鐘芳芳 吳承龍 孫新芳 章燕幸

(紹興市人民醫(yī)院 浙江大學(xué)紹興醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 紹興 312000)

補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合依達(dá)拉奉對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的影響

鐘芳芳 吳承龍 孫新芳 章燕幸

(紹興市人民醫(yī)院 浙江大學(xué)紹興醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 紹興 312000)

目的研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合依達(dá)拉奉對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)的影響。方法50 只小鼠隨機(jī)分假手術(shù)組，模型組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯(BYHWD)組，依達(dá)拉奉(ED)組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯+依達(dá)拉奉(BYHWD+ED)組，每組再隨機(jī)分成缺血再灌注后1、7 d組。首先制備小鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型，TUNEL法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，應(yīng)用免疫組化方法觀察各組大腦皮質(zhì)Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果與模型組比較，BYHWD組、ED組及BYHWD+ED組均能明顯降低腦組織凋亡指數(shù)(Plt;0.01)，升高Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)，降低Bax、Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)(Plt;0.01)，兩藥聯(lián)用變化趨勢(shì)更明顯。結(jié)論補(bǔ)陽(yáng)還五湯與依達(dá)拉奉聯(lián)用能降低腦缺血再灌注損傷模型鼠腦組織細(xì)胞凋亡基因Bax、Caspase-3的表達(dá)，增加具有神經(jīng)元保護(hù)作用的Bcl-2基因表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加速神經(jīng)功能的恢復(fù)，協(xié)同發(fā)揮腦保護(hù)作用。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯；依達(dá)拉奉；腦缺血再灌注；細(xì)胞凋亡；Caspase-3；Bcl-2/Bax

缺血性腦血管病的發(fā)病是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多反應(yīng)的結(jié)果，減輕腦缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元凋亡則是治療的關(guān)鍵〔1〕。本研究采用有益氣活血通絡(luò)之功的補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合抗氧自由基的神經(jīng)保護(hù)劑依達(dá)拉奉作用于小鼠腦缺血再灌注損傷模型來(lái)探討兩藥聯(lián)用對(duì)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Caspase-3、Bcl-2和Bax凋亡蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1主要藥品、試劑及儀器 依達(dá)拉奉注射液(南京先聲東元制藥有限公司)；補(bǔ)陽(yáng)還五湯(紹興市人民醫(yī)院制劑室提供，由黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，川芎3 g，地龍3 g，赤芍5 g，紅花3 g和桃仁3 g組成，水煎、濃縮后生藥含量為2.0 g/ml)。氯化三苯基四氮唑(TTC,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)。TUNEL凋亡試劑盒(瑞士Roche公司，批號(hào)11684817910)；免疫組化染色試劑盒：Bcl-2(批號(hào)20070223)，Bax(批號(hào)20070223)，Caspase-3(批號(hào)20070227)，均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。二氨基聯(lián)苯胺(DAB，購(gòu)自北京中山試劑公司)。CM1850 冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica)；光學(xué)顯微鏡、光學(xué)顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.2動(dòng)物分組及給藥 選擇8月齡C57BL/6雄性小鼠50只，體重45～50 g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：scxk(滬)2008-0016。實(shí)驗(yàn)前先飼養(yǎng)觀察3 d，隨機(jī)分成假手術(shù)組(分離不插栓塞線)，模型組(缺血90 min)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組(BYHWD組)，依達(dá)拉奉組(ED組)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯+依達(dá)拉奉組(BYHWD+ED組)，每組10 只。術(shù)后1、7 d每組隨機(jī)取5只。BYHWD組于術(shù)后2 h起首次灌服補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥液，按10 ml/kg給藥；ED組于術(shù)后2 h尾靜脈注射，按3 mg/kg給藥；BYHWD+ED組，于術(shù)后2 h分別予等劑量BYHWD灌胃和ED尾靜脈注射給藥；模型組和假手術(shù)組動(dòng)物均給予等量生理鹽水灌胃及尾靜脈注射給藥；首次給藥以后1次/d，連續(xù)7 d。

1.3小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型制作 參照改良的Longa-Zea線栓法〔1〕制作小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型。缺血90 min后，拔出線栓再灌注。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并離斷右頸外動(dòng)脈，不予栓塞。術(shù)后2 h根據(jù)神經(jīng)功能評(píng)分驗(yàn)證造模成功。觀察造模動(dòng)物出現(xiàn)右側(cè)Horner征和左側(cè)以上肢為重的偏癱作為動(dòng)物模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn)，不符合標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物予以剔除，并隨機(jī)補(bǔ)充。小鼠在腦缺血再灌注1、7 d后經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉(600 mg/kg)，迅速打開(kāi)胸腔，暴露心臟，剪開(kāi)右心房，于心尖部剪開(kāi)左心室，插管至主動(dòng)脈，快速注入150 ml甲醛灌注固定，斷頭取腦，沿視交叉后緣做冠狀切片，常規(guī)石蠟包埋，做5 μm連續(xù)切片用于凋亡與免疫組化檢測(cè)。

1.4TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。①切片常規(guī)脫蠟至水，滴加蛋白酶K室溫消化20 min；②微波修復(fù)抗原5 min后自然冷卻；③滴加TUNEL反應(yīng)液，37℃孵育1 h；④滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗熒光素抗體工作液，37℃孵育30 min；⑤用DAB顯色劑呈色；⑥常規(guī)脫水、透明、封片。在光鏡下觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5免疫組化檢測(cè) 切片常規(guī)脫蠟至水，滴加3%H2O2孵育10 min；微波修復(fù)抗原10 min自然冷卻至室溫；滴加10%正常山羊血清，室溫封閉30 min；分別滴加兔抗Bcl-2、兔抗Bax 及兔抗Caspase-3抗血清，4℃孵育24 h；滴加二抗工作液(山羊抗兔)室溫反應(yīng)15 min；滴加辣根酶標(biāo)記卵白素工作液，室溫反應(yīng)15 min；DAB顯色劑呈色；梯度脫水、中型樹(shù)脂封片。在光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。計(jì)算陽(yáng)性染色神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目。在光鏡下，每只小鼠各取兩張切片，在梗死灶周邊區(qū)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，分別分析Bcl-2、Bax、Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及神經(jīng)細(xì)胞AI，取平均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)細(xì)胞AI比較 腦缺血再灌注1、7 d后，模型組和各用藥組神經(jīng)細(xì)胞AI均較假手術(shù)組明顯升高(Plt;0.01)；且與缺血再灌注1 d相比，7 d時(shí)模型組和各用藥組神經(jīng)細(xì)胞AI明顯降低(Plt;0.01)。與同時(shí)段模型組比較，各用藥組神經(jīng)細(xì)胞AI顯著降低(Plt;0.05)；其中以BYHWD+ED組降低趨勢(shì)最明顯，但ED組和BYHWD組無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)細(xì)胞AI比較

與假手術(shù)組比較：1)Plt;0.01；與模型組比較：2)Plt;0.01；與ED或BYHWD組比較：3)Plt;0.05；與同組內(nèi)1 d比較：4)Plt;0.01，下表同

2.2各組Bcl-2、Bax表達(dá)及Bcl-2/Bax比較 腦缺血再灌注后，模型組腦組織Bcl-2、Bax表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高(Plt;0.01)。與缺血再灌注1 d相比，7 d時(shí)模型組和各用藥組腦組織Bcl-2、Bax基因表達(dá)明顯減少(Plt;0.01)。在同一時(shí)間點(diǎn)各用藥組與模型組比較：腦組織Bcl-2基因表達(dá)均明顯增加(Plt;0.01)，而B(niǎo)ax基因表達(dá)有下降，以7 d時(shí)明顯(Plt;0.05)；且BYHWD+ED組改變趨勢(shì)最明顯(Plt;0.05)，BYHWD組和ED組之間則無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)，各用藥組較模型組Bcl-2/Bax有所增高，其中以BYHWD+ED組比值增高最明顯(Plt;0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比較

2.3各組Caspase-3表達(dá)比較 腦缺血再灌注后，模型組及各用藥組神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3表達(dá)較假手術(shù)組明顯增高(Plt;0.01)。與缺血再灌注1 d相比，7 d時(shí)模型組與各用藥組神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低(Plt;0.01)。與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，各用藥組神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低(Plt;0.05)，以BYHWD+ED組為著(Plt;0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元Caspase-3的表達(dá)

3 討 論

腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷主要包括壞死和凋亡。缺血中心區(qū)細(xì)胞迅速壞死，而周邊缺血半暗帶區(qū)，則發(fā)生以凋亡為主的遲發(fā)性死亡〔2〕。因此，搶救半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，減少細(xì)胞凋亡發(fā)生能減輕腦缺血再灌注損傷的程度和范圍〔3〕。但細(xì)胞凋亡的發(fā)生受復(fù)雜的多基因、多系統(tǒng)調(diào)控。線粒體凋亡主要通過(guò)Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)，而B(niǎo)cl-2和Bax是Bcl-2家族參與細(xì)胞凋亡調(diào)控最具代表性的基因〔4〕。前者抑制細(xì)胞凋亡，后者促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2與Bax蛋白可相互結(jié)合形成結(jié)合體，過(guò)度表達(dá)Bax蛋白可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制Bcl-2的抗凋亡作用。Bcl-2/Bax的比值變化則決定細(xì)胞的凋亡與生存，比值越高，細(xì)胞存活率越高；比值越低，細(xì)胞凋亡率越高〔5，6〕。此外，Caspase-3是細(xì)胞凋亡的敏感指標(biāo)，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)最關(guān)鍵的執(zhí)行者，在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐作用〔7〕，阻抑Caspase-3表達(dá)對(duì)阻止腦損傷的進(jìn)一步惡化和改善神經(jīng)功能具有重要意義。補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有益氣活血通絡(luò)之功，通過(guò)多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔8，9〕。依達(dá)拉奉具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，可抑制神經(jīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)氧化及遲發(fā)性死亡，減輕腦水腫及組織損傷，并可促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的產(chǎn)生〔10，11〕。本研究提示腦缺血再灌注損傷可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生，隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡呈減輕趨勢(shì)；BYHWD和ED對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡具有抑制作用，以兩者聯(lián)用的效果尤為顯著。本實(shí)驗(yàn)表明BYHWD和ED可通過(guò)促進(jìn)重要的凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，抑制凋亡誘導(dǎo)基因Bax及Caspase-3的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加速神經(jīng)功能的恢復(fù)，協(xié)同發(fā)揮腦保護(hù)作用。

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〔2016-10-08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

R34

A

1005-9202(2017)21-5251-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.015

紹興市公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013B70076)

鐘芳芳(1977-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。