佘文莉 王曉東 謝光輝 劉 暉 曹 鳳 羅良濤

(暨南大學附屬第一醫(yī)院燒傷整形美容科，廣東 廣州 510630)

荷負電氣溶膠對大鼠燒傷創(chuàng)面表皮干細胞的影響

佘文莉 王曉東1謝光輝 劉 暉 曹 鳳 羅良濤2

(暨南大學附屬第一醫(yī)院燒傷整形美容科，廣東 廣州 510630)

目的分析大鼠燒傷創(chuàng)面采用荷負電氣溶膠對表皮干細胞的影響并分析作用機制。方法選取清潔級健康大鼠，在背部側分別做燒傷創(chuàng)面，隨機分為實驗組和對照組，實驗組采取荷負電氣溶膠治療，對照組大鼠不做任何治療，分析兩組大鼠創(chuàng)面愈合過程，通過免疫組織化學染色法分析干細胞含量，并分析表皮生長因子(EGF)、β1整合素表達變化。結果燒傷24 h后取創(chuàng)面組織染色觀察為深Ⅱ度病理改變，第2天基底層細胞增殖，5 d表皮細胞增殖，排列緊密。對照大鼠第3天局部增殖，第7天增殖明顯，分布稀疏。經過治療，相同時間實驗組組織切片內陽性單位含量顯著大于對照組(Plt;0.05)。實驗組平均愈合時間〔(7.1±1.2)d〕顯著短于對照組〔(9.5±1.2)d〕。實驗組大鼠在傷后EGF和β1整合素該表達；在傷后第3天表達明顯增高，第7天仍然維持較高表達，對照組大鼠EGF和β1整合素在傷后第3天有所表達，第7天表達高峰，兩組大鼠EGF和β1整合素隨著治療時間不同存在顯著差異(Plt;0.05)。結論大鼠燒傷創(chuàng)面實施荷負電氣溶膠治療能夠促進表皮干細胞的增殖，其機制可能與EGF、β1整合素表達上升有關。

燒傷創(chuàng)面；表皮干細胞；荷負電氣溶膠

燒傷創(chuàng)面愈合受到多種因素的影響，在治療中關鍵在于促進皮膚創(chuàng)面的愈合。表皮干細胞是皮膚起源，整合素能夠參與調節(jié)表皮干細胞增殖分化，因此可以認為促進表皮干細胞分化有可能加快創(chuàng)面的愈合，創(chuàng)面愈合速度和質量可以通過檢測表皮干細胞實現〔1〕。負荷電氣溶膠能夠引起表皮生長因子(EGF)等高表達，促進表皮干細胞組織分化。本文擬分析大鼠燒傷創(chuàng)面采用荷負電氣溶膠對表皮干細胞的影響。

1 材料與方法

1.1動物 選取健康清潔級大鼠20只(中山大學北校區(qū)實驗動物中心提供)，雌雄不限，體重200～250 g，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，劑量在0.3 ml/100 g，背部剃毛，作直徑2 cm圓性皮膚區(qū)。所有大鼠水浴法燒傷，水溫設定在85℃，持續(xù)時間15 s，組織學檢查為深Ⅱ創(chuàng)面。

1.2方法 治療儀器為珠?？祈锕こ淘O備有限公司生產生物電創(chuàng)傷治療儀。大鼠隨機分為實驗組和對照組各10只，大鼠均按照常規(guī)簡單清理創(chuàng)面，實驗組大鼠采用NB-Ⅰ型生物電創(chuàng)傷治療儀，調整發(fā)射窗距離，自第2日開始每次照射1.5 h，直至創(chuàng)面愈合。對照組大鼠不做氣溶膠照射。

1.3觀察指標 分別在治療前、治療3、7、10 d取組織樣本檢查。石蠟切片烤片，二甲苯脫蠟，PBS沖洗，清除過氧化物酶，加一抗二抗和三抗，采用PBS清晰標本，DAB液顯色，蘇木精染色水洗。第一抗體作為對照試驗。采用陽性細胞術半定量法，將玻片放在相同光線下觀察，棕褐色為陽性，依照陽性細胞數目判斷陽性染色程度。采用SABC法測定EGF、β1整合素，在200倍鏡下觀察免疫組化記錄，計算平均陽性單位(PU)值，PU值越小陽性單位越大。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件行t或者F檢驗。

2 結 果

2.1免疫組織化學染色結果及創(chuàng)面觀察 基底膜上免疫陽性反應細胞較小，呈現橢圓形，內含棕色顆粒，陰性細胞位于基底膜上層和毛囊內層。燒傷24 h后取創(chuàng)面組織染色觀察為深Ⅱ度病理改變，第2天基底層細胞增殖，5 d表皮細胞增殖，排列緊密。對照大鼠第3天局部增殖，第7天增殖明顯，分布稀疏。治療組大鼠創(chuàng)面腫脹較對照組輕。平均愈合時間為(7.1±1.2)d，顯著短于對照組大鼠愈合時間(9.5±1.2)d(Plt;0.05)。

2.2治療前后陽性細胞數變化 治療后，實驗組組織切片內陽性單位含量顯著大于對照組(Plt;0.05)。見表1。

2.3EGF和β1整合素水平比較 實驗組大鼠在傷后第3天EGF和β1整合素表達明顯增高，第7天仍然維持較高表達；對照組大鼠在傷后第3天有所表達，第7天表達高峰，兩組大鼠EGF和β1整合素隨著治療時間不同存在顯著差異(Plt;0.05)。見表2。

表1 創(chuàng)面治療前后大鼠陽性細胞數變化陽性細胞數/100個細胞)

表2 大鼠EGF和β1整合素免疫組化染色圖像分析PU值

3 討 論

皮膚損傷是影響人類健康的重要威脅之一，皮膚延遲愈合是引起并發(fā)癥的主要原因之一。目前臨床促進創(chuàng)面愈合可以通過兩種途徑，一種是激活內源性物質，采用EGF、維生素C等激活皮膚干細胞，加速皮膚的愈合；另外一種是外源性應用〔2〕。生物電治療儀能夠產生荷負電氣溶膠，可穿透創(chuàng)面、黏膜等組織，直接刺激細胞和堅持，影響細胞生物電的活性，從而產生相應的生物學效應。在以往研究中發(fā)現荷負電氣溶膠能夠顯著促進燒傷后創(chuàng)面干細胞的愈合，而且沒有出現不良反應。本研究結果表明，采用荷負電氣溶膠治療能夠有效促進表皮干細胞的增殖，刺激表皮干細胞，加快創(chuàng)面愈合。

在體外研究中發(fā)現正常人10%皮膚基底層有足夠增殖潛能的干細胞，其中一半具有增殖分裂能力，分化細胞〔3〕。正常情況下，干細胞數量是恒定的，但是在機械、化學刺激等作用下，停留在G0～G1期的細胞可能出現增殖情況。燒傷后，皮下組織殘留的毛細血管等在刺激后，干細胞成為表皮干細胞主要來源，從理論上分析，給予適當刺激有助于細胞增殖。在本組研究中采取荷負電氣溶膠，發(fā)現表皮干細胞確實存在增殖表現。以往有研究發(fā)現外環(huán)境變化也會引起表皮細胞逆向分化，針對潰瘍創(chuàng)面采用EGF治療，發(fā)現顆粒細胞層聚集成島狀，表皮細胞分化為干細胞，創(chuàng)面表皮呈現多源頭性。

大量資料顯示參與調節(jié)創(chuàng)面愈合過程因素有很多，其中多肽生長因子是最主要的因素之一，能夠參與創(chuàng)面細胞增殖、趨化等過程，并能夠促進細胞外基質的增生〔4〕。與燒傷創(chuàng)面有關生長因子較多，包括EGF、TGF、IGF等，臨床研究發(fā)現燒傷創(chuàng)面、慢性潰瘍面采用EGF能夠顯著縮短創(chuàng)面愈合時間。EGF是膠質細胞化學趨化因子，能夠有效促進皮膚和黏膜創(chuàng)面組織修復過程，促進皮膚和黏膜創(chuàng)面組織的修復，加速膠質細胞遷移和增殖，并能夠誘導α2β1整合素表達。整合素類型較多，能夠介導細胞與ECM的黏附，調控細胞增殖，因此是影響傷口收縮重要因子。在以往研究中發(fā)現整合素能夠與生長因子相互協調參與創(chuàng)面的修復過程〔5〕。有研究指出，整合素能夠增強EGF的作用，其中β1整合素是比較具有代表性的因子，高表達時能夠促進細胞增殖活化，因此，β1整合素常作為表皮干細胞重要影響因子之一〔6〕。本組研究說明荷負電氣溶膠治療能夠參與促進EGF的表達，加快細胞增殖，采用荷負電氣溶膠治療還能夠促進創(chuàng)面殘留表皮細胞與生長因子結合，誘導干細胞增殖，微環(huán)境的變化觸發(fā)跨膜信號的傳導，調節(jié)細胞基因表達，產生促修復效應。

大鼠燒傷創(chuàng)面實施荷負電氣溶膠治療能夠促進表皮干細胞的增殖，EGF、β1整合素表達上升可能是其作用機制；關于荷負電氣溶膠刺激表皮細胞的逆向分化還需要進一步分析。

1李仙松,杜 娟,宋振嵐,等.大鼠骨髓間充質干細胞重建表皮細胞及皮膚附件〔J〕.中國組織工程研究,2014；(6):853-9.

2廖鏘云,吳曉健,容詠新,等.濕性療法對創(chuàng)面表皮干細胞影響的研究〔J〕.中國現代醫(yī)生,2013;51(30):29-30.

3梁 玲,李新平,白文芳,等.低頻電磁場在基因修飾表皮干細胞移植修復創(chuàng)面中的作用〔J〕.中國組織工程研究,2013；(32):5827-33.

4王艷波,王思農.表皮干細胞在燒傷創(chuàng)面修復中的作用研究進展〔J〕.社區(qū)醫(yī)學雜志,2014;12(20):58-60.

5吳麗萍,謝肖霞,梁運轉,等.荷負電氣溶膠對糖尿病慢性創(chuàng)面愈合的效果觀察〔J〕.中華損傷與修復雜志(電子版),2010;5(2):224-6.

6王 淞.生物電對表皮干細胞促進創(chuàng)面愈合作用的影響〔D〕.重慶：第三軍醫(yī)大學,2015.

〔2016-05-17修回〕

(編輯 徐 杰)

R644

A

1005-9202(2017)21-5253-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.016

國家衛(wèi)生計生委醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心“重大疾病防治科技行動計劃-創(chuàng)傷修復專項”課題(ZX-01-C2016021)；2014年廣州市花都區(qū)科技計劃項目(HD14CXY001);2014年暨南大學第一臨床醫(yī)學院護理科研專項基金立項項目(2014305)

1 暨南大學附屬第一醫(yī)院神經外科 2 天門市第一人民醫(yī)院外科

佘文莉(1972-) ，女，主管護師，主要從事燒傷整形外科及慢性創(chuàng)面方面研究。