齊 晅 孫 超 田 玉 高麗霞 丁 萌 郭惠芳

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊 050000)

顆粒蛋白前體在原發(fā)性干燥綜合征模型小鼠頜下腺中的表達

齊 晅 孫 超 田 玉 高麗霞 丁 萌 郭惠芳

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊 050000)

目的探討顆粒蛋白前體在小鼠頜下腺中的表達及其對頜下腺組織形態(tài)的影響。方法從BALb/c小鼠的頜下腺中提取出免疫抗原組分，并與弗氏完全佐劑乳化制得抗原用于復(fù)制干燥綜合征小鼠模型。以空白對照組作為對照。在第0，3，7，10，14天記錄兩組的體重及攝食量。BALb/c小鼠造模14 d后，取血后處死小鼠，立即取模型組及對照組小鼠的頜下腺稱取重量，與體重對比計算頜下腺指數(shù)；取各組小鼠頜下腺采用HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)；眼眶取血檢測血清中顆粒蛋白前體(PGRN)的含量，并用實時定量PCR及蛋白印跡法檢測PGRN在頜下腺中的基因及蛋白表達。結(jié)果兩組小鼠在0 d即實驗前體重及攝食量無統(tǒng)計學(xué)差異。造模后第7、10、14天，兩組體重及攝食量比較，模型組均降低(Plt;0.05)，且第10天攝食量有顯著差異(Plt;0.01)。模型組頜下腺指數(shù)明顯比對照組下降(Plt;0.01)；從HE染色圖片可以觀察到頜下腺出現(xiàn)如腺體萎縮、淋巴細胞浸潤及毛細血管擴張等病理改變。血清中的PGRN含量明顯升高，頜下腺中PGRN mRNA及蛋白表達水平明顯升高。結(jié)論PGRN的高表達可能是原發(fā)性干燥綜合征模型小鼠分泌腺發(fā)生病理改變的原因之一。

顆粒蛋白前體；原發(fā)性干燥綜合征

原發(fā)性干燥綜合征(pSS)主要患者群體為中老年人，每年發(fā)病率雖然不高但有逐年增長的趨勢，主要影響女性〔1〕。pSS主要侵犯淚腺、唾液腺，臨床上可見口干、眼睛干澀等癥狀，嚴重者可引起多器官損傷，甚至危及生命。pSS主要由于遺傳因素、自身免疫功能異常、激素水平異?；蛘哂捎诓《靖腥镜纫蛩匾稹?，3〕。目前臨床上多采用替代治療，但這些類似的對癥療法只能起到暫時緩解癥狀的作用，且常引起額外的不良反應(yīng)，增加患者負擔(dān)。對pSS病理機制的研究有助于尋找新的針對性藥物，輔助臨床診斷及治療。2006年首次發(fā)現(xiàn)顆粒蛋白前體(PGRN)參與疾病的進展，目前有研究指出PGRN大量表達于淋巴細胞、免疫細胞等〔4〕，并參與機體生命活動中的多種生理病理過程。pSS的發(fā)生、發(fā)展與免疫系統(tǒng)功能異常有關(guān)，本研究擬探討PGRN在pSS發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用8周齡雌性SPF級BALb/c小鼠共50只，體重18～22 g，從河北省醫(yī)學(xué)實驗動物中心購得，許可證號：SYXK(冀)2012-0022。實驗動物在SPF 實驗室飼養(yǎng)并進行實驗，BALb/c小鼠自由攝食飲水，所處實驗室內(nèi)溫度20℃～26℃、相對濕度45%～70%，每天進行12 h的光照與黑暗更替。其余飼養(yǎng)條件均符合我國動物實驗國家標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010。

1.2試劑與儀器 弗氏完全佐劑(CFA)，上海源葉生物；蘇木素染色劑、伊紅染色液，碧云天；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；PGRN primary antibody購自美國Abcam公司；二抗，聚偏氟乙烯(PVDF)膜等購自美國millipore公司；實時熒光定量PCR試劑與逆轉(zhuǎn)錄試劑cDNA試劑盒購自Fermentas公司；蛋白提取試劑盒，Santa Cruz公司；ECL發(fā)光試劑盒購自GE Healthcare公司。核酸蛋白分析儀，美國Bio-Rad公司 ；CPA225D電子天平與Sartorius 3-18K低溫高速離心機為德國SIGMA公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品；RM2135切片機為德國萊卡公司產(chǎn)品。

1.3pSS模型復(fù)制〔9〕選取10只BALb/c小鼠，取出頜下腺，清除頜下腺周圍淋巴結(jié)及結(jié)締組織等多余組織后，加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS)進行勻漿。然后將勻漿液從1 000 r/min到100 000 r/min以差速離心法采用低溫離心機進行離心，將最后得到的離心液分離，得到的組分保存?zhèn)溆糜诶^續(xù)制備免疫抗原試劑。往離心得到的最后的蛋白組分中加入弗氏完全佐劑(CFA)，乳化后調(diào)整濃度使其最終為0.75 mg/ml。隨機選取20只BALb/c小鼠，在小鼠后腳掌至腹股溝的位置皮下注射含卡介苗(BCG)3 mg/ml的最終抗原液，每只注射0.1 ml。第7天進行加強免疫一次。

1.4動物分組 BALb/c小鼠分為模型組及對照組。20只模型組小鼠按上述方法造模，另20只對照組小鼠在同樣位置注射等量生理鹽水。兩組采用相同方法常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5指標(biāo)檢測

1.5.1體重及攝食量的動態(tài)檢測 造模前(記為第0天)，造模后第3，7，10，14天記錄兩組小鼠的攝食量及體重并進行對比。

1.5.2頜下腺指數(shù) 造模2 w后，最后一次稱取BALb/c小鼠體重后按順序進行記錄。所有BALb/c小鼠取同側(cè)的頜下腺，稱取腺體重量并進行對應(yīng)記錄。計算各組小鼠頜下腺指數(shù)：頜下腺重量(mg)/體重(g)×100%。

1.5.3HE染色觀察頜下腺的組織形態(tài)學(xué)變化 小鼠腹腔注射麻醉后，取出頜下腺放置于固定液(4%多聚甲醛溶液)中固定4 h，石蠟包埋后用萊卡切片機進行切片，梯度脫蠟，然后采用蘇木素-伊紅試液染色；梯度脫水后采用二甲苯進行透明，最后以中性樹脂進行封片處理。采用光學(xué)顯微鏡觀察各組BALb/c小鼠頜下腺的組織形態(tài)變化。

1.5.4血清PGRN體含量檢測 模型組與對照組小鼠從眼眶靜脈叢取血1 ml，靜置1.5 h后3 000 r/min離心，分離得到血清，冰上放置，立即進行檢測，按照PGRN ELISA試劑盒說明書測定各組小鼠血清中PGRN的含量。

1.5.5PGRN mRNA表達檢測 造模2 w后，每組取10只小鼠，滅菌手術(shù)器材取出小鼠頜下腺，清除淋巴結(jié)及結(jié)締組織，滅菌PBS沖洗后在潔凈操作臺上采用電動勻漿機勻漿，然后在勻漿液中加入Trizol 裂解細胞，總 mRNA采用RNA 提取試劑盒進行分離提取純化。然后取2 μl總RNA按說明書于核酸蛋白檢測儀上測定OD值，符合要求后(260/280在1.8～2.0)采用cDNA 合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 cDNA，RT-PCR測定PGRN mRNA 的表達水平。RT-PCR引物序列委托上海生工進行設(shè)計并合成：GAPDH：前向:5′-CCACTCTCCACCTTTGAC-3′， 反向:5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′，PGRN：前向:5′-ACATGTACGGTCGAGACT-3′，反向:5′-CATTCCCGTTGGCTGTCT-3′。PCR擴增的反應(yīng)程序：95℃,10 min；變性95℃ 15 s,退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共40個循環(huán)。

1.5.6血清PGRN蛋白表達測定 造模2 w后，每組取10只小鼠，滅菌手術(shù)器材取出小鼠頜下腺，清除腺體周圍的淋巴結(jié)及結(jié)締組織，低溫PBS洗滌2次，按BCA蛋白提取試劑盒說明書，頜下腺加入組織裂解緩沖液勻漿,然后按操作進行總蛋白的分離提取。總蛋白濃度測定符合要求后，蛋白上樣，于SDS-PAGE 膠上，濃縮膠中以80 V電壓電泳30 min，然后分離膠中改為100 V至條帶跑到底部的條件進行電泳分離，完成后進行轉(zhuǎn)膜。PVDF膜用5%脫脂牛奶進行封閉，PGRN Ⅰ抗用脫脂牛奶以1∶1 000稀釋后與PVDF膜在搖床上結(jié)合1.5 h(室溫下)，PBS洗膜3次，Ⅱ抗用脫脂牛奶以1∶2 000稀釋后與PVDF膜搖床上結(jié)合 1～1.5 h(室溫下),PBS洗膜3次，采用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒按照說明書進行操作，在化學(xué)熒光發(fā)光儀上進行曝光顯像。計算分析目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進行ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組小鼠體重的動態(tài)變化 在造模前，兩組小鼠體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。造模后第3天兩組小鼠體重未見統(tǒng)計學(xué)差異；第7、10、14天，模型組小鼠體重與對照組對比明顯降低(Plt;0.05)。見表1。

2.2兩組小鼠攝食量的變化 實驗前兩組小鼠攝食量無統(tǒng)計學(xué)差異。第7、10、14天，模型組小鼠攝食量明顯降低(Plt;0.05，Plt;0.01)。見表1。

表1 兩組小鼠造模后各時間點體重及攝食量對比

與對照組比較：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01

2.3兩組小鼠頜下腺指數(shù)的變化 造模2 w后，模型組頜下腺指數(shù)(0.056±0.044)明顯低于對照組(0.143±0.021)(Plt;0.01)。

2.4兩組小鼠組織形態(tài)學(xué)的變化 對照組頜下腺組織形態(tài)學(xué)未觀察到病理改變。而模型組可見頜下腺腺體出現(xiàn)顯著萎縮，細胞間隙增大，可見淋巴細胞并出現(xiàn)浸潤現(xiàn)象，腺泡形狀大小不均勻，并且可以觀察到毛細血管擴張，偶見出血現(xiàn)象。

圖1 頜下腺的組織形態(tài)學(xué)HE染色結(jié)果(×40)

2.5兩組小鼠血清PGRN含量變化 造模14 d后，模型組小鼠血清PGRN含量(10.43±2.21)明顯高于對照組(7.56±2.34)(Plt;0.05)。

2.6兩組血清頜下腺PGRN表達的變化 造模14 d后，模型組小鼠頜下腺PGRN mRNA表達(0.886±0.032)與蛋白(0.328±0.331)表達明顯高于對照組(0.303±0.051，0.107±0.27；Plt;0.05)。見圖2。

圖2 兩組頜下腺PGRN蛋白表達

3 討 論

pSS的實驗動物模型可分為自發(fā)性和誘導(dǎo)性。誘導(dǎo)型pSS動物模型可通過在動物體內(nèi)種植病毒、注射免疫佐劑與組織勻漿液或采用抗原誘導(dǎo)等方式，誘導(dǎo)動物發(fā)生免疫性唾液腺炎。本研究從同源小鼠身上獲取頜下腺，提取出抗原組分，與弗氏完全佐劑結(jié)合形成免疫抗原用以誘導(dǎo)小鼠形成pSS模型〔5，6〕。

pSS發(fā)病機制比較復(fù)雜，可能是B淋巴細胞高度活化引起高球蛋白血癥以及過度分泌自身抗體所致。來自腫瘤壞死因子(TNF)家族的B細胞活化因子的刺激是B細胞增殖的其中一個原因。研究者發(fā)現(xiàn)TNF-α、白細胞介素(IL)-6、γ-干擾素(IFN)-γ等因子高表達于pSS患者唇腺上皮細胞中，可見這些細胞因子與pSS的發(fā)生密切相關(guān)〔7～9〕。 PGRN是一類由GRN基因編碼所得的內(nèi)分泌因子，具有多種生物學(xué)功能。PGRN是TNF受體(TNFR)的配體，與TNFR結(jié)合后對TNF-α的炎癥介導(dǎo)作用有一定的對抗，該效應(yīng)有利于促進組織修復(fù)及細胞增殖，并參與炎癥反應(yīng)過程。TNF-α/TNFR的平衡在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。PGRN在神經(jīng)元、增殖活躍的上皮細胞〔2〕、淋巴細胞以及免疫細胞中大量表達。目前已有較多研究報道PGRN參與了機體生命活動中的多種生理、病理過程，并在其中一些功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如初期的胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷后的愈合和組織重新構(gòu)建、免疫系統(tǒng)相關(guān)的炎癥反應(yīng)過程以及免疫反應(yīng)等過程均發(fā)現(xiàn)有PGRN及其相關(guān)的信號通路參與〔2～4〕。pSS是一種自身免疫系統(tǒng)異常的疾病，本研究結(jié)果提示，PGRN含量升高可能是導(dǎo)致頜下腺組織病變的因素之一，可見PGRN與pSS模型小鼠的病理過程密切相關(guān)。

1Patel R,Shahane A.The epidemiology of Sjogren′s syndrome〔J〕.Clin Epidemiol,2014;6(2):47-55.

2楊 麗,付 萍.干燥綜合征與病毒感染的關(guān)系研究進展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述,2010;16(11):1712-5.

3Marietta X,Gottenberg JE.Pathogenesis of Sjogren′s syndrome and therapeutic consequences〔J〕.Curr Opin Rheumatol,2010;22(5):471-7.

4Diaz-Cueto L,Arechavaleta-Velasco F,Diaz-Arizaga A,etal.PKC signaling is involved in the regulation of progranulin (acrogranin/PC-cell-derived growth factor/granulin-epithelin precursor)protein expression in human ovarian cancer cell lines〔J〕.Int J Gynecol Cancer,2012;22(6):945-50.

5趙紅玉.增液湯對干燥綜合征模型小鼠頜下腺水通道蛋白的調(diào)控機制研究〔D〕.北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

6鄧馮媛.通過免疫Ro60多肽的方法建立一種新的干燥綜合征小鼠模型〔D〕.廈門：廈門大學(xué)，2014.

7Sujin Kang，Toshio Tanaka,Tadamitsu Kishimoto.Therapeutic uses of anti-interleukin-6 receptor antibody〔J〕.Int Immunol,2015;27(1):21-9.

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9Dong Yang,Lin-Lin Wang,Tao-Tao Dong,etal.Progranulin promotes colorectal cancer proliferation and angiogenesis through TNFR2/Akt and ERK signaling pathways〔J〕.Am J Cancer Res,2015;5(10):3085-97.

〔2017-01-15修回〕

(編輯 徐 杰)

R442.8

A

1005-9202(2017)21-5247-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.013

河北省衛(wèi)生計生委醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題(ZL20140263)

郭惠芳(1967-)，女，主任醫(yī)師，博士，主要從事干燥綜合征免疫機制的研究

齊 晅(1982-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事干燥綜合征的發(fā)病機制及其診斷治療研究。