張春雪 王 燕 鄭曉巖 徐業(yè)秋 逄曙光

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

二甲雙胍對2型糖尿病大鼠膽固醇代謝途徑的影響

張春雪1王 燕1鄭曉巖1徐業(yè)秋1逄曙光1

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

目的探討二甲雙胍對2型糖尿病大鼠膽固醇代謝相關(guān)基因SREBP-2，HMGR，LDLR，CYPA7a1的影響及其作用機(jī)制。方法60只雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為正常對照組(CON)，2型糖尿病組(DM)，二甲雙胍治療糖尿病組(DM+MET)。CON組給予標(biāo)準(zhǔn)飲食，DM組及DM+MET組高脂飲食8 w給予小劑量STZ腹腔注射，建立2型糖尿病模型。造模成功后，DM+MET組給予二甲雙胍灌胃治療(500 mg·kg-1·d-1)。12 w后檢測各組大鼠FPG、FINS、TG 、TC、LDL-C、HDL-C、TBA等血清生化學(xué)指標(biāo)。HE染色觀察各組大鼠肝臟形態(tài)變化。熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測各組大鼠肝臟SREBP-2、HMGR、LDLR、CYP7a1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果DM組與CON組比較FPG、FINS、TG 、TC、LDL-C、TBAs表達(dá)升高(均Plt;0.05)。HE染色肝臟脂質(zhì)沉積，脂肪空泡明顯增多。CYP7a1 mRNA表達(dá)升高(Plt;0.05)，SREBP-2、HMGR、LDLR mRNA表達(dá)降低(均Plt;0.05)； DM+MET組與DM組比較FPG、FINS、TG 、TC、LDL-C、TBAs表達(dá)降低(均Plt;0.05)。HE染色肝臟脂肪空泡明顯減少。SREBP-2、HMGR、LDLR、CYP7a1 mRNA表達(dá)升高(Plt;0.001)。結(jié)論二甲雙胍使糖尿病大鼠肝臟組織SREBP-2 mRNA及下游基因HMGR、LDLR表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)膽固醇合成和吸收，另一方面，二甲雙胍可使CYP7a1 mRNA表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼?，加速膽固醇降解，二甲雙胍通過協(xié)調(diào)膽固醇的合成途徑和轉(zhuǎn)化途徑促進(jìn)膽固醇代謝，進(jìn)而降低2型糖尿病大鼠血漿膽固醇水平。

二甲雙胍；2型糖尿??；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2；膽固醇；膽汁酸

目前二甲雙胍作為治療2型糖尿病的一線藥，主要通過抑制肝臟糖異生減少肝葡萄糖輸出，增加外周組織對葡萄糖攝取，降低血糖。目前二甲雙胍降糖機(jī)制研究很多，而二甲雙胍降脂的機(jī)制尤其對膽固醇代謝的機(jī)制研究很少〔1，2〕。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)-2為堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈(bHLH-Zip)核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)膽固醇的合成和吸收發(fā)揮重要作用〔3〕。SREBPs家族共包括三個(gè)異構(gòu)體：SREBP-1a，SREBP-1c和SREBP-2，SREBP-1a可以調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇的合成，SREBP1-c以調(diào)節(jié)脂肪酸合成為主，SREBP-2主要調(diào)節(jié)膽固醇合成〔4〕。3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)是內(nèi)源性膽固醇合成的限速酶，低密度脂蛋白受體(LDLR)是外源性膽固醇攝取的重要途徑，促使血漿中65%～70%的LDL-C轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟細(xì)胞，降低血漿LDL-C的濃度〔5〕。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過激活A(yù)MPK途徑，抑制內(nèi)源性肝臟X受體(LXR)減少SREBP-1的表達(dá)，改善脂肪酸代謝，改善高脂血癥，減少動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)，而二甲雙胍對SREBP-2的表達(dá)影響還不清楚〔6〕。本文擬進(jìn)一步探討二甲雙胍對膽汁酸代謝的影響。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 鏈脲霉素(Streptozotocin，STZ)購買于Sigma (USA)公司；鹽酸二甲雙胍(格華止)購買于中美上海施貴寶制藥有限公司；血糖儀、試紙(羅氏，瑞士)；ELISA試劑盒購買于瑞典Mercoda 公司(Art.NO.10-1250-01)；Trizol，RNA抽提試劑，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和Real Time PCR反應(yīng)試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.1.2動(dòng)物 60只8周雄性Wistar 大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重180～220 g，室溫22℃±2℃，相對濕度為55%±5%，12 h光照維持，晝夜循環(huán)。大鼠毛發(fā)光滑，色澤正常，精神狀態(tài)好。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型 60只8周雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為三組：正常對照組(CON)、 2型糖尿病組(DM)、二甲雙胍治療糖尿病組(DM+MET)，每組20只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。CON組給予標(biāo)準(zhǔn)飲食(脂肪6%，碳水化合物64%，蛋白質(zhì)23%)，DM和DM+MET組給予高脂飲食(脂肪25%，碳水化合物48%，蛋白質(zhì)20%)8 w給予小劑量STZ(30～35 mg/kg，Sigma)腹腔注射，CON組給予等體積生理鹽水腹腔注射，禁食12 h。檢測大鼠空腹血漿葡萄糖(FPG)濃度，連續(xù)3次FPGgt; 11.1 mmol/L認(rèn)為成功建立糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠模型建立后DM+MET組二甲雙胍灌胃(500 mg·kg-1·d-1)12 w，DM組給予等體積生理鹽水腹腔注射。每周檢測各組大鼠體重，飲食，飲水，血漿葡萄糖水平。第30周將空腹過夜的所有大鼠處死，收集血漿和組織，分別存儲于-80℃冰箱和液氮罐中。

1.2.2血清生化學(xué)指標(biāo)檢測 30周末，大鼠禁食12 h，內(nèi)眥靜脈取血，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測空腹血漿葡萄糖(FBG)，甘油三酯(TG)，血漿總膽固醇(TC)，高密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，總膽汁酸(TBAs)。ELISA試劑盒檢測血漿胰島素(FINS)。

1.2.3肝臟組織HE染色 隨機(jī)抽取各組10只大鼠肝臟組織，固定于4%多聚甲醛，后石蠟包埋切片(片厚4 μm)，60℃烤箱脫蠟置水，切片放入Harris蘇木素染3～8 min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，6%氨水反藍(lán)，流水沖洗，尹紅染色1～3 min，脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.2.4.1肝臟組織RNA的提取 取液氮中各組肝臟組織約30 mg，放入高壓過的EP管中剪碎，加入1 ml Trizol，將組織吸入研磨棒，研磨30 min，全程在冰上進(jìn)行。4℃ 12 000 r/min離心15 min取上清，加入200 ml氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置2～3 min。4℃ 12 000 r/min離心15 min取上層無色水相(約400 ml)轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，在得到的無色水相中加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min。4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入75%乙醇洗滌沉淀。4℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清，得到的白色沉淀為RNA，加入50～80 ml的去離子水使RNA充分溶解，用RNA濃度檢測儀測量RNA濃度，放入-80℃冰箱保存。RNA純度=A260/A280=1.8～2.0。

1.2.4.2反轉(zhuǎn)錄 用TaKaRa兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提組織RNA樣品反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μl，合成的cDNA稀釋一倍，-20冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3熒光PCR反應(yīng) 以cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參，用Applied Biosystems 7500進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。引物由濟(jì)南生工公司設(shè)計(jì)，見表1。反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件：第一步預(yù)變性95℃ 30 s，第二步PCR反應(yīng)95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40循環(huán)，第三步解離階段95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃15 s。PCR結(jié)果采用CT值相對定量法。

1.3數(shù)據(jù)分析 選用GraphPad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

表1 肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA 引物序列

2 結(jié) 果

2.1二甲雙胍對糖尿病大鼠飲食、飲水、體重變化的影響 STZ注射后DM組每天飲水、飲食與CON組比較增多，體重減少(Plt;0.05)；DM+MET組每天飲食、飲水與CON組比較有所增加，體重減少，但與DM組比較飲食、飲水明顯降低，體重明顯下降(均Plt;0.05)，見表2。

表2 STZ注射后各組大鼠每天飲食、飲水、體重的變化

與CON組比較:1)Plt;0.05；與DM組比較:2)Plt;0.05

2.2二甲雙胍對糖尿病大鼠血糖、血脂、TBAs水平變化的影響 與CON組比較，30周末DM組體重明顯降低(Plt;0.05)，F(xiàn)BG、FINS、TG、TC、LDL-C、TBAs增加(均Plt;0.05)。與DM組比較，30周末DM+MET組體重、FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、TBAs降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均Plt;0.05)，見表3。

2.3二甲雙胍對糖尿病大鼠肝臟形態(tài)的影響 各組大鼠隨機(jī)抽取10只進(jìn)行HE染色，二甲雙胍減少了大鼠肝臟脂質(zhì)的沉積，改善肝臟細(xì)胞形態(tài)。見圖1，顯微鏡下觀察，與CON比較，DM組肝臟脂肪空泡大而密集導(dǎo)致肝細(xì)胞形態(tài)改變；與DM組比較，DM+MET組肝臟脂肪空泡明顯減少，肝細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常。

表3 30 w末各組大鼠血糖、血脂、TBAs、胰島素代謝情況表

與CON組比較：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01；與DM組比較：3)Plt;0.05

圖1 各組肝臟組織形態(tài)學(xué)變化(HE，×400)

2.4二甲雙胍對糖尿病大鼠SREBP-2等基因表達(dá)的影響 與CON組比較，DM組CYP7a1 mRNA表達(dá)上調(diào)(Plt;0.05)，SREBP-2(Plt;0.01)、HMGR(Plt;0.05)、LDLR(Plt;0.01)、FXR mRNA表達(dá)下調(diào)(Plt;0.01)。與DM組比較，DM+MET組SREBP-2、HMGR、LDLR 、CYP7a1 mRNA(Plt;0.001)表達(dá)明顯上調(diào)。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠膽固醇水平升高，負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制使SREBP-2表達(dá)降低〔7〕。細(xì)胞內(nèi)高膽固醇水平，INSIG結(jié)合在SCAP敏感區(qū)，使SCAP/SREBP-2復(fù)合物滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，SREBP-2不能進(jìn)入高爾基體進(jìn)行裂解，nSREBP-2表達(dá)降低，HMGR合成下降，減少膽固醇合成，同時(shí)LDLR合成也減少使肝細(xì)胞對血漿中膽固醇的吸收下降，導(dǎo)致糖尿病大鼠膽固醇代謝紊亂。而二甲雙胍治療后，SREBP-2及目標(biāo)基因HMGR、LDLR轉(zhuǎn)錄增多，可能由于二甲雙胍使肝細(xì)胞膽固醇水平降低，INSIG從復(fù)合體釋放出來，SCAP護(hù)送SREBP-2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體裂解釋放出nSREBP-2，同時(shí)nSREBP2增多可激活靶基因HMGR和LDLR，增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成和肝細(xì)胞對循環(huán)中膽固醇的吸收，增加膽固醇代謝，降低血漿膽固醇和低密度脂蛋白水平。

實(shí)驗(yàn)證明糖尿病大鼠體內(nèi)膽汁酸池組成發(fā)生改變，池中次級膽汁酸脫氧膽酸(DCA)升高，而鵝脫氧膽酸(CDCA)降低，CDCA是最有效地激活FXR的膽汁酸，因此糖尿病大鼠FXR表達(dá)降低〔8〕。二甲雙胍治療組CYP7a1 mRNA明顯增高，其機(jī)制一方面可能通過激活A(yù)MPK途徑使FXR磷酸化，F(xiàn)XR表達(dá)降低，CYP7a1 mRNA表達(dá)升高，另一方面前期有研究證明二甲雙胍治療組腸道FGF19表達(dá)降低，促進(jìn)肝臟CYP7a1 mRNA表達(dá)〔9〕，血漿膽汁酸水平增加，且二甲雙胍增加膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)和糞膽汁酸排泄加速體內(nèi)膽固醇代謝，從而降低膽固醇水平。二甲雙胍一方面可能通過上調(diào)2型糖尿病大鼠SREBP-2基因的表達(dá)，使LDLR mRNA上調(diào)增加膽固醇合成和代謝，另一方面通過上調(diào)CYP7a1 mRNA，增加膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，加速膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄。二甲雙胍可能通過協(xié)調(diào)體內(nèi)膽固醇的合成與轉(zhuǎn)化途徑，使體內(nèi)膽固醇水平恢復(fù)正常，改善膽固醇和膽汁酸代謝。此外，二甲雙胍是否在細(xì)胞水平和蛋白水平對SREBP-2及CYP7a1 mRNA產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步研究。

1Martin-Montalvo A.Metformin improves healthspan and lifespan in mice〔J〕.Nat Commun，2013；4：2192.

2Fujita Y,Inagaki N.Metformin：new preparations and nonglycemic benefits〔J〕.Curr Diabetes Rep，2017；17(1)：5.

3Hua X.SREBP-2，a second basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that stimulates transcription by binding to a sterol regulatory element〔J〕.Proc Nat Acad Sci U S A，1993；90(24)：11603.

4Horton JD，Goldstein JL，Brown MS.SREBPs：activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver〔J〕.J Clin Invest，2002；109(9)：1125-31.

5陳佩佩,馬坤嶺.低密度脂蛋白受體表達(dá)失調(diào)在靶器官損害中作用的研究進(jìn)展〔J〕.東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2016；35(4)：606-12.

6Yap F，Craddock L，Yang J.Mechanism of AMPK suppression of LXR-dependent Srebp-1c transcription〔J〕.Int J Biol Sci，2011；7(5)：645-50.

7Pozzo L.Effect of HFD/STZ on expression of genes involved in lipid，cholesterol and glucose metabolism in rats〔J〕.Life Sci，2016;166(1)：149-56.

8Watanabe M.Lowering bile acid pool size with a synthetic farnesoid x receptor (FXR) agonist induces obesity and diabetes through reduced energy expenditure〔J〕.J Biol Chem，2011;286(30)：26913.

9Wang Y.The effects of metformin on fibroblast growth factor 19，21 and fibroblast growth factor receptor 1 in high-fat diet and streptozotocin induced diabetic rats〔J〕.Endocr J，2017;64(5)：543-52.

〔2016-09-17修回〕

(編輯 徐 杰)

R587.1

A

1005-9202(2017)21-5238-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.009

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016GSF201019)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2012GSF11803);濟(jì)南市國際合作計(jì)劃(201011008)

1 山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科

逄曙光(1966-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病和膽汁酸代謝的基礎(chǔ)和臨床研究。

張春雪(1989-)，女，在讀碩士，主要從事糖尿病和膽汁酸代謝的基礎(chǔ)及臨床研究。