陳 瑋 萬紹勇 王 煒 龍曉東 陶干臣

(江西中醫(yī)藥大學(xué)體育教學(xué)部，江西 南昌 330004)

游泳耐力運(yùn)動對小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1信號通路的影響

陳 瑋 萬紹勇1王 煒1龍曉東1陶干臣1

(江西中醫(yī)藥大學(xué)體育教學(xué)部，江西 南昌 330004)

目的探討游泳耐力運(yùn)動對小鼠骨骼肌腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶(SIRT)1信號通路的影響。方法選取SPF級雄性小鼠24只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和模型組各12只。采用皮下注射5 mg/kg的地塞米松磷酸鈉注射液建造肌肉衰減綜合征小鼠模型，每天0.1 ml/10 g，連續(xù)注射6 w。建模成功后再根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將對照組分為正常對照組和耐力運(yùn)動對照組各6只，模型組分為正常模型組和耐力運(yùn)動模型組各6只，耐力運(yùn)動對照組和耐力運(yùn)動模型組進(jìn)行相應(yīng)的游泳耐力運(yùn)動訓(xùn)練。評價(jià)模型組小鼠建模情況。對比小鼠骨骼肌中AMPK mRNA、AMPK蛋白和SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果模型組小鼠建模成功，小鼠跑臺掉下次數(shù)顯著多于對照組，游泳速度和筋肉含量顯著低于對照組(Plt;0.05)。耐力運(yùn)動模型組小鼠的AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA、SIRT1 mRNA均顯著高于正常對照組、耐力運(yùn)動對照組、正常模型組(Plt;0.05)，耐力運(yùn)動對照組AMPKα2 mRNA高于正常對照組和正常模型組(Plt;0.05)。耐力運(yùn)動對照組和耐力運(yùn)動模型組AMPK蛋白均顯著高于正常對照組和正常模型組(Plt;0.05)。結(jié)論肌肉衰減綜合征小鼠筋肉含量減少，運(yùn)動能力下降，同時游泳耐力訓(xùn)練可增加肌肉衰減綜合征小鼠的AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA、SIRT1 mRNA水平，同時增加AMPK蛋白水平，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

游泳耐力運(yùn)動；骨骼肌；腺苷酸活化蛋白激酶；沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1

肌肉衰減綜合征是伴隨著年齡增長而出現(xiàn)的進(jìn)行性骨骼肌量減少、伴有肌肉力量和(或)肌肉功能減退的綜合征，以骨骼肌細(xì)胞體積和數(shù)量減少、結(jié)締組織和脂肪增多為主要特征，患者表現(xiàn)為軀體功能下降、虛弱及不同程度殘疾〔1〕。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示〔2〕，肌肉衰減綜合征的多發(fā)群體為60歲以上的老年人，當(dāng)年齡gt;80歲后發(fā)病率將逐漸增加，部分地域可達(dá)50%。老年人肌肉衰減綜合征除引起骨骼肌量減少，力量減弱，運(yùn)動和平衡能力下降，跌倒風(fēng)險(xiǎn)增加外，還更容易患上糖尿病、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、心臟病等疾病。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)具有調(diào)節(jié)脂肪、蛋白質(zhì)和糖代謝的作用，能維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)〔3〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶(SIRT)1是一種與細(xì)胞生長周期調(diào)節(jié)、胰島素分泌、 能量代謝、細(xì)胞衰老等密切相關(guān)的去乙?；?，是機(jī)體內(nèi)重要的能量代謝感受器〔4〕。本研究通過對照實(shí)驗(yàn)來探討游泳耐力運(yùn)動對小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取SPF級雄性小鼠24只，體重27.8～33.4 g，平均(30.4±2.1)g。飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在20℃～25℃，濕度控制在55%左右，每天給予12 h光照，保持通風(fēng)，分4籠喂養(yǎng)，每籠6只，正常喂養(yǎng)1 w，期間所有小鼠均自由飲食、飲水。實(shí)驗(yàn)小鼠購于南京君科生物工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器和藥品 地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，氯仿、異丙醇(天津市華東試劑廠)，焦碳酸二乙酯、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、一抗、二抗(上海翊圣生物科技有限公司)，裂解液、超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒、Tris鹽酸緩沖液(TBST，上海優(yōu)寧維生物科技公司)。

1.3分組方法和模型建造 在正常飼養(yǎng)1 w后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只小鼠隨機(jī)分為對照組(12只)和模型組(12只)。其中對照組小鼠分組后繼續(xù)正常飲食6 w，不做其他特殊處理。模型組小鼠建模方式如下〔5〕：每天給予皮下注射5 mg/kg的地塞米松磷酸鈉注射液，0.1 ml/10 g，連續(xù)注射6 w。6 w后再根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將對照組分為正常對照組(6只)和耐力運(yùn)動對照組(6只)，模型組分為正常模型組(6只)和耐力運(yùn)動模型組(6只)。其中耐力運(yùn)動對照組和耐力運(yùn)動模型組均進(jìn)行游泳耐力運(yùn)動，無負(fù)重，每天訓(xùn)練1 h，每周訓(xùn)練5 d(訓(xùn)練5 d后休息2 d)，共訓(xùn)練6 w，期間正常飲食、飲水。正常對照組和正常模型組不做任何訓(xùn)練，期間正常飲食、飲水。

1.4模型評定標(biāo)準(zhǔn) 在模型組小鼠建模結(jié)束后對所有小鼠進(jìn)行游泳測試和輪式跑臺測試，對比對照組和模型組小鼠的游泳速度和從跑臺掉下的次數(shù)。同時使用小動物體成分分析儀檢測所有小鼠的筋肉含量。若建模小鼠的游泳速度、掉下次數(shù)和筋肉含量與正常小鼠相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異則提示建模成功。同時觀察所有小鼠的毛發(fā)、精神狀態(tài)、反應(yīng)速度、食欲等情況。

1.5mRNA和蛋白的測定方法 在耐力運(yùn)動對照組和耐力運(yùn)動模型組小鼠末次訓(xùn)練結(jié)束后，所有小鼠禁食12 h后處死，將骨骼肌組織分離，裝于標(biāo)記好的試管中，置入液氮中速凍，后置于-80℃的環(huán)境中保存。采用實(shí)時定量熒光PCR(Real-Time PCR)法檢測AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA和SIRT1 mRNA的水平。先取部分骨骼肌組織進(jìn)行研磨，加入Trizol試劑1 ml，震蕩搖勻，在4℃下12 000 r/min離心15 min。取其上清液，加入氯仿200 μl，震蕩搖勻，直至呈現(xiàn)乳白色，4℃ 12 000 r/min離心15 min， 取其上清液，加入500 μl異丙醇，震蕩搖勻，置于0℃ 20 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min。將上清液舍去，加入75%乙醇1 ml，4℃ 12 000 r/min離心15 min，重復(fù)一次此步驟。將上清液舍去，于室溫中靜置5～7 min。加入焦碳酸二乙酯20～30 μl，65℃水浴10 min。PCR引物序列分別為AMPKα1 mRNA上游引物：ACCTGACTCTTTCCTGGACG，下游引物：AATGCCATTTTGCCTTCCGT；AMPKα2 mRNA上游引物：CGCCTCTAGTCCTCCATCAG，下游引物：TTGGGCTTCGTTGTGTTGAG；SIRT1 mRNA上游引物：ACAGTGAGAAAATGCTGGC，下游引物：GCCACTGTCACTGTTACTGC。取部分骨骼肌組織進(jìn)行研磨，加入裂解液0.35 ml，震蕩搖勻，12 000 r/min離心20 min，取其上清液，加入適量BCA工作液，于37℃下干燥30 min。進(jìn)行凝膠電泳，后轉(zhuǎn)移于聚偏二氟乙烯膜上，10%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋好的一抗，4℃孵育過夜。后加入稀釋好的二抗，室溫孵育二抗1 h，采用TBST緩沖液充分洗滌，后使用超敏ECL試劑盒顯影，膠片曝光，掃描定量各信號條帶的相對灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1建模情況 模型組小鼠的跑臺掉下次數(shù)顯著多于對照組，游泳速度和筋肉含量顯著低于對照組(Plt;0.05)，說明模型組小鼠建模成功。對照組小鼠毛發(fā)有關(guān)澤，精神狀態(tài)良好，運(yùn)動較多，食欲較強(qiáng)，對外界刺激反應(yīng)較快，無異常死亡。模型組大鼠毛發(fā)雜亂且光澤差，精神狀態(tài)較差，較少運(yùn)動，食欲減退，對外界刺激反應(yīng)較慢，無異常死亡。見表1。

2.2小鼠骨骼肌中AMPK mRNA和AMPK蛋白表達(dá)情況對比 見表2。耐力運(yùn)動模型組小鼠AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA均顯著高于正常對照組、耐力運(yùn)動對照組、正常模型組(Plt;0.05)，

表1 對照組和模型組小鼠游泳速度、跑臺掉下次數(shù)和筋肉含量比較

表2 小鼠骨骼肌中AMPK mRNA和AMPK蛋白表達(dá)比較

與正常對照組比較：1)Plt;0.05；與耐力運(yùn)動對照組比較：2)Plt;0.05；與正常模型組比較：3)Plt;0.05，下表同

耐力運(yùn)動對照組AMPKα2 mRNA高于正常對照組和正常模型組(Plt;0.05)。耐力運(yùn)動對照組和耐力運(yùn)動模型組的AMPK蛋白均顯著高于正常對照組和正常模型組(Plt;0.05)。

2.3小鼠骨骼肌中SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白表達(dá)對比 耐力運(yùn)動模型組小鼠SIRT1 mRNA顯著高于正常對照組、耐力運(yùn)動對照組、正常模型組(Plt;0.05)，4組SIRT1蛋白水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。見表3。

表3 小鼠骨骼肌中SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白表達(dá)比較

3 討 論

肌肉衰減綜合征的具體發(fā)病過程復(fù)雜多變，細(xì)胞凋亡、內(nèi)分泌因素、蛋白質(zhì)合成減少、營養(yǎng)不良、炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙等均可能涉及其中。運(yùn)動和合理飲食是防治肌肉衰減綜合征的有效手段，在每天攝入的食物中要注重營養(yǎng)均衡，特別是要加強(qiáng)蛋白質(zhì)的攝入，同時適當(dāng)進(jìn)行簡單的抗阻力運(yùn)動和耐力訓(xùn)練，可有效延緩肌肉衰減綜合征的發(fā)生〔6〕。AMPK、SIRT1是機(jī)體內(nèi)重要的能量代謝感受器,可感知體內(nèi)的能量代謝狀態(tài),并通過調(diào)控下游分子的基因表達(dá)或活性來對機(jī)體能量代謝過程進(jìn)行調(diào)節(jié)〔7〕。有氧運(yùn)動可直接對骨骼肌造成良性影響，可以增加骨骼肌有氧代謝酶類濃度，提高骨骼肌利用糖、脂肪的代謝能力，同時提高脂肪供能的比例，有氧運(yùn)動還可以使得肌細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量和體積得到增加。通過運(yùn)動可激活骨骼肌AMPK/SIRT1信號通路，提升線粒體氧化能力和生物合成能力提，進(jìn)而改善骨骼肌肌肉質(zhì)量〔8〕。

本研究結(jié)果提示模型組小鼠建模成功，同時患有肌肉衰減綜合征的小鼠筋肉含量下降，運(yùn)動能力減退，進(jìn)而對身體各項(xiàng)機(jī)能造成影響，包括食欲減退、營養(yǎng)不良、反應(yīng)速度變慢等。另外說明游泳耐力運(yùn)動可以提升小鼠骨骼肌AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA、SIRT1 mRNA的水平，同時可以提高小鼠骨骼肌AMPK蛋白水平。AMPK在真核細(xì)胞生物中廣泛存在,能感知細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的改變,并通過影響細(xì)胞物質(zhì)代謝的多個環(huán)節(jié)維持細(xì)胞能量供求平衡〔9〕。SIRT1與細(xì)胞的能量代謝同樣存在著密切的關(guān)系，當(dāng)熱量限制時，SIRT1水平升高,進(jìn)而延長生物體的衰老過程〔10〕。研究表明〔11〕，AMPK與SIRT1可能存在著內(nèi)在聯(lián)系,從而在調(diào)節(jié)能量代謝過程中起著重要的調(diào)控作用。AMPK是一種異源三聚體蛋白，有AMPKα、AMPKβ、AMPKγ 3個亞型，其中AMPKα又可分為AMPKα1、AMPKα2，骨骼肌纖維中以AMPKα2為主要表現(xiàn)形式。當(dāng)小鼠在進(jìn)行游泳耐力運(yùn)動時，AMPK可受到多種信號通路的刺激，同時絲氨酸-蘇氨酸激酶11可激活A(yù)MPK，肌纖維收縮時可促進(jìn)鈣離子釋放，均能使AMPK表達(dá)增加，此外AMPK可激活SIRT1，提高SIRT1活性〔12〕。有研究結(jié)果顯示〔13〕，骨骼肌的衰老與線粒體的數(shù)量和活性存在相關(guān)性，小鼠在進(jìn)行游泳耐力運(yùn)動時需要消耗大量腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，這就需要提升線粒體的數(shù)量和活性，在運(yùn)動時機(jī)體應(yīng)激激活骨骼肌AMPK/SIRT1信號通路，促進(jìn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子(PGC)-1α表達(dá)，同時提高PGC-1α的活性，提升線粒體的氧化磷酸化功能，進(jìn)而增加ATP的合成，滿足機(jī)體的供能需求。

1熊偉平,夏 志.有氧運(yùn)動促進(jìn)老年前期小鼠快縮型骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝的研究〔J〕.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2016;31(12):1311-7.

2韓佩佩,郭 琪,潘 翔,等.老年人肌肉衰減綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)與運(yùn)動療法〔J〕.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2015;30(3):290-4.

3Hu M,Liu B.Retraction notice to:resveratrol attenuates lipopolysaccharide-induced dysfunction of blood-brain barrier in endothelial cells via AMPK activation〔J〕.Korean J Physiol Pharmacol,2017;21(2):277.

4周 蓉,王奇敏,張 成,等.大鼠腦干在不同低氧狀態(tài)下沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1水平檢測及其意義〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志,2014;37(5):352-5.

5魯飛翔,李 軍,周仙杰,等.地塞米松致小鼠肌肉衰減綜合征模型建立〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2016;36(22):5542-4.

6黃金賢,羅佳妮,劉培慶,等.AMPK/PPARα/SCAD信號途徑對心肌肥大的調(diào)控研究〔J〕.中國病理生理雜志,2014;30(5):769-78.

7金 鑫,張會欣,張彥芬,等.津力達(dá)對高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗ApoE-/-小鼠骨骼肌甘油三酯相關(guān)酶的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào),2015;23(1):69-74.

8楊 艷.補(bǔ)充白刺多糖聯(lián)合有氧運(yùn)動對衰老大鼠心肌和骨骼肌的保護(hù)作用〔J〕.西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016;41(9):11-6.

9張 坦,崔 迪,張 喆,等.游泳運(yùn)動對糖尿病小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1/NF-κB炎癥信號通路的影響〔J〕.體育科學(xué),2016;36(9):40-7.

10Lin N,Li XY,Zhang HM,etal.microRNA-199a-5p mediates high glucose-induced reactive oxygen species production and apoptosis in INS-1 pancreatic β-cells by targeting SIRT1〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2017;21(5):1091-8.

11李 格,張 纓.低氧訓(xùn)練誘導(dǎo)AMPK對小鼠骨骼肌PPARα表達(dá)的影響〔J〕.山東體育學(xué)院學(xué)報(bào),2013;29(5):40-6.

12Han JY,Lee S,Yang JH,etal.Korean red ginseng attenuates ethanol-induced steatosis and oxidative stress via AMPK/Sirt1 activation〔J〕.J Ginseng Res,2015;39(2):105-15.

13趙永才.運(yùn)動干預(yù)骨骼肌、心肌線粒體動力學(xué)研究現(xiàn)狀——心肌線粒體動力學(xué)研究展望〔J〕.體育科學(xué),2016;36(11):75-81,96.

〔2017-03-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R39

A

1005-9202(2017)21-5231-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.006

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)青年項(xiàng)目(No.GJJ160754)

1 井岡山大學(xué)體育學(xué)院

萬紹勇(1981-)，男，碩士，副教授，主要從事運(yùn)動訓(xùn)練與康復(fù)研究。

陳 瑋(1981-)，男，碩士，講師，主要從事運(yùn)動訓(xùn)練與康復(fù)研究。