(dǎo)型Cox(iCox)-2、MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)的影響 用RT-PCR方法檢測(cè)：iCox-2、MMP-2和MMP-9 mRNA在30肽及27肽作用下的變化，終濃度為50 μg/ml 30肽和27肽分別作用HepG2細(xì)胞0、12、24、48 h后，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR引物序列見表1，PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)次數(shù)為35個(gè)循環(huán)(β-actin為30個(gè)循環(huán))；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下凝膠置于成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照，記錄。另外分別用50 μg/ml 30肽、50 μg/ml αvβ3抗體和50 μg/ml 30肽+50 μg/ml αvβ3抗體作用于HepG2細(xì)胞24 h，后續(xù)處理同上，分別檢測(cè)細(xì)胞中iCox-2、MMP-2和MMP-9 mRNA。

表1 引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度和退火溫度

1.6Western印跡檢測(cè)30肽對(duì)iCox-2、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響 用Western印跡方法檢測(cè)iCox-2、MMP-2和MMP-9蛋白在30肽及27肽作用下表達(dá)的變化。終濃度為50 μg/ml 30肽和27肽分別作用HepG2細(xì)胞0、12、24、48 h后，分別收集細(xì)胞800 r/min，離心5 min，提取蛋白，檢測(cè)細(xì)胞總蛋白濃度。取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液中室溫封閉2 h，加入相應(yīng)稀釋倍數(shù)的一抗，4℃孵育過夜，洗膜后，加入1∶5 000的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，采用化學(xué)發(fā)光法(ECL)曝光膠片，沖洗顯色檢測(cè)相應(yīng)的蛋白條帶，GPS8000型凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶。另外設(shè)立30肽組和30肽+αvβ3抗體組，分別用50 μg/ml 30肽和30肽+αvβ3抗體作用于HepG2細(xì)胞24 h，后續(xù)處理同上，分別檢測(cè)細(xì)胞中iCox-2、MMP-2 和MMP-9蛋白表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.130肽對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的30肽和27肽(0～100 μg/ml)，培養(yǎng)24和48 h，細(xì)胞的增殖均明顯受到抑制，呈時(shí)間劑量依賴性，30肽的抑制作用顯著強(qiáng)于27肽。應(yīng)用線性回歸分析計(jì)算出30肽對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)半數(shù)抑制濃度為49.7 μg/ml，見表2。

表2 30肽對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響

與同時(shí)間點(diǎn)前一濃度比較：1)Plt;0.05；與同濃度前一時(shí)間點(diǎn)比較：2)Plt;0.05；與同時(shí)間點(diǎn)同濃度27肽比較：3)Plt;0.05

2.230肽對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響 對(duì)照組、27肽組和30肽組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別是(205.6±20.13)個(gè)，(132.9±13.55)個(gè)，(71.25±9.45)個(gè)。肽處理組的穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯低于對(duì)照組，30肽組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于27肽組(Plt;0.05)。30肽分別加入α5、β1、β3、αvβ3整合素抗體后，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(80±8.02)個(gè)，(79.17±8.12)個(gè)，(82.5±8.19)個(gè)，(39.99±4.35)個(gè)。可見30肽加入αvβ3抗體后，HepG2細(xì)胞的侵襲能力得到進(jìn)一步抑制(Plt;0.05)，其余抗體對(duì) 30肽抑制HepG2細(xì)胞侵襲能力的作用不明顯(Pgt;0.05)。見圖1。

圖1 30肽和整合素對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響(×100)

2.330肽對(duì)αvβ3整合素的聚集作用 與對(duì)照組及27肽組相比，30肽組HepG2細(xì)胞表面αvβ3明顯聚集成簇，見圖2。

2.4RT-PCR檢測(cè)iCox-2、MMP-2 和MMP-9 mRNA表達(dá) iCox-2、MMP-2 和MMP-9 mRNA表達(dá)量隨著27肽和30肽作用時(shí)間的延長(zhǎng)而下調(diào)，30肽在24 h開始iCox-2、MMP-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)較27肽組明顯降低(Plt;0.05)。與30肽組和αvβ3抗體組相比，30肽+αvβ3抗體組明顯下調(diào)iCox-2、MMP-2 和MMP-9 mRNA表達(dá)量(Plt;0.05)，見表3，圖3，表4。

圖2 30肽對(duì)αvβ3整合素的采集作用(免疫熒光，×400)

組別iCOX-2/β-actin0h12h24h48hMMP-2/β-actin0h12h24h48hMMP-9/β-actin0h12h24h48h27肽組1.73±0.131.67±0.161.58±0.251.52±0.112.07±0.311.90±0.211.78±0.291.56±0.232.12±0.281.93±0.271.77±0.291.62±0.2930肽組1.71±0.171.64±0.201.44±0.161)1.18±0.231)1.99±0.251.82±0.271.45±0.251)1.29±0.221)2.08±0.291.76±0.171.58±0.271)1.27±0.281)

與27肽組比較：1)Plt;0.05

圖3 30肽及整合素αvβ3對(duì)HepG2細(xì)胞iCox-2、MMP-2 和MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

組別iCOX-2/β-actinMMP2/β-actinMMP9/β-actin30肽組2.80±0.301)1.98±0.191)1.88±0.181)αvβ3組2.78±0.241)1.97±0.221)1.83±0.151)30肽+αvβ3組2.43±0.281.51±0.151.66±0.14

與30肽+2vβ3組比較：1)Plt;0.05

2.5Western印跡檢測(cè)iCOX-2、MMP-2 和MMP-9蛋白表達(dá) iCOX-2、MMP-2 和MMP-9蛋白表達(dá)量隨27肽和30肽作用時(shí)間的延長(zhǎng)而下調(diào)，與27肽組相比，30肽組在24 h開始降低iCox-2、MMP-2 和MMP-9蛋白表達(dá)(Plt;0.05)。與30肽組和αvβ3抗體組相比，30肽+αvβ3抗體組明顯下調(diào)iCox-2、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量。見圖4，表5，表6。

圖4 30肽及整合素αvβ3對(duì)HepG2細(xì)胞iCox-2、MMP-2 和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

組別iCOX-2/β-actin0h12h24h48hMMP-2/β-actin0h12h24h48hMMP-9/β-actin0h12h24h48h27肽組1.77±0.171.66±0.161.56±0.151.48±0.221.70±0.171.68±0.161.63±0.191.53±0.121.74±0.271.68±0.241.63±0.251.57±0.1930肽組1.76±0.211.59±0.161.37±0.151)1.14±0.161)1.73±0.171.67±0.191.25±0.151)0.92±0.111)1.70±0.291.67±0.161.46±0.151)1.20±0.131)

與27肽組比較：1)Plt;0.05

表6 整合素αvβ3對(duì)HepG2細(xì)胞iCox-2、MMP-2 和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

與30肽+αvβ3組比較：1)Plt;0.05

3 討 論

在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞侵襲基底膜是重要環(huán)節(jié)，重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)茌^好地反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力〔6,7〕。30肽比27肽多出一個(gè)RGDRGD序列，30肽抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力強(qiáng)于27肽，必定與其中的RGDRGD序列相關(guān)。RGD序列是指包含Arg-Gly-Asp 三肽的序列，細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)借助其中的RGD序列識(shí)別并結(jié)合不同亞型的整合素，將細(xì)胞外信息傳入細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)一系列病理生理變化，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞黏附，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡。

整合素在體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞表面廣泛表達(dá),在多種生命活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔8〕,與腫瘤等疾病密切相關(guān)〔9〕，具有RGD序列的小分子多肽會(huì)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)與整合素的結(jié)合，產(chǎn)生去整合素效應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，Cox-2與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、發(fā)生、發(fā)展、分化及預(yù)后過程密切相關(guān)〔10〕。Cox-2表達(dá)量與癌癥的惡性程度呈正相關(guān)〔11,12〕。Elzagheid等〔13〕研究認(rèn)為αvβ3整合素信號(hào)通路參與了對(duì)Cox-2表達(dá)的調(diào)節(jié)，同時(shí)Cox-2對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)又與其下游MMPs等的表達(dá)和活性密切相關(guān)，Cox-2以前列腺素(PGs)依賴方式調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞分泌MMPs，繼而影響肝癌細(xì)胞的黏附和移行〔14，15〕。

本研究表明，RGD序列修飾的內(nèi)皮抑素30肽不僅能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，還能有效地抑制肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲與轉(zhuǎn)移。30肽抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的能力明顯大于內(nèi)皮抑素27肽，其機(jī)制可能是30肽通過RGDRGD序列與αvβ3整合素結(jié)合，下調(diào)iCox-2、MMP-2和MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而降低腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，抑制腫瘤細(xì)胞的體外黏附、侵襲和遷移能力。

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〔2016-10-08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

R735.2

A

1005-9202(2017)21-5261-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.019

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院博士專項(xiàng)科研項(xiàng)目(No.QY2016B-20)

李淑艷(1968-)，女，教授，博士，主要從事腫瘤分子治療研究。

郭紅艷(1979-)，女，講師，博士，主要從事腫瘤分子生物學(xué)機(jī)制研究。