齊 晅 孫 超 田 玉 高麗霞 丁 萌 郭惠芳

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊 050000)

顆粒蛋白前體在原發(fā)性干燥綜合征模型小鼠頜下腺中的表達(dá)

齊 晅 孫 超 田 玉 高麗霞 丁 萌 郭惠芳

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊 050000)

目的探討顆粒蛋白前體在小鼠頜下腺中的表達(dá)及其對(duì)頜下腺組織形態(tài)的影響。方法從BALb/c小鼠的頜下腺中提取出免疫抗原組分，并與弗氏完全佐劑乳化制得抗原用于復(fù)制干燥綜合征小鼠模型。以空白對(duì)照組作為對(duì)照。在第0，3，7，10，14天記錄兩組的體重及攝食量。BALb/c小鼠造模14 d后，取血后處死小鼠，立即取模型組及對(duì)照組小鼠的頜下腺稱取重量，與體重對(duì)比計(jì)算頜下腺指數(shù)；取各組小鼠頜下腺采用HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)；眼眶取血檢測(cè)血清中顆粒蛋白前體(PGRN)的含量，并用實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白印跡法檢測(cè)PGRN在頜下腺中的基因及蛋白表達(dá)。結(jié)果兩組小鼠在0 d即實(shí)驗(yàn)前體重及攝食量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。造模后第7、10、14天，兩組體重及攝食量比較，模型組均降低(Plt;0.05)，且第10天攝食量有顯著差異(Plt;0.01)。模型組頜下腺指數(shù)明顯比對(duì)照組下降(Plt;0.01)；從HE染色圖片可以觀察到頜下腺出現(xiàn)如腺體萎縮、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及毛細(xì)血管擴(kuò)張等病理改變。血清中的PGRN含量明顯升高，頜下腺中PGRN mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高。結(jié)論P(yáng)GRN的高表達(dá)可能是原發(fā)性干燥綜合征模型小鼠分泌腺發(fā)生病理改變的原因之一。

顆粒蛋白前體；原發(fā)性干燥綜合征

原發(fā)性干燥綜合征(pSS)主要患者群體為中老年人，每年發(fā)病率雖然不高但有逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，主要影響女性〔1〕。pSS主要侵犯淚腺、唾液腺，臨床上可見口干、眼睛干澀等癥狀，嚴(yán)重者可引起多器官損傷，甚至危及生命。pSS主要由于遺傳因素、自身免疫功能異常、激素水平異常或者由于病毒感染等因素引起〔2，3〕。目前臨床上多采用替代治療，但這些類似的對(duì)癥療法只能起到暫時(shí)緩解癥狀的作用，且常引起額外的不良反應(yīng)，增加患者負(fù)擔(dān)。對(duì)pSS病理機(jī)制的研究有助于尋找新的針對(duì)性藥物，輔助臨床診斷及治療。2006年首次發(fā)現(xiàn)顆粒蛋白前體(PGRN)參與疾病的進(jìn)展，目前有研究指出PGRN大量表達(dá)于淋巴細(xì)胞、免疫細(xì)胞等〔4〕，并參與機(jī)體生命活動(dòng)中的多種生理病理過程。pSS的發(fā)生、發(fā)展與免疫系統(tǒng)功能異常有關(guān)，本研究擬探討PGRN在pSS發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用8周齡雌性SPF級(jí)BALb/c小鼠共50只，體重18～22 g，從河北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得，許可證號(hào)：SYXK(冀)2012-0022。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在SPF 實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，BALb/c小鼠自由攝食飲水，所處實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度20℃～26℃、相對(duì)濕度45%～70%，每天進(jìn)行12 h的光照與黑暗更替。其余飼養(yǎng)條件均符合我國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010。

1.2試劑與儀器 弗氏完全佐劑(CFA)，上海源葉生物；蘇木素染色劑、伊紅染色液，碧云天；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PGRN primary antibody購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；二抗，聚偏氟乙烯(PVDF)膜等購(gòu)自美國(guó)millipore公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑與逆轉(zhuǎn)錄試劑cDNA試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；蛋白提取試劑盒，Santa Cruz公司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自GE Healthcare公司。核酸蛋白分析儀，美國(guó)Bio-Rad公司 ；CPA225D電子天平與Sartorius 3-18K低溫高速離心機(jī)為德國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品；RM2135切片機(jī)為德國(guó)萊卡公司產(chǎn)品。

1.3pSS模型復(fù)制〔9〕選取10只BALb/c小鼠，取出頜下腺，清除頜下腺周圍淋巴結(jié)及結(jié)締組織等多余組織后，加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行勻漿。然后將勻漿液從1 000 r/min到100 000 r/min以差速離心法采用低溫離心機(jī)進(jìn)行離心，將最后得到的離心液分離，得到的組分保存?zhèn)溆糜诶^續(xù)制備免疫抗原試劑。往離心得到的最后的蛋白組分中加入弗氏完全佐劑(CFA)，乳化后調(diào)整濃度使其最終為0.75 mg/ml。隨機(jī)選取20只BALb/c小鼠，在小鼠后腳掌至腹股溝的位置皮下注射含卡介苗(BCG)3 mg/ml的最終抗原液，每只注射0.1 ml。第7天進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次。

1.4動(dòng)物分組 BALb/c小鼠分為模型組及對(duì)照組。20只模型組小鼠按上述方法造模，另20只對(duì)照組小鼠在同樣位置注射等量生理鹽水。兩組采用相同方法常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1體重及攝食量的動(dòng)態(tài)檢測(cè) 造模前(記為第0天)，造模后第3，7，10，14天記錄兩組小鼠的攝食量及體重并進(jìn)行對(duì)比。

1.5.2頜下腺指數(shù) 造模2 w后，最后一次稱取BALb/c小鼠體重后按順序進(jìn)行記錄。所有BALb/c小鼠取同側(cè)的頜下腺，稱取腺體重量并進(jìn)行對(duì)應(yīng)記錄。計(jì)算各組小鼠頜下腺指數(shù)：頜下腺重量(mg)/體重(g)×100%。

1.5.3HE染色觀察頜下腺的組織形態(tài)學(xué)變化 小鼠腹腔注射麻醉后，取出頜下腺放置于固定液(4%多聚甲醛溶液)中固定4 h，石蠟包埋后用萊卡切片機(jī)進(jìn)行切片，梯度脫蠟，然后采用蘇木素-伊紅試液染色；梯度脫水后采用二甲苯進(jìn)行透明，最后以中性樹脂進(jìn)行封片處理。采用光學(xué)顯微鏡觀察各組BALb/c小鼠頜下腺的組織形態(tài)變化。

1.5.4血清PGRN體含量檢測(cè) 模型組與對(duì)照組小鼠從眼眶靜脈叢取血1 ml，靜置1.5 h后3 000 r/min離心，分離得到血清，冰上放置，立即進(jìn)行檢測(cè)，按照PGRN ELISA試劑盒說明書測(cè)定各組小鼠血清中PGRN的含量。

1.5.5PGRN mRNA表達(dá)檢測(cè) 造模2 w后，每組取10只小鼠，滅菌手術(shù)器材取出小鼠頜下腺，清除淋巴結(jié)及結(jié)締組織，滅菌PBS沖洗后在潔凈操作臺(tái)上采用電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，然后在勻漿液中加入Trizol 裂解細(xì)胞，總 mRNA采用RNA 提取試劑盒進(jìn)行分離提取純化。然后取2 μl總RNA按說明書于核酸蛋白檢測(cè)儀上測(cè)定OD值，符合要求后(260/280在1.8～2.0)采用cDNA 合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 cDNA，RT-PCR測(cè)定PGRN mRNA 的表達(dá)水平。RT-PCR引物序列委托上海生工進(jìn)行設(shè)計(jì)并合成：GAPDH：前向:5′-CCACTCTCCACCTTTGAC-3′， 反向:5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′，PGRN：前向:5′-ACATGTACGGTCGAGACT-3′，反向:5′-CATTCCCGTTGGCTGTCT-3′。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序：95℃,10 min；變性95℃ 15 s,退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.5.6血清PGRN蛋白表達(dá)測(cè)定 造模2 w后，每組取10只小鼠，滅菌手術(shù)器材取出小鼠頜下腺，清除腺體周圍的淋巴結(jié)及結(jié)締組織，低溫PBS洗滌2次，按BCA蛋白提取試劑盒說明書，頜下腺加入組織裂解緩沖液勻漿,然后按操作進(jìn)行總蛋白的分離提取?？偟鞍诐舛葴y(cè)定符合要求后，蛋白上樣，于SDS-PAGE 膠上，濃縮膠中以80 V電壓電泳30 min，然后分離膠中改為100 V至條帶跑到底部的條件進(jìn)行電泳分離，完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。PVDF膜用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，PGRN Ⅰ抗用脫脂牛奶以1∶1 000稀釋后與PVDF膜在搖床上結(jié)合1.5 h(室溫下)，PBS洗膜3次，Ⅱ抗用脫脂牛奶以1∶2 000稀釋后與PVDF膜搖床上結(jié)合 1～1.5 h(室溫下),PBS洗膜3次，采用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒按照說明書進(jìn)行操作，在化學(xué)熒光發(fā)光儀上進(jìn)行曝光顯像。計(jì)算分析目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組小鼠體重的動(dòng)態(tài)變化 在造模前，兩組小鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。造模后第3天兩組小鼠體重未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；第7、10、14天，模型組小鼠體重與對(duì)照組對(duì)比明顯降低(Plt;0.05)。見表1。

2.2兩組小鼠攝食量的變化 實(shí)驗(yàn)前兩組小鼠攝食量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第7、10、14天，模型組小鼠攝食量明顯降低(Plt;0.05，Plt;0.01)。見表1。

表1 兩組小鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)體重及攝食量對(duì)比

與對(duì)照組比較：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01

2.3兩組小鼠頜下腺指數(shù)的變化 造模2 w后，模型組頜下腺指數(shù)(0.056±0.044)明顯低于對(duì)照組(0.143±0.021)(Plt;0.01)。

2.4兩組小鼠組織形態(tài)學(xué)的變化 對(duì)照組頜下腺組織形態(tài)學(xué)未觀察到病理改變。而模型組可見頜下腺腺體出現(xiàn)顯著萎縮，細(xì)胞間隙增大，可見淋巴細(xì)胞并出現(xiàn)浸潤(rùn)現(xiàn)象，腺泡形狀大小不均勻，并且可以觀察到毛細(xì)血管擴(kuò)張，偶見出血現(xiàn)象。

圖1 頜下腺的組織形態(tài)學(xué)HE染色結(jié)果(×40)

2.5兩組小鼠血清PGRN含量變化 造模14 d后，模型組小鼠血清PGRN含量(10.43±2.21)明顯高于對(duì)照組(7.56±2.34)(Plt;0.05)。

2.6兩組血清頜下腺PGRN表達(dá)的變化 造模14 d后，模型組小鼠頜下腺PGRN mRNA表達(dá)(0.886±0.032)與蛋白(0.328±0.331)表達(dá)明顯高于對(duì)照組(0.303±0.051，0.107±0.27；Plt;0.05)。見圖2。

圖2 兩組頜下腺PGRN蛋白表達(dá)

3 討 論

pSS的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型可分為自發(fā)性和誘導(dǎo)性。誘導(dǎo)型pSS動(dòng)物模型可通過在動(dòng)物體內(nèi)種植病毒、注射免疫佐劑與組織勻漿液或采用抗原誘導(dǎo)等方式，誘導(dǎo)動(dòng)物發(fā)生免疫性唾液腺炎。本研究從同源小鼠身上獲取頜下腺，提取出抗原組分，與弗氏完全佐劑結(jié)合形成免疫抗原用以誘導(dǎo)小鼠形成pSS模型〔5，6〕。

pSS發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，可能是B淋巴細(xì)胞高度活化引起高球蛋白血癥以及過度分泌自身抗體所致。來自腫瘤壞死因子(TNF)家族的B細(xì)胞活化因子的刺激是B細(xì)胞增殖的其中一個(gè)原因。研究者發(fā)現(xiàn)TNF-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、γ-干擾素(IFN)-γ等因子高表達(dá)于pSS患者唇腺上皮細(xì)胞中，可見這些細(xì)胞因子與pSS的發(fā)生密切相關(guān)〔7～9〕。 PGRN是一類由GRN基因編碼所得的內(nèi)分泌因子，具有多種生物學(xué)功能。PGRN是TNF受體(TNFR)的配體，與TNFR結(jié)合后對(duì)TNF-α的炎癥介導(dǎo)作用有一定的對(duì)抗，該效應(yīng)有利于促進(jìn)組織修復(fù)及細(xì)胞增殖，并參與炎癥反應(yīng)過程。TNF-α/TNFR的平衡在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。PGRN在神經(jīng)元、增殖活躍的上皮細(xì)胞〔2〕、淋巴細(xì)胞以及免疫細(xì)胞中大量表達(dá)。目前已有較多研究報(bào)道PGRN參與了機(jī)體生命活動(dòng)中的多種生理、病理過程，并在其中一些功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如初期的胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷后的愈合和組織重新構(gòu)建、免疫系統(tǒng)相關(guān)的炎癥反應(yīng)過程以及免疫反應(yīng)等過程均發(fā)現(xiàn)有PGRN及其相關(guān)的信號(hào)通路參與〔2～4〕。pSS是一種自身免疫系統(tǒng)異常的疾病，本研究結(jié)果提示，PGRN含量升高可能是導(dǎo)致頜下腺組織病變的因素之一，可見PGRN與pSS模型小鼠的病理過程密切相關(guān)。

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5趙紅玉.增液湯對(duì)干燥綜合征模型小鼠頜下腺水通道蛋白的調(diào)控機(jī)制研究〔D〕.北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

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〔2017-01-15修回〕

(編輯 徐 杰)

R442.8

A

1005-9202(2017)21-5247-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.013

河北省衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題(ZL20140263)

郭惠芳(1967-)，女，主任醫(yī)師，博士，主要從事干燥綜合征免疫機(jī)制的研究

齊 晅(1982-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事干燥綜合征的發(fā)病機(jī)制及其診斷治療研究。