馮 燕 楊 暢 延 文 江 濤

(武漢市第一醫(yī)院病理科，湖北 武漢 430022)

miR-185通過靶向BRCA1抑制三陰乳腺癌細胞的增殖與侵襲

馮 燕 楊 暢1延 文 江 濤

(武漢市第一醫(yī)院病理科，湖北 武漢 430022)

目的探討miR-185是否通過靶向人類乳腺癌易感基因(BRCA)1抑制三陰乳腺癌細胞的生長與侵襲及其抗腫瘤機制。方法采用TargetScan軟件預測miR-185靶基因、將野生型或突變型E2F6的3′-UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報告基因的下游(E2F6-wt或E2F6-mut)并分別與miR-185模擬物(miR-185 mimics)及其無關對照寡核苷酸序列(scramble)、抗miR-185寡核苷酸序列(miR-185-LNA)及其無關對照寡核苷酸序列(control)共轉染，熒光素酶報告基因實驗驗證所預測的靶基因E2F6、qRT-PCR檢測轉染后靶基因的mRNA表達水平、Western印跡檢測轉染后靶基因的蛋白表達水平。MTS和Transwell驗證不同轉染后，三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231的細胞生長增殖活性和侵襲能力。結果在共轉染miR-185 mimics和E2F6-wt、scramble和E2F6-wt兩組中，miR-185組熒光素酶活性強度降低了約41.3%(Plt;0.05)。轉染miR-185后，E2F6的蛋白和mRNA水平均顯著下調，BRCA1的蛋白和mRNA水平均顯著上調(Plt;0.05)。在細胞增殖試驗中，轉染miR-185后，三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長速度顯著低于scramble組(Plt;0.05)；與vector組比，BRCA1組可顯著抑制三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長(Plt;0.05)，且miR-185+BRCA1組比BRCA1組對細胞生長的抑制作用更加明顯(Plt;0.05)。Transwell侵襲實驗中，轉染miR-185和BRCA1組在36 h后穿過基底膜的細胞數(shù)分別為(100±6)和(100±9)，而對照組即轉染scramble和轉染vector組穿膜細胞數(shù)分別為(210±13)和(180±14)，即miR-185和BRCA1能明顯抑制三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231的穿膜能力，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。結論miR-185通過靶向調控BRCA1表達而抑制三陰乳腺癌細胞的生長與侵襲。

三陰乳腺癌；miR-185；人類乳腺癌易感基因1；生長；侵襲

三陰乳腺癌約占所有類型乳腺癌的15%，其顯著特征是在年輕乳腺癌患者中高發(fā)〔1〕。MicroRNAs(英文簡稱miRNAs)為內源性非編碼的小分子RNA，miRNAs可通過和mRNA的3′-UTR區(qū)域的不完全或完全配對，促進mRNA的降解和(或)阻礙其翻譯，從而在轉錄后水平上負調控其表達。細胞的增殖、分化、凋亡、衰老、個體發(fā)育等許多的生命活動都受到了miRNAs的調控〔2〕，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與miRNAs密切相關。據(jù)報道，miR-200b在多種惡性腫瘤組織及細胞中表達下調〔3～7〕。miRNA-183、miR-182和miR-96與多種惡性腫瘤的生長增殖和復發(fā)轉移密切相關〔8〕。有報道稱miR-185在膠質瘤的表達顯著下調，并可以通過直接靶向DNMT1、RhoA和CDC42基因抑制膠質瘤的增殖和侵襲〔9〕。人類乳腺癌易感基因(BRCA)1是具有遺傳傾向的乳腺癌和卵巢癌的易感基因，其基因結構和功能的異常通常與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關〔10〕。BRCA1是一種抑癌基因，能夠抑制多種腫瘤細胞的生長，本研究擬通過證實BRCA1是miR-185調控的靶基因，然后證實miR-185是通過其靶基因BRCA1抑制三陰乳腺癌細胞的增殖與侵襲。

1 材料與方法

1.1主要材料 miR-185模擬物(miR-185 mimics)及無關序列對照(scramble)，鎖核酸mir-185-LNA及其對照control購買于Ambion公司。兔單抗人BRCA1、兔抗人E2F6抗體和兔抗人β-actin抗體購買于CAT公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購買于博士德公司(武漢)。si-BRCA1:5′-GGAACCUGUCUCCACAAAGdTdT-3′和si-E2F6:5′-AGGAGACUGGGUAACUUCCTT-3′購買于Invitrogen公司。pcDNA3.1-BRCA1重組質粒(pcDNA3.1-BRCA1)，pcDNA3.1空載體對照(vector)，突變型E2F6的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)的熒光素酶報告載體(E2F6-mut)和野生型E2F6的3′-UTR的熒光素酶報告載體(E2F6-wt)由GeneCopoeia公司構建。

雙熒光素酶活性檢測試劑盒購買于Promega公司，Lipofectamine 2000轉染試劑及Trizol購買于Invitrogen公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、抗生素(青鏈霉素混合液,青鏈霉素混合液100X)購買于Gibco公司。三陰乳腺癌細胞(MDA-MB-231)購買于中科院上海生化細胞研究所。蛋白提取試劑盒購買于BestBio公司?；瘜W增強發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒購于Thermo公司。Transwell的0.8 nm小室和基質膠購買于BD公司，MTS細胞生長增殖/毒性檢測試劑盒購買于Sigma公司。

1.2細胞培養(yǎng) MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含10% FBS，1%青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)的DMEM低糖培養(yǎng)基中(Gibco，英濰捷基)，放置于37℃，含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內孵育。MDA-MB-231培養(yǎng)時為單層貼壁生長狀態(tài)，一般在細胞生長匯合度達到80%～90%時，棄去培養(yǎng)液，用1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，棄去PBS，0.25% 含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化，鏡下觀察，細胞間隙增大時，添加完全培養(yǎng)基中和胰酶，離心，收集細胞，吹打細胞成單細胞懸液，常規(guī)傳代。

1.3轉染miRNA和質粒 收集細胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋，吹打制成(1～5)×104細胞/ml的細胞懸液，6孔板中每孔鋪2 ml細胞，置于細胞培養(yǎng)箱中。細胞匯合度60%～80%時準備轉染，用無菌EP管配制Lipofectamine 2000和轉染試劑(質?；騧iRNA)；兩者混勻并室溫放置20 min。將上述混合物加入到無血清培養(yǎng)液(不含抗生素)中混勻，加入到待轉染的6孔中；置于培養(yǎng)箱中，6 h后換成常規(guī)培養(yǎng)基。48 h后，收集細胞并抽提蛋白或進行其他實驗。

1.4熒光素酶活性檢測miR-185靶基因 將實驗分成8組：miR-185與E2F6-wt；scramble與E2F6-wt；miR-185與E2F6-mut；scramble與BRCA1-mut；miR-185-LNA與E2F6-wt；control與E2F6-wt；miR-185-LNA與E2F6-mut；control與E2F6-mut；分別共轉染上述8組到MDA-MB-231細胞中，48 h后，收集細胞。按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒(Promega，美國)說明書操作，單光子檢測儀(Biorad，美國)檢測熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值，每組實驗設三個復孔。

1.5Western印跡檢測三陰乳腺癌細胞中BRCA1和E2F6蛋白表達改變 將實驗分4組，miR-185與scramble；BRCA1與vector分別轉染到MDA-MB-231細胞，在48 h后提取各組的細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。分別取30 μg樣本，進行8%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳實驗。將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5% BSA室溫封閉1 h，加入1∶1 500的兔抗人BRCA1抗體和E2F6抗體、1∶1 000兔抗人β-actin抗體，4℃過夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，每次10 min，加入1∶5 000的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔的二抗，室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL發(fā)光劑并用X片曝光、顯影、定影、掃描并保存條帶的圖片。Quantity One軟件分析，以目的蛋白BRCA1和E2F6條帶的灰度值和內參和β-actin的蛋白灰度值比值來確定目的蛋白的相對表達水平，每組實驗設置3個復孔。

1.6MTS法檢測miR-185和BRCA1對三陰乳腺癌細胞生長增殖活性的影響 將實驗分成6組：miR-185與scramble；BRCA1與vector；miR-185+BRCA1與scramble+vector。分別轉染到MDA-MB-231中，每組設置6個復孔，在未接種細胞的孔中加入DMEM為調零孔。轉染后培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。隨后每孔加入30 μl的MTS試劑，37℃孵育2 h后，每孔中加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min致使結晶物充分融解。酶標儀測定492 nm波長的OD492值。增殖活性=(處理組-調零孔)/(對照組-調零孔)×100%，每組實驗設置3個復孔，對照組為scramble組或vector組。

1.7Transwell侵襲實驗 Transwell小室鋪加基質膠稀釋液，放置4～5 h使其成膜。取100～200 μl細胞稀釋液接種于小室的上腔內，下腔中加入500 μl的完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱36 h，取出并用0.1%結晶紫甲醇溶液染色30 min，用棉簽擦去上室內細胞，PBS清洗3次，倒置并晾干。在倒置顯微鏡(OLYMPUS LX71，奧林巴斯)下觀察，隨機選取4個高倍視野進行細胞計數(shù)，取平均值，記錄實驗結果。

1.8統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1E2F6是miR-185直接調控的靶基因 E2F6是miR-185的靶基因。將野生型或突變型的E2F6的3′-UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報告基因的下游，即分別將E2F6-wt或E2F6-mut與miR-185模擬物(miR-185 mimics)以及其無關對照寡核苷酸序列(scramble)、抗miR-185寡核苷酸序列(miR-185-LNA)以及其無關對照寡核苷酸序列(control)共轉染到三陰乳腺癌細胞系MDA-MB-231中。單光子檢測熒光素酶活性，檢測結果顯示：在共轉染E2F6-wt和miR-185 mimics后，熒光素酶活性強度下降了約41.3%，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)；共轉染E2F6-wt和miR-185-LNA后，熒光素酶活性強度顯著增加。而與E2F6-mut共轉染的4組中，熒光素酶的活性強度并無顯著差異。見圖1。

與scramble、control比較：1)Plt;0.05；下圖同圖1 TargetScan軟件預測和熒光素酶報告載體實驗證實E2F6是miR-185直接調控的靶基因

2.2過表達miR-185抑制三陰乳腺癌細胞中基因BRCA1的表達 過表達miR-185時，BRCA1蛋白表達和mRNA表達顯著高于scramble組，E2F6的蛋白和mRNA表達水平顯著低于scramble組(Plt;0.05，圖2A、2B和2C)。而相對于control組，抑制miR-185的表達則顯著上調E2F6的蛋白和mRNA表達水平同時降低BRCA1的蛋白和mRNA水平(Plt;0.05，圖2A、2B和2C)。另外通過si-RNA干擾E2F6和(或)BRCA1的表達，均可影響B(tài)RCA1的表達水平(圖2D)。

2.3miR-185可增加BRCA1對MDA-MB-231生長增殖的促進作用 轉染BRCA1組的BRCA1蛋白表達水平顯著高于vector組(Plt;0.05，圖3A)，即轉染成功。分別轉染miR-185與miR-NC；BRCA1與vector；miR-185+BRCA1與miR-NC+vector到MDA-MB-231細胞，轉染48 h后，MTS法檢測細胞生長增殖活性。結果顯示，轉染miR-185組的細胞生長增殖速度顯著低于miR-NC組(Plt;0.05，圖3B)；與vector組比，BRCA1組可顯著抑制MDA-MB-231細胞的生長增殖(Plt;0.05，圖3B)，而

圖2 過表達miR-185上調人類乳腺癌易感基因1(BRCA1)的表達

與vector比較：1)Plt;0.05；與scramble比較：2)Plt;0.05；與vecstor(pcDNA3.1)比較：3)Plt;0.05圖3 MTS證實miR-185可通過BRCA1抑制MDA-MB-231細胞的生長增殖

miR-185+BRCA1組生長增殖速度顯著低于BRCA1組(Plt;0.05，圖3B)，結果提示過表達BRCA1可能促進miR-185對三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長增殖的抑制作用(圖3B)。即miR-185可通過間接靶向基因BRCA1表達而抑制三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231生長增殖。

2.4miR-185對三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231侵襲的影響 Transwell結果顯示，轉染miR-185的組和轉染BRCA1的組，在36 h后，MDA-MB-231細胞穿過基質膠的細胞數(shù)量分別為(100±6)和(100±9)，而對照組的細胞數(shù)即轉染scramble和轉染Vector組的細胞數(shù)分別為(210±13)和(180±14)，差異具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。即外源性高表達miR-185能抑制MDA-MB-231細胞的侵襲能力，高表達BRCA1能降低乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞的侵襲能力。見圖4。

圖4 Transwell侵襲實驗檢測過表達miR-185對三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231侵襲能力的作用

3 討 論

乳腺癌是在臨床上和生物學上具有許多不同類別的一種腫瘤，其具有顯著的腫瘤異質性。其中，最具有侵略性的乳腺癌類型為basal-like型即三陰乳腺癌〔11〕。三陰乳腺癌具有高侵襲性，易復發(fā)轉移，易化療耐藥，且目前缺乏有效的臨床治療手段〔12〕。目前關于miRNA-185在腫瘤中的作用已有部分研究，有報道稱miR-185在膠質瘤的表達顯著下調，并可以通過直接靶向DNMT1，RhoA和CDC42這三個基因抑制膠質瘤的增殖和侵襲〔13〕。BRCA1是一種抑癌基因，常在乳腺癌和卵巢癌中發(fā)生突變，能夠抑制多種腫瘤細胞的生長〔14〕。目前關于miR-185和BRCA1在三陰乳腺癌中的作用研究較少，具體機制不明。

本次研究采用多種分子生物學技術來探究miR-185和BRCA1與三陰乳腺癌細胞的增殖與侵襲的關系。生物信息學技術用于預測miR-185的靶基因、熒光素酶報告基因實驗檢測靶基因活性、qRT-PCR檢測靶基因的mRNA表達水平、Western blot檢測靶基因的蛋白表達水平。另外也采用MTS和Transwell等實驗從功能上驗證miR-185通過直接靶向E2F6，間接

上調BRCA1，抑制三陰乳腺癌細胞的生長與侵襲。通過轉染miR-185到MDA-MB-231中，本文發(fā)現(xiàn)miR-185能顯著抑制乳腺癌細胞的生長與增殖。且過表達BRCA1能夠進一步促進miR-185對MDA-MB-231的生長增殖的抑制作用。即外源性高表達miR-185能顯著抑制三陰乳腺癌細胞的生長與侵襲，即miR-185在三陰乳腺癌中具有潛在的抑癌作用。

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〔2017-02-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

R73

A

1005-9202(2017)21-5257-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.018

1 湖北省第三人民醫(yī)院呼吸內科

楊 暢(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

馮 燕(1977-)，女，主治醫(yī)師，主要從事病理學研究。